張祥建，張欣欣，馬海廣，胡曉清

（1.溫州市中心醫(yī)院 腫瘤外科，浙江 溫州 325000；2.溫州醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院 婦科，浙江 溫州325027）

乳腺癌是嚴重危害女性健康的最常見的惡性腫瘤，其發(fā)病率逐年上升[1]。盡管基于分子分型的乳腺癌的個體化綜合治療提高了乳腺癌的療效，但腫瘤的原發(fā)或繼發(fā)耐藥、遠處轉(zhuǎn)移仍是治療失敗的最主要原因。目前中藥在乳腺癌的治療中得到了廣泛的應(yīng)用，包括化療減毒、增強免疫、抑制轉(zhuǎn)移等[2-4]。也有部分臨床研究顯示中藥與化療的聯(lián)合應(yīng)用，其除了化療減毒外，還可以逆轉(zhuǎn)腫瘤耐藥[5-6]。然而，其具體作用機制仍缺乏科學(xué)的理論依據(jù)，同時，中藥對腫瘤的治療和逆轉(zhuǎn)耐藥作用是否具有一定的腫瘤組織特異性亦缺乏基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。因此，本研究從TLR4/NF-κB信號通路的角度，探討扶正中藥抗乳腺癌的機制，及增加化療藥物敏感性的干預(yù)靶點，從而為特定的腫瘤表型及靶點進行中西醫(yī)結(jié)合的藥物治療提供依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 藥品與試劑：扶正中藥（黃芪30 g、黨參12 g、白術(shù)9 g、茯苓12 g、仙靈脾15 g、肉蓯蓉12 g、山萸肉12 g、巴戟天12 g）制成凍干粉，溶于雙蒸水中，經(jīng)0.2 μm孔徑針式過濾器過濾后使用。DMEM、MEM培養(yǎng)基、胎牛血清、胰蛋白酶、PBS均購自美國Gibco公司；紫杉醇（paclitaxel，PTX）購自美國Medchem Express公司；MTT、DMSO、碘化丙啶（PI）、牛胰島素均購自美國Sigma公司；Annexin V/PI試劑盒購自美國Beckman Coulter公司；β-actin抗體及二抗購自上?？党缮锟萍加邢薰尽?/p>

1.1.2 儀器：恒溫CO2細胞培育箱（美國Thermo Forma公司）；低溫高速離心機（日本Kubota公司），Synergy2酶標儀（美國Biotek公司）；流式細胞儀（美國Beckman Coulter公司）；Odyssey雙色紅外激光掃描成像系統(tǒng)（美國Licor公司）。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養(yǎng)：MDA-MB-231、T47D人乳腺癌細胞購于中國科學(xué)院上海生命科學(xué)研究院細胞庫。在含10%胎牛血清、0.01%牛胰島素、100 U/L青霉素和10 mg/mL鏈霉素的MEM高糖培養(yǎng)基中培養(yǎng)MDAMB-231細胞，在含10%胎牛血清、0.01%牛胰島素、100 U/L青霉素和10 mg/mL鏈霉素的DMEM高糖培養(yǎng)基中培養(yǎng)T47D細胞，37 ℃、5% CO2恒溫?zé)o菌養(yǎng)育箱中生長，每2 d觀察貼壁情況并換液。待細胞生長至80%～90%時，0.25%胰酶消化后按比例傳代。選取對數(shù)生長期的MDA-MB-231、T47D人乳腺癌細胞進行實驗。

1.2.2 細胞增殖檢測：MTT法觀察細胞增殖情況，將人乳腺癌細胞株MDA-MB-231、T47D細胞接種于96孔板（1×104個細胞/孔），培養(yǎng)24 h至細胞貼壁后，更換培養(yǎng)液，分別運用1、2、4、8、16、32、64、128 mg/mL益氣扶正中藥（復(fù)方）干預(yù)細胞48 h，每一濃度做3個復(fù)孔，同時設(shè)陰性對照孔（只含細胞、培養(yǎng)液）；配置0.5% MTT溶液，每孔加20 μL，37 ℃溫育4 h后棄上清液，加入DMSO（150 μL/孔），震蕩10 min使其充分溶解后，用全自動酶標儀于波長490 nm處測得各孔OD值，檢測量效關(guān)系。計算復(fù)方藥物對細胞生長的抑制率，并繪制效應(yīng)曲線，同樣的實驗重復(fù)3次。細胞生存率（%）=（OD藥物組-OD空白對照）/（OD藥物組-OD空白對照）×100%。用SPSS22.0軟件擬合估計IC50值。同樣的方法，運用10、20、40、80、160、320、640 nmol/mL PTX干預(yù)細胞48 h，觀察其對細胞增殖的抑制作用，計算IC50值。用64 mg/mL的扶正中藥與PTX 160 nmol/mL單獨及聯(lián)合干預(yù)MDA-MB-231、T47D乳腺癌細胞48 h再次檢測細胞存活率。

1.2.3 細胞凋亡檢測：用64 mg/mL的扶正中藥與PTX 160 nmol/mL單獨及聯(lián)合干預(yù)MDA-MB-231、T47D乳腺癌細胞，48 h后收集各藥物干預(yù)后的細胞，胰酶消化，1 000 r/min離心2 min，吸除上清液，PBS洗滌2遍，再次1 000 r/min離心2 min后提取細胞，加70%冰乙醇固定，4 ℃靜置過夜。取出固定的標本，1 500 r/min離心5 min，棄去上清，加PBS洗滌細胞2遍，1 500 r/min離心5 min，PBS洗2遍。參照Annexin-v/PI細胞凋亡檢測試劑盒方法實驗，使用流式細胞儀檢測細胞凋亡率。

1.2.4 Western blot：提取各實驗組蛋白（64 mg/mL的扶正中藥與PTX 160 nmol/mL單獨及聯(lián)合干預(yù)MDA-MB-231、T47D乳腺癌細胞48 h），Bradford法定量后制備樣品，Western blot法檢測Bcl-2、Bcl-xL、Bax及Cleaved caspase 3 蛋白的表達，β-actin作為內(nèi)參。將等量蛋白樣品進行SDS-PAGE常規(guī)電泳、轉(zhuǎn)膜，用含5%脫脂牛奶的TBST封閉1 h后，棄去封閉液，加入一抗，封入雜交袋內(nèi)，4 ℃搖蕩過夜。PBST清洗3次后，加入熒光二抗（1:10 000稀釋），避光培育1 h，PBST洗滌3次，加入化學(xué)底物助其顯影、Odyssey紅外熒光掃描成像系統(tǒng)讀膜，分析各條帶灰度值。ImageJ軟件讀取各條帶灰度值。

另制備實驗組蛋白（64 mg/mL的扶正中藥與PTX 160 nmol/mL單獨及聯(lián)合干預(yù)MDA-MB-231、T47D乳腺癌細胞48 h），同法檢測TLR4、p-lκBα、NF-κB及β-actin蛋白，β-actin作為內(nèi)參。

1.3 統(tǒng)計學(xué)處理方法 應(yīng)用SPSS22.0軟件對數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析，以上實驗重復(fù)3次。計量資料以s表示，多組比較采用單因素方差分析。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 扶正中藥與PTX對細胞增殖的影響 不同濃度扶正中藥干預(yù)乳腺癌細胞株MDA-MB-231、T47D，結(jié)果顯示扶正中藥對人乳腺癌細胞株的生長抑制作用較弱，當(dāng)濃度達128 mg/mL時，細胞存活率約為80%，未達到IC50值，見圖1A。PTX為乳腺癌經(jīng)典化療藥物，經(jīng)MTT實驗證實，PTX對MDA-MB-231、T47D細胞株均有增殖抑制作用，但相同濃度（80、160、320、640 nmol/mL）的PTX對MDA-MB-231細胞株的殺傷作用弱于T47D細胞株，如當(dāng)濃度達到160 nmol/L時，T47D細胞株的存活率約為44%，而MDA-MB-231細胞株的存活率約為75%，表現(xiàn)為耐藥，見圖1B。扶正中藥與PTX在處理MDA-MB-231細胞株時有協(xié)同作用。當(dāng)160 nmol/L PTX聯(lián)合64 mg/mL的扶正中藥時，對T47D細胞株的殺傷效果沒有得到加強，而當(dāng)作用于MDA-MB-231細胞株時，PTX的細胞殺傷作用得到加強，達到與T47D細胞株相同的抑制效果。見圖1C。

圖1 扶正中藥及PTX對T47D和MDA-MB-231細胞株細胞存活率的影響

2.2 扶正中藥與PTX誘導(dǎo)細胞凋亡 扶正中藥和PTX合用48 h對T47D細胞株聯(lián)合作用并不明顯，MDAMB-231細胞株中，凋亡率從23%增加到42%（P＜0.05），接近T47D細胞株P(guān)TX單藥所致的凋亡率46%。見圖2。在MDA-MB-231細胞株中Bax和Cleaved caspase 3蛋白經(jīng)兩藥聯(lián)用后較單純用PTX表達增加（P＜0.05），而Bcl-2、Bcl-xL經(jīng)兩藥聯(lián)用后表達減少（P ＜0.05）；而在T47D細胞株中兩藥聯(lián)用相較于單藥PTX并未改變Bcl-2、Bcl-xL、Bax及Cleaved caspase 3蛋白的表達，見圖3。

2.3 扶正中藥通過TLR4/NF-κB信號通路增加PTX抗乳腺癌活性 Western blot檢測MDA-MB-231及T47D細胞株的TLR4的表達，結(jié)果顯示MDA- MB-231細胞株表達TLR4蛋白，而T47D細胞基本不表達TLR4蛋白。聯(lián)用扶正中藥與PTX相較于單用PTX，MDA-MB-231細胞株中TLR4、p-lκBα、NF-κB蛋白表達減少（P＜0.05），意味著TLR4/NF-κB信號通路的抑制。而T47D細胞株中并未看到TLR4、p-lκBα、NF-κB蛋白表達的改變。見圖4。

3 討論

Toll樣受體（Toll-like receptors，TLRs）屬于I型跨膜糖蛋白家族，廣泛分布于免疫細胞以及上皮細胞表面。人細胞表達10種TLRs亞型，其中以TLR4的腫瘤表達譜最為廣泛，與腫瘤關(guān)系最為密切[7]。有研究表明人乳腺癌組織TLR4高表達，促進乳腺癌細胞的增殖[8]。TLR4/NF-κB信號通路的異常激活不僅與乳腺癌發(fā)生、發(fā)展、轉(zhuǎn)移密切相關(guān)，還與腫瘤的化療耐藥有關(guān)。

PTX目前已成為卵巢癌、肺癌、乳腺癌等多種常見惡性腫瘤的一線用藥。PTX以細胞內(nèi)的微管蛋白為作用靶點，將細胞周期阻斷于G2/M期并誘導(dǎo)凋亡信號的激活，從而阻斷細胞分裂、阻止腫瘤細胞的增殖，發(fā)揮抗腫瘤作用。近年來研究顯示，PTX除了通過微管改變促進腫瘤細胞凋亡之外，還可以通過激活TLR4 信號途徑誘導(dǎo)腫瘤細胞耐藥[9]。研究發(fā)現(xiàn)，在具有功能性TLR-MyD88通路的卵巢癌細胞（I型EOC細胞）中，用LPS或PTX活化TLR4信號，可使細胞存活的重要調(diào)節(jié)子xIAP（caspase-3和-9的主要抑制子）和磷酸化AKT的表達增加，促進了卵巢癌細胞生長和對藥物的抗性，且TLR4能夠介導(dǎo)PTX的黑色素瘤細胞耐藥[10]，據(jù)RAJPUT等[11]研究，多數(shù)乳腺癌臨床樣本和68%的乳腺癌細胞系中TLR4高表達，并且可能介導(dǎo)PTX誘導(dǎo)的乳腺癌化療耐藥。這與我們的研究相一致，TLR4高表達的MDA-MB-231細胞株表現(xiàn)為對PTX的耐藥，而不表達TLR4的T47D細胞株對PTX敏感。

圖2 扶正中藥促進PTX誘導(dǎo)MDA-MB-231細胞株的細胞凋亡

PTX在抗腫瘤的同時，可啟動TLR4/NF-κB信號通路的激活。TLR4可以識別多種配體，其中最主要的是來自革蘭氏陰性細菌細胞壁的LPS。目前認為PTX也是一種可被TLR4識別的非病原體相關(guān)分子模式（pathogen-associated molecular patterns，PAMP）分子。盡管PTX與LPS缺乏結(jié)構(gòu)相似性，但兩者均能與TLR4結(jié)合激活MyD88依懶性信號途徑，從而誘導(dǎo)腫瘤細胞釋放多種細胞因子或上調(diào)抗凋亡信號等一系列的效應(yīng)[12]。

中醫(yī)學(xué)認為，乳腺癌的發(fā)病機制為本虛標實，在應(yīng)用中醫(yī)方劑時，應(yīng)重視健脾益氣以輔助正氣，溫補肝腎以調(diào)攝沖任，同時兼顧理氣活血，散結(jié)解毒。臨床和基礎(chǔ)研究也發(fā)現(xiàn)中藥方劑如乳寧沖劑、乳癌術(shù)后方、乳寧II號等在防治乳腺癌復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移方面療效確切[13-16]。姜華等[17]也證實益氣活血復(fù)方可阻斷TLR4高表達，同時阻斷TLR4胞內(nèi)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的MyD88依懶性途徑，抑制下游NF-κB以及各種相關(guān)基因表達，從而減少內(nèi)皮細胞的損失以及各種炎癥反應(yīng)的發(fā)生。此外，扶正方劑中的主藥白術(shù)具有抗炎、抗腫瘤的作用[18]。在本研究中，我們探討了扶正中藥協(xié)助PTX抗乳腺癌的作用機制。我們發(fā)現(xiàn)對于TLR4高表達的MDA-MB-231細胞株，扶正中藥可協(xié)同PTX的抗癌作用，逆轉(zhuǎn)其對PTX的耐藥，達到TLR4不表達的T47D細胞株對PTX的敏感度。而在TLR4不表達的T47D細胞株中，扶正中藥并不能起到聯(lián)合增效的作用。

Bcl-2家族成員是細胞凋亡調(diào)節(jié)因子，其中Bcl-2、Bcl-xL和Bax是關(guān)鍵的表現(xiàn)細胞生存/凋亡特征的因子[19]?？辜毎蛲龀蓡TBcl-2、Bcl-xL能夠改變線粒體巰基的氧化還原狀態(tài)，封閉Bax在線粒體上形成的孔道的活性，使一些小分子不能自由通透，將凋亡蛋白前體Apaf-1等定位至線粒體膜上，使其不能發(fā)揮凋亡作用，最終抑制細胞凋亡。而Bax的增加會破壞Bcl-2、Bcl-xL等抗凋亡成員的活性，促進細胞凋亡[20]。caspase 3是細胞凋亡通路下游的執(zhí)行者，Cleaved caspase 3是caspase 3的激活形態(tài)，使細胞發(fā)生生化及形態(tài)學(xué)改變，導(dǎo)致細胞凋亡[20]。在本研究中，我們發(fā)現(xiàn)PTX敏感細胞株T47D經(jīng)PTX處理后，Bcl-2、Bcl-xL蛋白表達減少，而Bax、Cleaved caspase 3蛋白表達增加，細胞凋亡增加。而扶正中藥單藥處理細胞株T47D后，細胞凋亡未見明顯增加，另與PTX聯(lián)用后，亦未看到增強效果。而細胞株MDA-MB-231經(jīng)PTX處理后，細胞凋亡有所增加，但未達到在細胞株T47D的程度，當(dāng)加用扶正中藥后，可看到Bcl-2、Bcl-xL蛋白表達進一步減少，Bax、Cleaved caspase 3蛋白表達進一步增加，提示扶正中藥在MDA-MB-231細胞株中可增加PTX誘導(dǎo)細胞凋亡的作用，這與流式細胞儀檢測細胞凋亡的結(jié)果相一致。

圖3 扶正中藥促進PTX對MDA-MB-231細胞株細胞凋亡蛋白表達的影響

圖4 扶正中藥通過TLR4/NF-κB信號通路增加PTX抗乳腺癌活性

鑒于PTX的耐藥與TLR4激活下游NF-κB通路相關(guān)，我們檢測了TLR4、p-lκBα、NF-κB蛋白的表達改變。可以看到，在MDA-MB-231細胞株中加用PTX后，TLR4、p-lκBα、NF-κB蛋白的表達增加，意味著TLR4/NF-κB信號通路的激活，從而對PTX產(chǎn)生耐藥。而當(dāng)聯(lián)用扶正中藥與PTX后，TLR4、p-lκBα、NF-κB蛋白的表達受到抑制，TLR4/NF-κB信號通路受到抑制，MDA-MB-231細胞株對PTX重新變得敏感。而在TLR4不表達的T47D細胞株，TLR4/NF-κB信號通路并未發(fā)生改變。

綜上所述，MDA-MB-231細胞株中，扶正中藥可以通過抑制TLR4/NF-κB信號通路增加細胞凋亡，從而增加PTX對MDA-MB-231乳腺癌細胞株的細胞增殖抑制作用，逆轉(zhuǎn)對PTX的耐藥。而TLR4 不表達的T47D細胞株，對PTX敏感，聯(lián)用扶正中藥后并不能抑制TLR4/NF-κB信號通路，不能增加細胞凋亡，也不能加強PTX的細胞增殖抑制作用。