藺 萌,王亞婷,朱美霖,雷寧靜

(1鄭州大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院形態(tài)學(xué)實驗中心微生物與免疫實驗室,鄭州 450001;2鄭州大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院免疫學(xué)教研室;*通訊作者,E-mail:lnj717@zzu.edu.cn)

外泌體(exosomes)存在于幾乎所有正?；虿±淼慕M織細胞和培養(yǎng)細胞中,它是來源于細胞內(nèi)溶酶體內(nèi)陷形成的多囊泡。多囊泡的外膜與細胞膜融合,然后被釋放到胞外基質(zhì)中形成外泌體,現(xiàn)在主要指的是直徑在40-100 nm的盤狀囊泡[1]。目前,關(guān)于外泌體的研究越來越受到國內(nèi)外的重視,自1983年首次被發(fā)現(xiàn)以來,其形成原因、組成成分[2]、分泌過程[3]和信號傳導(dǎo)作用[4]以及相關(guān)的一系列功能逐漸被發(fā)現(xiàn)[5],外泌體的大小決定了其研究在超微結(jié)構(gòu)的水平。現(xiàn)今最常用到的是電子顯微鏡尤其是透射電鏡[6],而透射電鏡樣品制備方法的選擇對最終樣品觀察有極大影響,因此選擇一種適合的外泌體制備方法至關(guān)重要。透射電鏡實驗中組織和細胞等制備樣品一般都采用超薄切片的常規(guī)制備方法,對于體積在微米級以下的生物樣品則需要通過其他方法制備[7]。目前,已有很多文獻報道中對超微結(jié)構(gòu)在臨床上的作用進行研究,其中外泌體的研究較為廣泛[8,9]。本文主要以巨噬細胞外泌體為例總結(jié)出一種適用于外泌體等超微結(jié)構(gòu)透射電鏡樣品的制備方法,選擇最佳的制備條件以達到更好的觀察效果。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 材料與試劑 本研究所用外泌體來源于小鼠單核巨噬細胞RAW264.7;其余試劑有磷酸緩沖液(PB)、醋酸鈾染色液(雅盛科技)等。

1.1.2 耗材設(shè)備 碳覆膜銅網(wǎng)(300目);恒溫培養(yǎng)箱;超速離心機(Optima L-100K,美國);HT7700透射電子顯微鏡(HITACHI,日本)。

1.2 方法

1.2.1 外泌體的獲取 培養(yǎng)小鼠巨噬細胞RAW264.7,以10個10 cm細胞皿細胞融合度達95%以上,數(shù)量約106-107個,收集細胞上清液,用0.22 μm的濾器過濾后加入超速離心管中,液體量超過2/3,4 ℃ 110 000g離心2 h;倒出上清液用PB重懸,液體量超過2/3,4 ℃ 110 000g離心70 min;倒出上清液,沉淀物用100 μl PB重懸,納米顆粒跟蹤分析技術(shù)(nanoparticle tracking analysis,NTA)計數(shù)外泌體濃度在5×1011/ml左右,加到200 μl EP管中,4 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 樣品制備及觀察 將獲取的外泌體(濃度在5×1011/ml左右)倍比稀釋至少3個濃度梯度,稀釋倍數(shù)分別為5倍、10倍、20倍;每個濃度各取10 μl滴加至碳覆膜銅網(wǎng)上,滴加時形成水滴樣,樣品吸附90 s,用濾紙吸去多余液體后晾干;染色時,每個銅網(wǎng)上滴加醋酸鈾染色液10 μl,避光染色,染色時間30 s,用濾紙吸去多余液體,晾干;透射電鏡下觀察并拍照記錄。

2 結(jié)果

結(jié)果顯示,稀釋倍數(shù)為5倍的銅網(wǎng)上外泌體的濃度為1.0×1011/ml左右,圖中外泌體數(shù)量相對較多(見圖1A),稀釋倍數(shù)為10倍的濃度為0.5×1011/ml左右,圖中外泌體數(shù)量相對較少(見圖1B),稀釋倍數(shù)為20倍的外泌體個數(shù)極少,已舍棄實驗結(jié)果。透射電鏡下可以觀察到,銅網(wǎng)上的外泌體的膜結(jié)構(gòu)完整,輪廓清晰,直徑在100 nm左右,能明顯看到圓盤狀結(jié)構(gòu)(見圖1C、D)。因此,外泌體濃度控制在1.0×1011/ml左右觀察效果更佳。

A.為200 nm下稀釋5倍，濃度1.0×1011/mL左右的外泌體；B.為200 nm下稀釋10倍，濃度0.5×1011/mL左右的外泌體；C、D.為100 nm下的外泌體圖1 透射電子顯微鏡下的外泌體Figure 1 Exosomes under transmission electron microscopy(TEM)

3 討論

在本研究中,采用超速離心法獲取外泌體,其濃度較難控制,分多個梯度稀釋(1倍、5倍、10倍、20倍、30倍、40倍、50),先進行預(yù)實驗找到較為合適的濃度范圍后再縮小到5倍、10倍、20倍3個梯度,這樣能更節(jié)省時間、減少損耗,以便更有效地利用樣品。通過比較4種不同孔目(200目、230目、300目、400)的銅網(wǎng),結(jié)果發(fā)現(xiàn)300目的銅網(wǎng)較為合適,每個銅網(wǎng)上的樣品10 μl,可根據(jù)樣品濃度調(diào)節(jié)用量。液滴附著時間(預(yù)實驗有30 s、60 s、90 s、120 s 4個時間范圍)選擇90 s,在液體表面張力的作用下,外泌體均勻分散在銅網(wǎng)上,時間過長易殘留污漬,時間過短樣品附著或分散不均。醋酸鈾染液染色時間選擇30 s,保證液滴邊緣也能均勻染色,而時間過長或過短染色結(jié)果會出現(xiàn)黑團或泛白不著色的現(xiàn)象,影響結(jié)果觀察。

相對于常規(guī)制備方法的固定、脫水、滲透、包埋、聚合、超薄切片等步驟需要至少1周的時間來說,本文采用的滴片法一般在幾個小時到一天的時間即可觀察,只需要經(jīng)過吸附樣品和負(fù)染,制備步驟簡單,所用樣品量、試劑很少,減少制劑污染,同時極大地節(jié)省了時間和成本,提高了實驗效率[10];測量范圍廣,除外泌體外,本文中所用的懸滴法已經(jīng)檢測過核酸、小分子蛋白、人工合成蛋白、纖維、納米材料[11]等超微結(jié)構(gòu)樣品;重復(fù)性好,在濃度不變的情況下,懸滴法制備的樣品可以重復(fù)觀測并觀測效果誤差很小;樣品用量少,無需處理大量培養(yǎng)細胞即能獲得所需樣品量,降低試驗成本。除外泌體外,對于核酸、細胞器、合成蛋白、生物膜等[12]亞細胞結(jié)構(gòu)和小分子生物材料等也可用滴片法制備樣品。

在生命科學(xué)研究中,組織和細胞等細胞水平的研究已經(jīng)很廣泛,而對于亞細胞或者亞顯微結(jié)構(gòu)的研究則主要集中在納米等級,生物樣品應(yīng)用較多的透射電鏡觀察需要經(jīng)過繁瑣的制備步驟,所用制劑可能導(dǎo)致生物樣本形態(tài)學(xué)上的改變,技術(shù)限制是其中的一個重要原因。cryo-TEM是一項應(yīng)用于納米結(jié)構(gòu)觀察的新技術(shù),解決了生物樣品脫水失活的問題以及不耐電子輻照損傷的問題,用于外泌體標(biāo)本制作有其技術(shù)上的顯著優(yōu)勢[13]。但是冷凍電鏡技術(shù)需要的實驗要求較高,而常規(guī)電鏡已經(jīng)非常普遍,應(yīng)用也廣泛,因此,從實驗條件和實驗成本上來考慮,在納米級別的超微結(jié)構(gòu)樣品的透射電鏡樣品制備方法中,采用滴片法制備外泌體在目前來說仍是一種相對較好的制備方法[14],對于超微結(jié)構(gòu)研究的真實性仍然具有十分重要的意義。