劉儀

摘 要：甘薯是廣西廣泛種植的農(nóng)作物之一，但近年來甘薯病毒病普遍發(fā)生，對(duì)甘薯產(chǎn)量和品質(zhì)造成了嚴(yán)重影響。本研究已經(jīng)病毒檢測(cè)后確定感染甘薯卷葉病毒（Sweet potato leaf curl virus， SPLCV）的甘薯為研究材料，經(jīng)固定、脫水、包埋和超薄切片過程后，用電鏡進(jìn)行細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)的觀察。研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)感染SPLCV植株的葉細(xì)胞有畸形現(xiàn)象出現(xiàn)，細(xì)胞壁變薄，葉綠體呈畸形，基粒及基質(zhì)片層外膜離解模糊，葉綠體腫脹并伴隨膜增生，出現(xiàn)嗜鋨顆粒等情況。據(jù)此推測(cè)，甘薯卷葉癥狀產(chǎn)生的原因可能是由于SPLCV侵染后造成細(xì)胞壁變薄，張力變大，細(xì)胞支持力變小，從而使葉片容易發(fā)生卷曲，最終影響甘薯的產(chǎn)量和品質(zhì)。

關(guān)鍵詞：甘薯;甘薯卷葉病毒;葉綠體;超微結(jié)構(gòu)

甘薯[Ipomoea batatas（L.）Lam.]，旋花科（Convolvulaceae），甘薯屬（Ipomoea Genus），長(zhǎng)勢(shì)為平臥在地面往上，葉片通常是圓卵形，長(zhǎng)8厘米左右，寬5厘米左右。進(jìn)入21世紀(jì)以來，甘薯在世界范圍內(nèi)糧食生產(chǎn)中總產(chǎn)量排在第五位，是十分重要的糧食作物。

SPLCV是一種雙生病毒（geminivirus），屬雙生病毒科（Geminiviridae），菜豆金色花葉病毒屬（Begomovirus）。此病毒侵染后會(huì)導(dǎo)致葉片黃化，植株矮縮。2006年，Luan等在國(guó)內(nèi)發(fā)現(xiàn)SPLCV。2012-2014年，在多省甘薯種植基地調(diào)查發(fā)現(xiàn)甘薯卷葉病毒多發(fā)。此外，北美和亞洲部分地區(qū)也有關(guān)于SPLCV發(fā)生的報(bào)道。

一、實(shí)驗(yàn)材料和方法

1.實(shí)驗(yàn)材料

遮光處理、嚴(yán)格隔離的供試材料為1（桂紫薯1號(hào)）、2（濟(jì)薯22）、3（桂紫薯3號(hào)）、4（桂粉3號(hào)（1））、5（桂粉2號(hào)）、6（桂粉3號(hào)（2））。

（1）主要儀器

冰凍超薄切片機(jī)，高速冷凍離心機(jī)，NanoDrop 1000C超微量分光光度計(jì)，透射電子顯微鏡，小型常溫離心機(jī)，PCR儀，水平電泳槽，凝膠成像系統(tǒng)，超凈工作臺(tái)，水浴鍋，恒溫培養(yǎng)箱，-80℃超低溫冰箱。

（2）主要試劑

TRIpure Isolation Reagent（購(gòu)自Roche公司）;Super RT cDNA第一鏈合成試劑盒（購(gòu)自康為世紀(jì)公司）;2.5%戊二醛、0.1mol/L的磷酸緩沖液（pH=7.0）、1%四氧化鋨、乙醇、Spurr低粘度環(huán)氧樹脂、醋酸雙氧鈾、檸檬酸鉛等。

2.實(shí)驗(yàn)方法

甘薯葉片經(jīng)過葉綠體總RNA的提?。ㄊ褂肨RIpure Reagent 試劑盒提取葉綠體總RNA），甘薯病毒的鑒定RT-PCR（其中包括RNA反轉(zhuǎn)錄過程和PCR擴(kuò)增反應(yīng)過程），然后進(jìn)行電鏡制樣觀察 ：分別取健康、具明顯癥狀的葉片，經(jīng)暗處理，再照光兩小時(shí)以上。取葉肉部分切成約1mm健康對(duì)照的片段，在4℃下用2.5%戊二醛固定過夜，取0.1mol/L的已配制好的磷酸緩沖液（pH=7.0）進(jìn)行漂洗，用1%四氧化鋨固定2 h后，再進(jìn)行乙醇不同梯度脫水，最后用Spurr低粘度環(huán)氧樹脂進(jìn)行包埋。

二、結(jié)果

1.供試甘薯樣品癥狀圖：

結(jié)果分析：從B中可見，葉脈表現(xiàn)出透明網(wǎng)狀。從A、D、F中可見，葉片細(xì)小，葉片邊緣卷曲，葉緣扭曲不齊，葉片小、皺縮。從C、E中可見，癥狀不明顯，但可見粉虱。

2.RNA瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果

用TRIpure Isolation Reagent提取RNA。用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)后，其電泳結(jié)果顯示：桂粉3號(hào)（1）提取的RNA的條帶較明亮，濃度較高，其余樣品提取的RNA條帶比較暗淡，濃度較低。

3.cDNA瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果

將提取出來的RNA用Super RT cDNA第一鏈合成試劑盒（購(gòu)自康為世紀(jì)公司）合成之后，加入病毒檢測(cè)引物進(jìn)行PCR，PCR產(chǎn)物的電泳結(jié)果顯示：從瓊脂糖凝膠電泳圖里可以得出桂粉2號(hào)、桂粉3號(hào)（2）均為單一感染SPLCV。

4.電鏡制樣觀察結(jié)果

CH：葉綠體;CW：細(xì)胞壁;CM：細(xì)胞膜;S：淀粉粒;OG：嗜鋨顆粒健康甘薯植株葉片所含葉綠體的超微結(jié)構(gòu)，其形態(tài)特征為：細(xì)胞壁致密，線粒體、葉綠體輪廓清晰，形態(tài)結(jié)構(gòu)完整，分布均勻。健康的葉綠體呈長(zhǎng)梭狀，排列有序，外膜規(guī)整，液泡顯著，核染色質(zhì)均勻，進(jìn)行著有效的光合作用。

圖2中，觀察感染SPLCV病毒的甘薯葉片所含葉綠體的形態(tài)結(jié)構(gòu)變化。大部分葉細(xì)胞的細(xì)胞壁變薄，細(xì)胞間隙變大變寬，葉片細(xì)胞也有不同程度的畸形現(xiàn)象出現(xiàn)。細(xì)胞內(nèi)形態(tài)結(jié)構(gòu)發(fā)生的變化則主要體現(xiàn)在：基粒及基質(zhì)片層外膜解體或模糊不清，排列紊亂;葉綠體和線粒體緊密的貼在細(xì)胞膜上，細(xì)胞質(zhì)出現(xiàn)空泡化;出現(xiàn)不明代謝物，可能是多糖類物質(zhì)堆積;葉綠體從原來健康時(shí)的梭形脹大堆積變成近圓形，產(chǎn)生了大量的沉積物，淀粉粒增大增多;葉綠體嗜鋨顆粒變大、油脂油滴增多;綠體膜增生，部分葉綠體邊緣出現(xiàn)異形增生物。

三、討論

智海劍等和李赤等經(jīng)研究發(fā)現(xiàn)，葉綠體受病毒侵染后，會(huì)出現(xiàn)葉綠體嗜鋨顆粒變大、油脂油滴增多的現(xiàn)象，特別是衰老和感病的細(xì)胞中。李學(xué)湛研究受病毒侵染的大豆葉片細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)，發(fā)現(xiàn)病毒會(huì)對(duì)寄主葉片細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)產(chǎn)生不良作用，超微結(jié)構(gòu)也會(huì)發(fā)生不同程度改變。在本研究中，也發(fā)現(xiàn)類似現(xiàn)象。甘薯葉片經(jīng)SPLCV感染后，葉綠體內(nèi)就出現(xiàn)了大量嗜鋨顆粒，影響正常植物的生長(zhǎng)。葉綠體受到了結(jié)構(gòu)性的損傷，葉綠體基粒和基質(zhì)片層模糊并裂解，被SPLCV侵染甘薯葉細(xì)胞后細(xì)胞膜也發(fā)生裂解，且細(xì)胞壁變薄，張力變大。

本研究中，還發(fā)現(xiàn)SPLCV侵染產(chǎn)生的卷葉癥狀，使葉綠體從正常的梭狀脹大堆積變成近圓形，產(chǎn)生了大量的沉積物，淀粉粒增多;綠體膜增生，部分葉綠體邊緣出現(xiàn)異性增生物。而葉綠體等亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)遭到不同程度的損壞，將直接影響葉片細(xì)胞的光合作用，最后影響甘薯的產(chǎn)量和品質(zhì)。

參考文獻(xiàn)：

[1] 畢瑞明. 甘薯（Ipomoea batatas Lam.）的遺傳轉(zhuǎn)化及轉(zhuǎn)基因植株的性狀變化[D]. 西南大學(xué)， 2001.

[2] 智海劍， 蓋鈞鎰， 郭東全， 王延偉. 對(duì)大豆花葉病毒不同抗性類型品種的細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)特征[J]. 南京農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)， 2005， （01）： 6-10.