吳其隆，蔡錦華，徐荷林，李慧，趙應征，陳斌

（1.溫州醫(yī)科大學附屬第一醫(yī)院 超聲科，浙江 溫州 325015；2.溫州醫(yī)科大學 藥學院，浙江 溫州325035）

多西他賽（docetaxel，DTX）是由歐洲漿果紫杉的針葉中提取的化合物半合成的紫杉醇衍生物。其作用機制是通過促進微管雙聚體裝配成微管，并且防止去多聚化過程而使微管穩(wěn)定，阻滯細胞于G2和M期，抑制細胞的進一步分裂，從而抑制癌細胞的有絲分裂和增殖[1-2]。其對于乳腺癌、卵巢癌、非小細胞肺癌、黑色素瘤、胃癌、胰腺癌、軟組織肉瘤均具有一定療效[3]。然而DTX存在水溶性差、脂溶性不強、體內循環(huán)時間短以及耐藥性等缺點，限制了其在臨床上的廣泛應用。目前臨床上使用的DTX注射液是添加了非離子表面活性劑，如乙醇和聚山梨酯80（吐溫80），而這些表面活性劑容易導致骨髓抑制、過敏反應、神經毒性以及溶血等不良反應[4-5]。為了克服以上不足，已有報道將DTX制成脂質體、納米粒、水凝膠、聚合物膠束等用于疾病的診斷和治療[6-9]。本研究以泊洛沙姆188（PL-188）為納米材料，因其在結構上是一種三嵌段的聚氧乙烯和聚氧丙烯共聚物（PEO-PPO-PEO），以中間的PO鏈為疏水嵌段，兩端的EO鏈為親水嵌段，該聚合物能自發(fā)組成納米膠束。同時，已有報道證實泊洛沙姆可以逆轉多種類型腫瘤的耐藥性，使一線化療藥物對耐藥腫瘤細胞的毒性增加2-3倍[10-11]。環(huán)狀c(RGDyk)短肽作為細胞整合素及其配體相互作用的識別位點，能與C6腦膠質瘤細胞以及人腦膠質瘤U87耐藥細胞上過表達的整合素αvβ3特異性結合[12-13]，提高化療藥物對腫瘤細胞的殺傷毒性。本實驗以PL-188為原材料制備羧基化PL-188，將c(RGDyk)與其鍵合，構建c(RGDyk)-PL-188靶向新材料。探索c(RGDyk)-PL-188自組裝形成膠束的能力以及其對DTX的包載性能，評價其對耐藥的人腦膠質瘤U87細胞的靶向性與抗腫瘤效果。

1 材料和儀器

1.1 材料 DTX購自上海龍翔生物醫(yī)藥開發(fā)有限公司；N-羥基琥珀酰亞胺（NHS）、1-乙基-（3-二甲基氨基丙基）碳二亞胺鹽酸鹽（EDC）購自上海阿拉丁公司；2-（2-甲氧基-4-硝苯基）-3-（4-硝苯基）-5-（2，4-二磺基苯）-2H-四唑單鈉鹽（CCK8）購自日本株式會社同仁化學研究所；c(RGDyk)環(huán)狀短肽購自上海吉爾生化有限公司；C6細胞購自中國科學院上海生命科學研究院生物化學與細胞生物學研究所；耐DTX的人腦膠質瘤U87細胞購自北京NTCC典型培養(yǎng)物保藏中心；DMEM培養(yǎng)基、RPMI1640培養(yǎng)液、胰酶、胎牛血清購自美國Gibco公司；PL-188、DAPI試劑盒購自美國Sigma公司。

1.2 儀器 FD-1C冷凍干燥機（北京德天佑有限公司），JEM-2100F透射電子顯微鏡（日本電子株式會社），SpectraMax M3酶標儀（美國Molecular Devices公司），馬爾文納米粒度電位儀Zetasizer Nano ZSP（英國Malvern公司），DSC差示掃描量熱儀（瑞士Mettler Toledo公司），Nikon正置熒光顯微鏡、Nikon倒置熒光顯微鏡（日本Nikon公司）。

2 方法

2.1 c(RGDyk)-PL-188 聚合物的合成與結構確證兩步法合成c(RGDyk)-PL-188聚合物：首先，合成羧基化PL-188，稱取9 g PL-188、0.54 g琥珀酸酐、0.27 g 4-二甲基氨基吡啶并量取0.5 mL三乙胺共溶于30 mL 1，4-二惡烷中，磁力攪拌使其完全溶解并在室溫下攪拌24 h。將混勻后的液體加入至透析袋內（透析膜截留相對分子質量為3 500 Da），用蒸餾水透析72 h，前24 h每隔6 h換水1 次，后48 h每隔12 h換水1次，以除去混合液中的有機溶劑，凍干獲得羧基化PL-188（CT-P188）粉末；其次，合成c(RGDyk)-PL-188聚合物，稱取0.1 g嗎啉乙磺酸（MES）溶解在10 mL蒸餾水中并攪拌10 min，向溶液中加入0.4 g EDC和0.2 g NHS攪拌直至完全溶解，加入0.3 g羧基化PL-188和0.02 g c(RGDyk)于室溫下磁力攪拌24 h，經透析和凍干獲得c(RGDyk)-PL-188聚合物粉末。

利 用FT-IR 和1H-NMR 對 羧 基 化PL-188 和c(RGDyk)-PL-188聚合物進行結構確證。FT-IR分析以KBr粉末壓片制樣，KBr空白片扣除背景，掃描范圍4 000～800 cm-1。分辨率為4 cm-1，譜峰讀數精度為0.01 cm-1。1H-NMR分析在Bruker AV-600核磁共振儀上完成，所有樣品經過DMSO-d6處理。

2.2 c(RGDyk)DTX-NPs的制備與篩選 采用納米沉淀法制備載DTX的靶向納米膠束[c(RGDyk)DTX-NPs]，稱取100 mg c(RGDyk)-PL-188和一定量的DTX，溶于3 mL乙腈中，磁力攪拌使其完全溶解，作為有機相；在劇烈攪拌下，將5 mL蒸餾水緩慢滴入有機相中（約30 min）并繼續(xù)攪拌30 min使其混合均勻。將混勻后的液體加入至透析袋內（透析膜截留相對分子質量為3 500 Da），用蒸餾水透析24 h，開始每隔2 h換水1次，后每9 h換水1次以除去混合液中的有機溶劑，5 000 r/min離心除去藥物沉淀，獲得上清液，即為載DTX納米膠束c(RGDyk)DTX-NPs。固定材料每次用量為100 mg，選取不同總投藥量（2、5、10、20 mg），以考察最大的載藥量和包封率。同樣，稱取100 mg PL-188和上述優(yōu)化后的DTX投藥量按照相同的方法制備DTX-NPs作為后續(xù)實驗的對照組。

2.3 載藥量及包封率的測定 高效液相色譜法（HPLC）測定藥物載藥量和包封率，量取500 μL c(RGDyk)DTX-NPs至5 mL容量瓶中，加入乙腈，超聲波破壞膠束，乙腈定容至刻度，0.45 μm微孔濾膜過濾，取續(xù)濾液，進樣量為20 μL，采用Agilent1200高效液相色譜儀測定。HPLC條件：XTerra RP18色譜柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流動相：乙腈/水（47：53，v/v）；流速1.0 mL/min，檢測波長為230 nm，柱溫25 ℃。通過以下公式計算載藥量及包封率。

2.4 c(RGDyk)DTX-NPs的表征 動態(tài)光散射激光粒度測定儀（dynamic light scattering，DLS）對空白納米膠束，c(RGDyk)DTX-NPs進行粒徑和Zeta電位的測定。納米膠束水溶液過0.45 μm膜以除去灰塵，經過適當稀釋后，于常溫條件下固定激光波長為632.8 nm，散射角為90°測定其粒徑以及Zeta電位。透射電鏡（transmission electron microscope，TEM）檢測納米膠束形態(tài)，取空白納米膠束或載藥納米膠束滴于鋪有碳膜的銅網上，以無纖維濾紙從銅網邊緣吸掉多余液體，滴入2%磷鎢酸染色，自然晾干2 d，置于TEM中以200 kV加速電壓檢視、拍照。差示掃描量熱法（differential scanning calorimetry，DSC）分析納米膠束內藥物分散狀態(tài)，取適量c(RGDyk)DTX-NPs凍干樣品進行DSC分析，起始溫度為0 ℃，升溫速度為5 ℃/min，終止溫度為250 ℃。c(RGDyk)-PL-188材料、DTX粉末、c(RGDyk)-PL-188和DTX的物理混合物同法測定，對照比較確定藥物分散狀態(tài)。

2.5 c(RGDyk)DTX-NPs穩(wěn)定性 為了考察c(RGDyk)DTX-NPs的粒徑與載藥穩(wěn)定性，c(RGDyk)DTX-NPs置于pH 7.4 PBS溶液和含有胎牛血清白蛋白（BSA）的pH 7.4 PBS中于37 ℃環(huán)境中振搖孵育不同時間，3 000 r/min離心5 min，取上清液適量按照2.3和2.4所述方法分別測定c(RGDyk)DTX-NPs的藥物濃度和粒徑。

2.6 c(RGDyk)DTX-NPs體外藥物釋放 采用動態(tài)透析法對游離DTX溶液以及c(RGDyk)DTX-NPs的體外釋藥行為，取1 mL c(RGDyk)DTX-NPs加入至透析袋內（透析膜截留相對分子質量為3 500 Da），扎緊并密封兩端，放置在含有0.5%吐溫-80的50 mL pH 7.4 PBS介質中，置水浴搖床于37 ℃，120 r/min震搖，分別于2、4、6、8、10、12、24 h取1 mL釋放介質，并補充1 mL相應的新鮮釋放介質，按照2.3所述的HPLC方法進行檢測，計算累積釋放百分數，繪制釋放曲線。

2.7 二維膠質瘤細胞模型評價

2.7.1 膠質瘤細胞的培養(yǎng)：以C6膠質瘤和耐DTX的人腦膠質瘤U87細胞株為模型，考察c(RGDyk)DTXNPs體外抗腫瘤效果。C6細胞培養(yǎng)條件為：使用含有10%胎牛血清的高糖DMEM培養(yǎng)基于溫度為37 ℃、CO2濃度為5%的細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。耐DTX的人腦膠質瘤U87細胞株培養(yǎng)條件為：使用含有10%胎牛血清的RPMI1640培養(yǎng)基加入1 μg/mL DTX以維持細胞耐藥性，于實驗2周前停藥，培養(yǎng)溫度為37 ℃、CO2濃度為5%。待培養(yǎng)皿中細胞融合率達85%，使用含有0.25% EDTA的胰酶至培養(yǎng)皿中消化，對其進行傳代培養(yǎng)。

2.7.2 CCK8法細胞毒性實驗：CCK8試劑盒檢測C6膠質瘤和耐DTX的人腦膠質瘤U87細胞株經不同濃度的DTX溶液、DTX-NPs、c(RGDyk)DTX-NPs處理后的細胞活性。將對數生長期的細胞消化后，用培養(yǎng)基稀釋至5×103個/mL細胞密度，經過吹打后，以100 μL/每孔將細胞懸液接種在96孔板內，將96孔板置于細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h使細胞貼壁。待貼壁后，每孔加入100 μL上述不同濃度的不同藥物的新鮮培養(yǎng)介質，并設置一不做任何處理的空白對照組。繼續(xù)培養(yǎng)48 h后，將96孔板取出，吸出所有培養(yǎng)基，用PBS清洗1次，每孔加入90 μL新鮮培養(yǎng)基和10 μL CCK8的混合液，于培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)2 h，使用SpectraMax M3酶標儀測定450 nm處的吸光度。按照如下公式計算細胞的存活率（%）。

A加藥：具有細胞、CCK溶液和藥物溶液的孔的吸光度；A空白：具有培養(yǎng)基和CCK溶液而沒有細胞的孔的吸光度；A0加藥：具有細胞、CCK溶液而沒有藥物溶液的孔的吸光度。

2.7.3 c(RGDyk)DTX-NPs細胞靶向性評價：為了觀察c(RGDyk)DTX-NPs對耐DTX的人腦膠質瘤U87細胞的靶向性，以熒光探針吲哚菁綠（ICG）代替DTX制備熒光標記的c(RGDyk)ICG-NPs。耐DTX的人腦膠質瘤U87細胞株以1×105個/mL密度接種于含有載玻片的6孔板中，置于細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h貼壁后，移去培養(yǎng)液，加入ICG-NPs、c(RGDyk)ICG-NPs，置于細胞培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)2 h，移去含藥細胞培養(yǎng)液，加入4 ℃ 1 mL PBS終止細胞攝取，并沖洗細胞3次，每次5 min。加入4%多聚甲醛于4 ℃環(huán)境下固定細胞20 min，吸出固定液，繼續(xù)用1 mL PBS沖洗細胞3次，每次5 min。加入0.5%曲拉通（Triton）于室溫下通透細胞15 min，PBS沖洗3次，加入含有DAPI染液（1 mg/mL）的抗熒光猝滅劑，封片后于正置熒光顯微鏡下觀察細胞攝取情況。另外，耐DTX的人腦膠質瘤U87細胞先經c(RGDyk)封閉，后加入c(RGDyk)ICG-NPs孵育2 h后，確定細胞內熒光分布變化，進一步確證其靶向性。

2.8 腦膠質瘤細胞球評價

2.8.1 c(RGDyk)ICG-NPs對腦膠質瘤腫瘤球生長抑制：取對數生長期的DTX耐藥人腦膠質瘤U87細胞，0.25%胰酶消化后吹打成單細胞懸液，用無血清培養(yǎng)基、含鏈霉素100 μg/mL、青霉素100 U/mL、bFGF 20 ng/mL、EGF 20 ng/mL以及B27添加物（1×）的DMEM/F12培養(yǎng)液對細胞進行重懸，以每孔1×104個細胞的濃度分別接種于低吸附塑料48孔板，并置于溫度為37 ℃、CO2濃度為5%的細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，根據細胞生長的速度以及培養(yǎng)液的顏色變化更換培養(yǎng)液。選擇大小均勻、圓整致密的腫瘤球，分別加入DTX溶液（10 μg/mL）、c(RGDyk)DTX-NPs（相當于10 μg/mL DTX）對腫瘤球進行處理，并以PBS溶液處理的腫瘤球作為對照組。于3、6、10 d后于倒置顯微鏡下觀察U87膠質瘤腫瘤球的體積變化。

2.8.2 c(RGDyk)ICG-NPs對腦膠質瘤細胞球滲透性：按照2.8.1方法培養(yǎng)DTX耐藥的人膠質瘤U87細胞球，7 d后于顯微鏡下觀察細胞球的形態(tài)與大小，取大小均勻，圓整致密的細胞球進行如下實驗。每孔加入ICG-NP或c(RGDyk)ICG-NPs，于37 ℃培養(yǎng)箱孵育24 h，孵育完畢后移除培養(yǎng)液，用4 ℃ PBS沖洗3次，4%多聚甲醛固定30 min，PBS再次沖洗3次，置于載玻片上，抗熒光猝滅劑封片后通過激光共聚焦顯微鏡斷層掃描并拍照，觀察c(RGDyk)ICG-NPs對腦膠質瘤細胞球滲透深度。

2.9 統(tǒng)計學處理方法 采用SPSS22.0統(tǒng)計軟件進行分析。計量資料以表示，兩兩比較采用t 檢驗，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

3 結果與討論

3.1 c(RGDyk)-PL-188 聚合物合成和結構確證c(RGDyk)-PL-188聚合物經兩步法合成，首先以PL-188 為原材料經琥珀酸酐羧基化后，合成制備得到CT-P188；CT-P188端羧基經EDC/NHS活化后與c(RGDyk)環(huán)肽的氨基縮合，合成制備得到c(RGDyk)-PL-188 靶向材料。FT-IR和1H-NMR對CT-P188 和c(RGDyk)-PL-188結構進行確證，結果如圖1。相比PL-188的FT-IR譜圖（見圖1A），CT-P188的FT-IR結果除了出現(xiàn)PL-188骨架相關峰如3 300 cm-1（OH伸縮振動），2 852 cm-1（CH2伸縮振動）以及1 100 cm-1（C-O-C伸縮振動），還出現(xiàn)了COOH相關的特征峰如1 735 cm-1（C=O伸縮振動）。相比之下，c(RGDyk)-PL-188的FT-IR結果除了出現(xiàn)CT-P188相關峰外，還出現(xiàn)了c(RGDyk)相關的特征峰如1 650 cm-1（酰胺I帶）和1 580 cm-1（酰胺II帶）。相似，CT-P188的1HNMR圖譜（見圖1B）除了出現(xiàn)PL-188骨架相關峰如3.5 ppm（-OCH2CH2O-）以及1.3 ppm（-OCH2CH2CH2O-）外，還出現(xiàn)了琥珀酸相關特征峰如2.5 ppm（O=CCH2CH2-C=O）。相比之下，c(RGDyk)-PL-188的1H-NMR圖譜出現(xiàn)了c(RGDyk)相關峰如2.5～3.2 ppm峰。

圖1 c(RGDyk)-PL-188聚合物結構表征

3.2 c(RGDyk)DTX-NPs的制備與處方篩選 c(RGDyk)-PL-188聚合物和DTX共溶于DMSO，在攪拌下滴入蒸餾水，自發(fā)納米沉淀自組裝，制備載DTX的納米膠束[c(RGDyk)DTX-NPs]?？刂浦苽溥^程中所用DMSO體積，聚合物投料以及攪拌速度等因素，改變處方中c(RGDyk)-PL-188聚合物/DTX比例，制備系列c(RGDyk)DTX-NPs。通過測定各配方下制備的納米膠束載藥量、包封率、粒徑和PDI、電位等指標，篩選出最適處方。結果如表1 所示，隨著c(RGDyk)-PL-188/DTX質量比從50:1升高至10:1，納米膠束中DTX的載藥量逐漸增大，而包封率則逐漸降低，粒徑稍有增大。但當c(RGDyk)-PL-188/DTX增加至5:1時，納米膠束中DTX的載藥量反而降低，包封率則僅有22.6%，表明由于在該條件下藥物的超飽和狀態(tài)誘導快速藥物析出晶型不利于膠束包載。綜上分析，當c(RGDyk)-PL-188/DTX質量比為10:1時，所制備納米膠束具有較高的載藥量（7.88%±0.02%）和適當的包封率（85.5%±2.78%），其粒徑（159.2 nm）相比空白膠束（115.6 nm）雖稍有增大，但仍小于200 nm，而且其具有較窄的粒徑分布（PDI=0.12）。因此，后續(xù)載DTX的納米膠束的穩(wěn)定性、體外釋放以及細胞實驗均以該處方進行研究。

表1 不同聚合物和藥物投料質量比對納米膠束載藥量、包封率、平均粒徑、PDI、Zeta電位的影響（n=3）

3.3 c(RGDyk)DTX-NPs的粒徑與形態(tài) 分別以DLS和TEM檢測c(RGDyk)DTX-NPs水化粒徑（Dh）、粒位分散指數（polymey disperse index，PDI）和形態(tài)。粒徑分布結果如圖2A、2B所示。相比空白c(RGDyk)-PL-188納米膠束[Dh=（115.6±0.2）nm，PDI=0.11]，c(RGDyk)DTX-NPs水化粒徑稍有增大，Dh為（159.2±0.2）nm，粒徑分布稍有變寬（PDI=0.12），表明藥物裝載在膠束核內。膠束樣品經2%磷鎢酸負染后，通過TEM觀察c(RGDyk)-PL-188和c(RGDyk)DTX-NPs微觀形態(tài)。結果如圖2C、2D，c(RGDyk)-PL-188和c(RGDyk)DTX-NPs納米膠束均呈白色的球形粒子并且分布均勻，TEM測量的c(RGDyk)-PL-188脫水狀態(tài)下粒徑為55 nm，而c(RGDyk)DTX-NPs脫水粒徑則增大至65 nm，二者均顯著小于DLS測量的水化粒徑。這表明c(RGDyk)-PL-188材料自組裝的膠束外殼由致密的PEO親水鏈分布，在TEM測定前對樣品的干燥、脫水和抽真空等處理，使納米膠束水化層皺縮，納米膠束粒徑縮小[14]。

3.4 c(RGDyk)DTX-NPs藥物分散狀態(tài) DTX在水中溶解度極低，為高結晶藥物，而c(RGDyk)-PL-188材料納米膠束載藥量可達7.88%，顯著增加DTX在水中的溶解性。因此，本研究進一步利用DSC檢測c(RGDyk)DTX-NPs中DTX分散狀態(tài)，為后續(xù)載藥穩(wěn)定性研究提供依據。DSC結果如圖3A所示，DTX原料藥在160 ℃出現(xiàn)晶體熔點吸熱峰，214 ℃處則為藥物熱降解峰；c(RGDyk)-PL-188聚合物材料在52 ℃則出現(xiàn)PEO鏈有關的吸熱峰；DTX與c(RGDyk)-PL-188聚合物材料的簡單物理混合物則出現(xiàn)二者相關峰的疊加；相比之下，c(RGDyk)DTX-NPs則僅僅出現(xiàn)微弱的PEO有關吸熱峰，DTX相關的晶體熔點峰以及熱降解峰消失，表明DTX在膠束中以分子形式分散存在。c(RGDyk)-PL-188聚合物的PPO鏈與DTX間疏水作用可能是維持DTX在膠束內高度分子分散穩(wěn)定存在的基礎。

圖2 納米膠束粒徑分布和TEM形態(tài)

3.5 c(RGDyk)DTX-NPs在模擬體液中的穩(wěn)定性 前已述及c(RGDyk)DTX-NPs中藥物以分子分散的高能態(tài)存在，為一種不穩(wěn)定存在形式，因此，本研究進一步對c(RGDyk)DTX-NPs在含有BSA的pH 7.4 PBS介質中粒徑和載藥穩(wěn)定性進行考察。結果如圖3B、3C所示，c(RGDyk)DTX-NPs在pH 7.4 PBS溶液和含有BSA的pH 7.4 PBS溶液37 ℃連續(xù)孵育24 h，其粒徑與膠束內藥物濃度沒有發(fā)生明顯變化，各個時間點c(RGDyk)DTX-NPs粒徑維持在155～162 nm間，膠束內藥物濃度變化小于10%，濃度維持在190 μg/mL以上。這些結果表明c(RGDyk)DTX-NPs在模擬體內條件下，具有較好的納米形態(tài)與載藥穩(wěn)定性，為其靜脈注射腫瘤靶向提供前提依據。

3.6 體外藥物釋放 動態(tài)透析法考察DTX在pH 7.4 PBS介質中從c(RGDyk)DTX-NPs制劑體外釋放行為。結果如圖3D所示，相比DTX溶液劑，c(RGDyk)DTXNPs制劑展現(xiàn)出明顯的緩釋行為。DTX溶液劑在2 h內累計釋放達到77.04%，12 h內釋放高達91.71%，而在2 h內c(RGDyk)DTX-NPs累計釋放僅為30.40%，12 h內累計釋放僅為64.44%，甚至24 h釋放才達78.51%。膠束包裹產生的DTX短時緩釋行為有助于靜脈注射給藥后，c(RGDyk)DTX-NPs通過增強滲透滯留效應靶向腫瘤組織，更適用于實際的治療需要。

圖3 c(RGDyk)DTX-NPs體外理化評價

3.7 體外細胞毒性 為了證實c(RGDyk)DTX-NPs對腦膠質瘤細胞耐藥的逆轉，本研究選擇兩種細胞株分別為耐DTX的腦膠質瘤U87細胞和敏感的C6膠質瘤細胞進行體外細胞毒性實驗。結果如圖4 所示，c(RGDyk)-PL-188材料對兩種細胞株在測試濃度范圍內均無毒性，各個濃度細胞存活率均大于90%。對敏感的C6細胞，含DTX的各種制劑包括DTX溶液、DTX-NPs和c(RGDyk)DTX-NPs均展現(xiàn)出濃度依賴的細胞毒性，IC50分別為6.65、4.53、3.02 μg/mL。這表明包裹在聚合物納米膠束中的藥物相對于單純藥物溶液具有更強的細胞毒性，其機制可能是膠束中的藥物以內吞的機制進入細胞，使得更多藥物轉運至細胞內靶位，進而殺傷腫瘤細胞[15]。相比之下，耐DTX的腦膠質瘤U87細胞則展現(xiàn)出明顯的耐藥性，DTX溶液制劑IC50為106.91 μg/mL，明顯高于敏感的C6細胞計算的IC50。但兩種DTX納米膠束制劑包括DTX-NPs和c(RGDyk)DTX-NPs對耐藥的腦膠質瘤U87細胞則顯示出更明顯的濃度依賴性細胞毒性，IC50分別為13.46 μg/mL和8.26 μg/mL，明顯低于DTX溶液的IC50（P ＜0.05），表明納米膠束有效逆轉腦膠質瘤U87細胞對DTX的耐藥性。耐藥性的逆轉可能與膠束材料PL-188抑制耐藥P-gp介導的轉運有關。而且，c(RGDyk)DTX-NPs相比DTX-NPs在多個濃度點對耐藥的腦膠質瘤U87細胞展現(xiàn)出更強的細胞毒性。這是因為U87膠質瘤細胞膜過多表達αvβ3整合素，能更特異性吞噬c(RGDyk)DTX-NPs，更多藥物繞開多藥耐藥蛋白進入細胞內。

3.8 c(RGDyk)ICG-NPs靶向性 為了進一步確證c(RGDyk)-NPs對耐藥U87 膠質瘤細胞的靶向性，以熒光探針I(yè)CG代替DTX裝載在納米膠束內制備c(RGDyk)ICG-NPs，比較ICG-NPs和c(RGDyk)ICG-NPs在細胞內分布的差異。結果如圖5所示，孵育2 h后，ICG-NPs處理僅有微弱的藥物分布在細胞質內。相比之下，c(RGDyk)ICG-NPs處理則在細胞質內出現(xiàn)明顯紅色熒光分布，表明c(RGDyk)-NPs具有更強的細胞靶向性。這種細胞質內高濃度藥物攝取與其較強的細胞毒性結果相一致。而耐藥U87膠質瘤細胞與c(RGDyk)溶液（10 μg/mL）預孵育2 h后再加入c(RGDyk)ICG-NPs進行攝取檢測，結果發(fā)現(xiàn)細胞內熒光明顯減弱，表明c(RGDyk)ICG-NPs靶向機制與細胞表面αvβ3整合素結合有關。

圖4 體外細胞毒性實驗

圖5 U87 DTX耐藥細胞對不同ICG制劑的攝取結果（×200）

3.9 腫瘤球生長抑制 研究報道，腫瘤干細胞是一種增殖失控的細胞，并且可能是腫瘤細胞產生耐藥性的根源[16-17]。因此我們通過構建3D U87膠質瘤細胞球，體外考察了c(RGDyk)DTX-NPs對腫瘤球的生長抑制作用，結果如圖6所示。在治療后的第10天，未加藥物的陰性對照組腫瘤球體積生長迅速，體積是原發(fā)灶的2.47倍；相反，DTX溶液組延緩了U87膠質瘤球體的生長，其第10天的體積是第0天的1.73倍；與DTX溶液組相比，c(RGDyk)DTX-NPs組顯著增加了DTX對U87腫瘤球的抑制作用，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），其第10天的體積是原發(fā)灶的0.5倍。表明c(RGDyk)的靶向性聯(lián)合納米膠束制劑能有效增加DTX對耐藥腫瘤的殺傷作用。

3.10 腫瘤球滲透實驗 已有研究證實，腫瘤球與體內實際腫瘤具有某些相似的特征，包括實體瘤內部缺乏足夠的氧氣和養(yǎng)分、體內藥物遞送可能遇到的細胞外基質障礙等[18-20]。為了證實c(RGDyk)DTX-NPs在U87細胞三維實體腫瘤球中的滲透擴散行為，以ICG代替DTX制備熒光標記的c(RGDyk)ICGNPs通過激光共聚焦顯微鏡斷層掃描技術對U87腫瘤球進行了考察。結果如圖7所示，ICG-NP、c(RGDyk)ICG-NPs分別與U87三維實體腫瘤球共孵育24 h后，ICG-NP組紅色熒光只在腫瘤球表面少量分布；而c(RGDyk)ICG-NPs組的紅色熒光不僅分布于腫瘤球表面，而且其熒光能夠均勻地滲透到腫瘤球的中心。這些結果表明，與ICG-NP相比，c(RGDyk)ICGNPs具有更強的靶向穿透能力，其對腫瘤的這種更深的滲透可能使DTX被傳遞到腫瘤球的核心，從而抑制腫瘤核心和表面的生長，進而增強對腫瘤球生長抑制作用。

圖6 耐DTX的U87腫瘤球的生長抑制評價

4 結論

圖7 孵育24 h后ICG-NP（A）和c(RGDyk)ICG-NPs（B）在U87腫瘤球的滲透情況（×200）

本研究以PL-188為納米材料，利用其結構特點，經琥珀酸酐羧基化后，鍵合c(RGDyk)，實現(xiàn)對疏水性DTX裝載，構建了包載DTX納米膠束，初步探索其對耐DTX的人腦膠質瘤U87細胞的抑制效果。結果表明該聚合物膠束對DTX具有一定的載藥量和包封率。體外釋放實驗表明，c(RGDyk)DTX-NPs較DTX溶液能明顯延緩DTX的釋放，呈現(xiàn)緩釋釋放行為，延長藥物的作用時間。細胞毒性實驗表明該聚合物膠束能高效地逆轉U87耐藥細胞對DTX的耐藥性。藥物攝取實驗表明該聚合物膠束可被U87膠質瘤細胞快速攝取，能顯著地增加后釋放的DTX在細胞中的濃度，可有效地殺傷腫瘤細胞。體外腫瘤球實驗也進一步證明了該納米膠束能有效地滲透至腫瘤球核心進而抑制U87腫瘤球的生長。為了進一步確定該納米膠束對動物模型的效果，需要進行體內藥效學以及藥動學的研究。