嚴文瑞,王玲芝,2,候玲玲,張立偉*

(1化學生物學與分子工程教育部重點實驗室,山西大學分子科學研究所,太原 030006;2山西大學化學化工學院;*通訊作者,E-mail:lwzhang@sxu.edu.cn)

黃曲霉毒素B1(aflatoxin B1,AFB1)是由黃曲霉菌寄生曲霉菌等產(chǎn)毒菌株所產(chǎn)生的次級代謝產(chǎn)物,毒性是氰化物的10倍、砒霜的68倍,短期暴露可引起人體及動物肝細胞壞死、中毒性肝炎、膽管增生、免疫抑制等急性肝損傷,長期暴露會引發(fā)肝癌[1]。在溫熱潮濕的地區(qū)一些糧食及其加工產(chǎn)品,主要是稻谷、玉米、豆類等含水量高的作物及其糧油制品AFB1污染嚴重,對人和動物的健康造成了極大的危害[2]。我國南方由于地處濕熱地帶,AFB1污染十分嚴重,如何減少和消除AFB1對人和動物造成的危害是當今的一大難題[3]。

復方黃芪益氣口服液是以黃芪為君藥,佐以黨參、大棗、甘草,采用現(xiàn)代制劑工藝和技術制成的口服劑。黃芪是山西的道地藥材,其藥用迄今已有2 000多年的歷史,能增強機體的免疫功能[4]。已有研究表明,黃芪多糖可用來治療AFB1誘發(fā)的肝損傷,具有顯著的抗氧化及脂質代謝調(diào)節(jié)作用[5],黃芪甲苷也具有增強免疫力和保護肝臟的作用[6],為本課題提供了理論依據(jù)。本課題組前期研究表明,復方黃芪益氣口服液具有提高免疫、抗應激、抗氧化等功能[7],臨床用于氣虛、血虛、氣血兩虛的病人,對體力恢復、癥狀改善有明顯的療效[8]。然而,目前尚無其對AFB1造成肝損傷的保護和治療作用的研究報道,因此,本研究探討復方黃芪益氣口服液對AFB1造成的大鼠急性肝損傷的作用。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

雄性Wistar 6周齡大鼠40只,SPF級,體質量200-220 g,購自斯貝福(北京)生物技術有限公司,許可證號:SCXK-(京)2016-0002。動物實驗環(huán)境:山西省醫(yī)藥與生命科學研究院清潔級動物實驗室,設施使用許可證號SYXK(晉)2017-0001,由獲得資格認可的人員飼養(yǎng),12/12 h照明/黑暗。大鼠在清潔干燥的標準飼養(yǎng)盒內(nèi)喂養(yǎng);動物房溫度控制在(23±1)℃,濕度控制在50%±10%。飼料為滅菌全價大鼠顆粒飼料,飲用過濾純凈水。

1.2 藥物及試劑

復方黃芪益氣口服液(本實驗室制備,黃芪、黨參、大棗和甘草四味水煎)。AFB1標準品(純度>99%,新加坡);水飛薊賓(批號:YS8031503,編號:CV98613-1g,上海思域化工科技有限公司);谷丙轉氨酶(ALT)、谷草轉氨酶(AST)、堿性磷酸酶(ALP)、總膽紅素(TBIL)、丙二醛(MDA)、超氧化物歧化酶(SOD)、谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-Px)、過氧化氫酶(CAT)檢測試劑盒(南京建成生物工程有限公司);二甲基亞砜(DMSO,批號20161008,天津市大茂化學試劑廠);大笨鐘特級初榨橄欖油(中歐天然食品股份有限公司)。

1.3 主要儀器

全自動生化分析儀,金西盟(北京)儀器有限公司(中國總公司);FM200A高剪切分散乳化機,上海弗魯克科技發(fā)展有限公司;FA-B型電子分析天平,上海右科儀器儀表有限公司。

1.4 造模及分組

大鼠適應性飼養(yǎng)5 d,隨機分為5組:空白組、溶劑對照組(DMSO組)、模型組、陽性藥物對照組(陽性對照組)、復方黃芪益氣口服液組(口服液組),每組8只:大鼠分組后禁食過夜,稱重,模型組、陽性對照組、口服液組大鼠以2 mg/kg的AFB1(溶于12.5% DMSO水溶液中)單劑量灌胃以誘導急性AFB1肝損傷,空白組給予等量的水,DMSO組給予等量的DMSO。以AFB1灌胃造模的同時,陽性對照組給予100 mg/kg水飛薊賓(溶于橄欖油中),口服液組按照人臨床服用標準換算劑量為2 ml/kg復方黃芪益氣口服液,DMSO組、模型組和空白組灌胃等量的水,每日1次,持續(xù)3 d。給藥3 d禁食過夜,稱取大鼠體質量,麻醉后迅速腹腔主動脈取血,離心,取血清-20 ℃保存;取肝臟,生理鹽水清洗后吸干稱重;取適當大小肝組織浸泡在甲醛溶液中,充分固定后用于組織病理學觀察,其余肝組織于液氮冷凍后,-80 ℃保存。

1.5 肝指數(shù)檢測

取出肝臟后迅速稱量肝濕重,肝指數(shù)=(肝濕重/體質量)×100%。

1.6 肝組織病理學變化觀察

肝組織在甲醛溶液中充分固定,常規(guī)石蠟包埋、切片,蘇木素染色,光學顯微鏡觀察肝組織結構及其病理變化。

1.7 血清肝功能指標測定

腹主動脈取血,3 000 r/min,4 ℃離心10 min分離血清,用于全自動生化分析儀檢測ALT、AST和ALP活性及TBIL含量。

1.8 肝組織抗氧化指標測定

準確稱取肝組織,解凍后加入9倍體積預冷生理鹽水,迅速用電動分散機勻漿,于4 ℃,2 500 r/min,離心10 min,取上清即為待測肝臟勻漿。按試劑盒說明檢測肝臟勻漿總蛋白含量和抗氧化指標MDA、SOD、CAT和GSH-PX含量。

1.9 統(tǒng)計學分析

用SPSS 19.0軟件對各組數(shù)據(jù)進行處理,以單因素方差分析進行顯著性比較,數(shù)據(jù)以均值±標準差表示,P<0.05為差異具有統(tǒng)計學意義,用GraphPad Prism 5作圖。

2 結果

2.1 大鼠健康狀況

實驗期間無大鼠死亡,空白組和DMSO組大鼠食欲良好,毛色正常,周身順滑有光澤,反應敏捷,行為迅速;模型組大鼠食欲減退,精神不振,毛色黯淡,活躍度下降;陽性對照組和口服液組較模型組狀況有所改善。

2.2 肝肉眼觀察變化

空白組與DMSO組肝臟表面呈現(xiàn)正常的暗紅色;模型組肝臟發(fā)黃,表面有輕微出血點;陽性對照組和口服液組肝臟輕微發(fā)黃,表面無出血點,較模型組有所改善。

2.3 復方黃芪益氣口服液對大鼠體質量和肝指數(shù)的影響

由表1可知,實驗前各組間大鼠體質量不存在顯著差異,實驗處理3 d,除空白組和DMSO組外,其余組大鼠體質量增長緩慢甚至負增長,空白組與模型組有顯著性差異(P<0.05),說明AFB1會抑制大鼠體質量增長;陽性對照組、口服液組的體質量增長量較模型組有所改善,但效果不明顯,其原因可能與實驗天數(shù)短有關。

表1 復方黃芪益氣口服液對大鼠體質量的影響

(n=8,g)

Table 1 Effect of Fufang Huangqi Yiqi oral liquid on body weight in AFB1-treated rats(n=8,g)

動物分組實驗前體質量實驗后體質量體質量增長量 空白組235.8±11.4259.4±11.723.56±3.64 DMSO組236.4±7.5260.8±7.624.33±5.02模型組238.4±8.7236.5±9.3#-1.9±8.87#陽性對照組236.9±8.5235.4±14-0.3±9.35口服液組235.1±4.2237.8±8.22.6±6.92

與正常組比較,#P<0.05

由圖1可見實驗處理3 d,模型組與DMSO組、空白組比較,肝指數(shù)明顯降低,差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。陽性對照組、口服液組與模型組相比肝指數(shù)明顯升高,差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。

2.4 大鼠肝組織病理學變化

對大鼠肝組織病理學變化進行觀察,空白組和DMSO組大鼠的肝組織結構正常,肝小葉清晰且結構完整;肝細胞多呈多邊形,以中央門靜脈為中心呈放射狀整齊排布,胞質均勻,細胞核位于細胞中心呈圓形,核仁清晰,無明顯異常變化(見圖2)。模型組大鼠的肝組織結構異常,肝小葉結構不完整;肝細胞明顯腫脹,大量變性甚至壞死;匯管區(qū)有嚴重膽管增生且伴有炎細胞浸潤,匯管區(qū)明顯增寬(見圖2)。陽性對照組大鼠的肝組織結構較正常組有所改善,肝細胞腫脹程度減輕,炎癥浸潤現(xiàn)象顯著減輕,但仍可見不同程度的病變(見圖2)。復方黃芪益氣口服液干預后的肝組織切片顯示,大鼠的肝組織基本恢復至正常,肝細胞索排列規(guī)則,且沒有出現(xiàn)肝細胞變性、腫脹及匯管區(qū)炎癥浸潤等現(xiàn)象無明顯異常變化(見圖2)。

與正常組比較,#P<0.05;與模型組比較,*P<0.05圖1 復方黃芪益氣口服液對大鼠肝指數(shù)的影響Figure 1 Effect of Fufang Huangqi Yiqi oral liquid on liver index in AFB1-treated rats

圖2 肝組織病理學形態(tài)變化 (×200)Figure 2 Pathological changes of liver tissue in different groups (×200)

2.5 復方黃芪益氣口服液對大鼠血清肝功能生化指標的影響

對大鼠血清ALT、AST、ALP和TBIL使用試劑盒進行測試,結果見圖3。模型組大鼠血清ALT、AST、ALP和TBIL明顯高于空白組和DMSO組,差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05),這與肝指數(shù)和肝臟病理切片的結果相符。與模型組比較,陽性對照組和口服液組明顯抑制了AFB1引起的血清肝功能生化指標的急劇升高,差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05),其中ALP基本恢復至正常水平。

與正常組比較,#P<0.05,##P<0.01;與模型組,*P<0.05,**P<0.01圖3 復方黃芪益氣口服液對大鼠血清ALT、AST、ALP、TBIL的影響Figure 3 Effect of Fufang Huangqi Yiqi oral liquid on serum ALT, AST, ALP and TBIL in AFB1-treated rats

2.6 復方黃芪益氣口服液對大鼠肝臟脂質過氧化的影響

肝臟MDA含量可間接反映機體脂質過氧化嚴重程度及細胞受損情況,可以作為評價復方黃芪益氣口服液抑制AFB1誘發(fā)大鼠肝臟脂質過氧化反應的指標。模型組大鼠攝入高劑量AFB1會導致大鼠肝臟脂質過氧化產(chǎn)物MDA含量顯著上升(P<0.01,見圖4),口服液組MDA含量極顯著低于模型組(P<0.01),與陽性對照組相當且恢復到正常水平。

與正常組比較,#P<0.05,##P<0.01;與模型組,*P<0.05,**P<0.01圖4 復方黃芪益氣口服液對大鼠肝臟中MDA含量的影響Figure 4 Effect of Fufang Huangqi Yiqi oral liquid on the level of MDA in liver tissues of AFB1-treated rats

2.7 復方黃芪益氣口服液對大鼠肝組織抗氧化指標的影響

肝組織中CAT、SOD、GSH-PX的活性水平可以直接反應肝臟的抗氧化能力,可作為評價復方黃芪益氣口服液提高AFB1誘發(fā)大鼠肝臟抗氧化應激損傷的指標。由圖5可知,模型組與DMSO組、空白組比較,肝組織中CAT、SOD、GSH-PX活性顯著降低(P<0.05);連續(xù)服用復方黃芪益氣口服液3 d,口服液組與模型組相比大鼠肝臟中CAT、SOD、GSH-PX活性明顯增強,其中SOD和GSH-PX都恢復到了正常水平,CAT活力顯著改善(P<0.05)。

3 討論

肝臟是AFB1的主要靶器官,AFB1暴露會引起肝臟和肝細胞的嚴重受損,肝臟受損表現(xiàn)為肝指數(shù)降低[9],本實驗中復方黃芪益氣口服液的干預可以抑制肝指數(shù)的降低;肝臟受損病理表現(xiàn)為膽管增生,肝小葉結構紊亂,肝細胞索不明顯,肝細胞壞死,崩裂,細胞組織結構消失[10]。本實驗AFB1干預的肝臟病理觀察結果與上述表現(xiàn)相符,而用復方黃芪益氣口服液治療的大鼠肝臟病理切片顯示肝細胞損傷顯著改善,出現(xiàn)修復性病灶。肝細胞受損表現(xiàn)為細胞膜通透性增加,ALT和AST通過細胞膜進入血液,使得血清中ALT和AST急劇增加,故血清ALT和AST水平的高低是反映肝細胞損傷程度的特異性指標[11]。在本實驗中,大鼠服用AFB1后,ALT和AST含量顯著升高,而用復方黃芪益氣口服液干預的大鼠血清中ALT和AST水平顯著降低,這表明復方黃芪益氣口服液能夠起到干預AFB1所致肝損傷的作用。肝臟的病理性損傷也會引起ALP和TBIL的異常升高,復方黃芪益氣口服液干預的大鼠ALP和TBIL顯著降低,這進一步表明復方黃芪益氣口服液能夠起到干預AFB1所致肝損傷的作用。

與正常組比較,#P<0.05,##P<0.01;與模型組,*P<0.05,**P<0.01圖5 復方黃芪益氣口服液對大鼠肝臟中SOD、CAT、GSH-PX含量的影響Figure 5 Effect of Fufang Huangqi Yiqi oral liquid on the levels of hepatic SOD, CAT and GSH-PX in AFB1-treated rats

AFB1致肝損傷的發(fā)病機制與氧化應激密切相關,肝臟酶系在代謝過程中生成大量自由基,AFB1會導致自由基介導損傷,主要表現(xiàn)就是脂質過氧化;還會導致細胞抗氧化酶水平降低,引起機體氧化應激損傷[12,13]。MDA是脂質過氧化過程中的重要產(chǎn)物,它反映了體內(nèi)脂質過氧化的氧化程度和細胞遭受自由基損傷的程度;SOD為最重要的抗氧化酶之一,有著防止細胞氧化損傷的作用;GSH-PX、CAT能夠間接地反映機體細胞受自由基攻擊的嚴重程度[14,15]。本實驗結果顯示,復方黃芪益氣口服液可顯著降低大鼠肝組織MDA水平,同時顯著提高肝組織CAT、SOD和GSH-PX水平,提示復方黃芪益氣口服液含有抗氧化的活性物質和具有提高體內(nèi)抗氧化酶活力的作用。即復方黃芪益氣口服液可能通過提高大鼠機體的抗氧化能力,發(fā)揮治療AFB1所致肝損傷作用。

綜上所述,復方黃芪益氣口服液能有效抑制AFB1引起的大鼠肝指數(shù)下降,改善肝組織病理性損傷,降低血清ALT、AST、ALP活力及TBIL水平,改善肝組織病理變化,減輕大鼠肝臟脂質過氧化水平,并顯著提高肝臟SOD、CAT及GSH-Px活力。研究結果提示,復方黃芪益氣口服液具有保護肝組織和治療AFB1所致肝損傷的功能。