暴 鵬,李 雪,孫麗莎,張曉冉,楊欣怡,李朝敏

(成都中醫(yī)藥大學附屬醫(yī)院內分泌科,成都 610075;*通訊作者,E-mail:Chenyi2006@163.com)

糖尿病周圍神經病變(diabetic peripheral neuropathy,DPN)指在無其他疾病影響下,糖尿病患者發(fā)生與周圍神經功能病變相關的臨床癥狀和(或)體征,可導致患者感覺、運動以及自主神經功能異常,其中以感覺神經功能障礙最為嚴重[1],患者多表現為雙側肢體感覺功能異常,嚴重者甚至可導致肢體肌肉萎縮[2]。目前,DPN的發(fā)病機制尚未明確,尚缺乏針對性治療方式。劉劍鋼等[3]給予DPN患者補陽還五湯治療,并且與西醫(yī)常規(guī)治療為對照組,研究結果表明中藥方劑治療效果明顯優(yōu)于對照組,且能夠改善患者血液黏滯狀態(tài),提高患者脂質代謝功能,改善周圍神經組織缺血缺氧狀態(tài),提高神經信號傳導。薛鑄等[4]采用黃芪桂枝五物湯治療DPN患者,結果表明能夠有效提高DPN患者的腓總神經傳導。尚無溫陽固本湯治療DPN的相關報道。本研究探討溫陽固本湯對DPN大鼠NGF及BDNF表達、脂代謝和坐骨神經超微結構的影響,明確該方劑對DPN的保護作用及作用機制,為中醫(yī)藥治療DPN提供參考。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

5-6周齡SPF級雄性SD大鼠60只,體質量180-220 g,購自北京維通利華實驗動物技術有限公司(生產許可證:北京百善SCXK(京)2016-0006),飼養(yǎng)于成都中醫(yī)藥大學SPF級動物實驗中心(設施使用許可證號:SCXK(川)2008-Ⅱ),溫度18-26 ℃,相對濕度40%-70%。

1.2 溫陽固本湯

溫陽固本湯方劑為仙靈脾15 g、黃芪15 g、半枝蓮15 g、丹參15 g、茯苓15 g、大黃(熟)10 g,白術10 g、制附子6 g、蘇葉為6 g、熟地3 g、甘草3 g,由成都中醫(yī)藥大學附屬醫(yī)院中藥房提供,水煎濃縮為生藥量1.5 g/ml,分裝后4 ℃保存?zhèn)溆?按各組所需濃度稀釋后用于SD大鼠灌胃。

1.3 主要試劑

鏈脲霉素(STZ)購自華中海威(北京)基因科技有限公司,辣根過氧化物酶標記山羊抗兔IgG和辣根過氧化物酶標記山羊抗小鼠IgG購自碧云天生物技術有限公司,sc-2048 ECL試劑盒購自美國Santa cruz公司,NGF為兔來源的多克隆抗體(美國GeneTex公司),M-MLU反轉錄試劑盒(美國thermoscientific公司),real-time PCR擴增試劑盒購自上海索寶生物科技有限公司,BDNF為兔來源的多克隆抗體購自杭州華安生物技術有限公司,M-MLV反轉錄試劑盒購自solarbio公司,甘油三酯(TG)試劑盒、膽固醇(TC)試劑盒、高密度脂蛋白(HDL-C)試劑盒和低密度脂蛋白(LDL-C)試劑盒購自上海江萊生物科技有限公司。

1.4 糖尿病大鼠模型制備

隨機選取10只大鼠為對照組,其余50只大鼠禁食12 h,腹腔注射檸檬酸鹽緩沖液(pH 4.2)配制的濃度為2%的鏈脲佐菌素(STZ)溶液,按60 mg/kg劑量腹腔注射;對照組大鼠腹腔注射等量檸檬酸鹽緩沖液,腹腔注射造模后72 h,測定大鼠尾尖靜脈血血糖,以多次隨機尾尖血糖值不低于16.7 mmol/L為糖尿病大鼠模型造模成功標準[5]。

1.5 DPN大鼠模型制備

糖尿病大鼠繼續(xù)飼喂維持期飼料4周,腹腔注射10%水合氯醛(0.4 ml/100 g)麻醉大鼠,仰臥位固定。消毒備皮,沿右側腹股溝作為2 cm長切口,鈍性分離肌肉、血管,用動脈夾在腹股溝處夾閉股動脈;再于腹壁正中線作3 cm長切口,鈍性分離肌肉、血管,于髂總動脈右側分支約1 cm處夾閉血管,于髂腰動脈水平下約0.5 cm夾閉腹主動脈。無菌生理鹽水紗布覆蓋傷口,采用紅外燈維持大鼠右后肢環(huán)境溫度為35 ℃。術后第4天恢復右后肢血液供應,逐層縫合肌肉組織和皮膚。無菌輔料覆蓋傷口且注意保持輔料清潔。術后連續(xù)3 d每只大鼠腹腔注射8萬U/d青霉素預防感染。

1.6 分組與處理

手術造模后7 d,待大鼠傷口基本愈合后給予藥物治療。50只DPN模型大鼠隨機分為模型組、陽性對照組、溫陽固本湯低劑量組、溫陽固本湯中劑量組及溫陽固本湯高劑量組,每組10只。參考徐叔云教授主編《藥理實驗方法學》,溫陽固本湯低、中、高劑量組按照成人劑量的6.25倍、12.5倍、25倍分別給予溫陽固本湯9.17 g/kg、18.33 g/kg及36.67 g/kg灌胃,陽性對照組20 mg/kg α-硫辛酸灌胃,對照組和模型組等量生理鹽水灌胃,1次/d,連續(xù)56 d。

1.7 血脂檢測

灌胃8周后,10%水合氯醛按0.4 ml/100 g劑量腹腔注射麻醉大鼠,腹主動脈采血5 ml于含有7.5% EDTA的真空采血管中,4 ℃ 3 000 r/min離心10 min,分離血漿置于-80 ℃?zhèn)溆?。血漿指標均嚴格按照試劑盒說明書檢測。

1.8 坐骨神經超微結構觀察

取血后取大鼠右側后肢坐骨神經約0.5 cm,放入2.5%戊二醛固定,隨后再使用四氧化鋨染色、環(huán)氧樹脂包埋、切片,行電子透射顯微鏡觀察。

1.9 坐骨神經NGF、BDNF檢測

取大鼠后肢坐骨神經置于液氮中保存?zhèn)溆谩?/p>

NGF、BDNF表達水平檢測:將大鼠右側后肢坐骨神經從液氮中取出約0.5 cm,采用免疫組化法檢測大鼠坐骨神經中NGF、BDNF表達水平的檢測,操作過程均嚴格按照免疫組化法說明書操作要求。

NGF、BDNF的mRNA水平檢測：將大鼠右側后肢坐骨神經從液氮中取出，放入預冷的研缽中加入液氮進行快速研磨，然后將粉末裝入預冷的EP管中，每管加入1 ml Trizol，用槍吹打數次，室溫放置5 min。取提取的總RNA 2 μl逆轉錄，反應體系為3 μl RNA、1 μl Oligo(dT)、9.5 μl ddH2O，反應體系先于70 ℃孵育5 min，0 ℃冰水浴后離心加入5 μl 5XBuffer、5 μl dNTP(10 mmol/L)、0.5 μl(Ribonuclease inhibitor)及1 μl M-MLV RT混合液，離心混勻先42 ℃孵育60 min，后70 ℃孵育10 min；冰上分裝，-20 ℃保存cDNA。采用合成的cDNA第一條鏈為模板進行PCR，NGF、BDNF反應條件：預變性94 ℃，2 min，(94 ℃ 15 s；60 ℃ 60 s；72 ℃ 10 min)40個循環(huán)，設立無模板對照和RT陰性對照。

NGF上游引物:5′-CACTCTGAGGTGCATAGCGT-3′,下游引物:5′-GCTTCAGGGACAGAGTCTCC-3′。BDNF上游引物:5′-CTGGATGAGGACCAGAAGGT-3′,下游引物:5′-CAGAAAGAGCAGAGGAGGCT-3′。

1.10 統計學分析

2 結果

2.1 造模結果

對照組SD大鼠無死亡,DPN模型大鼠死亡4只,即模型組死亡3只,溫陽固本湯低劑量組死亡1只,模型大鼠符合要求者進入實驗組,排除RNA提取不合格者,則最終對照組大鼠10只,模型組大鼠6只,溫陽固本湯低劑量組8只,溫陽固本湯中劑量組10只,溫陽固本湯高劑量組9只。

2.2 大鼠血漿TG、TC、LDL-C、HDL-C含量

模型組大鼠血漿TG、TC、LDL-C含量明顯高于對照組,HDL-C低于對照組(P<0.01);溫陽固本湯中、高組血清TG、TC、LDL-C、HDL-C含量均明顯低于模型組(P<0.01);溫陽固本湯低劑量組TG、LDL-C、HDL-C含量均明顯低于模型組(P<0.01);溫陽固本湯低劑量組TC含量低于模型組(P<0.05,見表1)。

表1 大鼠血漿TG、TC、LDL-C、HDL-C含量(mmol/L)

Table 1 Contents of plasma TG, TC, LDL-C and HDL-C in rats after different treatment(mmol/L)

組別TGTCLDL-CHDL-C對照組0.35±0.071.61±0.220.52±0.171.92±0.05模型組2.73±0.85??4.31±2.04??2.77±0.83??0.68±0.08??陽性對照組0.88±0.46##3.48±0.621.06±0.43##1.58±0.16##溫陽固本湯低劑量組0.95±0.56##3.01±0.75#1.21±0.52##1.27±0.12##溫陽固本湯中劑量組0.86±0.45##2.14±0.22##0.81±0.15##1.12±0.12##溫陽固本湯高劑量組0.80±0.12##2.13±0.12##0.60±0.22##1.04±0.09##

與對照組對比,**P<0.01;與模型組對比,#P<0.05,##P<0.01

2.3 大鼠神經NGF、BDNF的表達結果

與對照組對比,模型組NGF、BDNF表達水平明顯降低(P<0.01);陽性對照組NGF水平高于模型組(P<0.05),BDNF水平顯著高于模型組(P<0.01);溫陽固本湯低劑量組BDNF水平顯著高于模型組(P<0.01,見表2);溫陽固本湯中、高劑量組NGF、BDNF表達水平明顯高于模型組,且隨劑量的增加表達水平不斷升高(見圖1,2)。

表2 大鼠坐骨神經NGF、BDNF的表達結果

Table 2 NGF and BDNF expression in sciatic nerves of rats

分組NGF平均光密度值BDNF平均光密度值對照組 99.73±10.61 126.60±28.66模型組 71.00±2.57?? 29.70±11.14??陽性對照組 94.90±22.77# 69.35±15.87##溫陽固本湯低劑量組 63.94±7.18 79.46±16.95##溫陽固本湯中劑量組107.32±18.00## 94.94±3.74##溫陽固本湯高劑量組101.28±13.84## 101.93±7.22##

與對照組對比,**P<0.01;與模型組對比,#P<0.05,##P<0.01

A.對照組;B.模型組;C.陽性對照組;D.低劑量組;E.中劑量組;F.高劑量組圖1 大鼠神經NGF的表達結果 (×400)Figure 1 NGF expression in sciatic nerves of rats by immunohistochemical staining under light microscopy (×400)

2.4 大鼠坐骨神經組織NGF mRNA、BDNF mRNA相對水平

模型組坐骨神經組織NGF mRNA、BDNF mRNA相對水平明顯低于對照組(P<0.01);陽性對照組NGF mRNA表達水平高于模型組(P<0.05),BDNF mRNA明顯高于模型組(P<0.01);溫陽固本湯低、中、高劑量組NGF mRNA、BDNF mRNA相對水平均明顯高于模型組(P<0.01,見表3)。

表3 大鼠坐骨神經組織NGF、BDNF mRNA的相對水平

Table 3 The mRNA expression of NGF and BDNF in sciatic nerve tissue of rats

分組?NGF mRNABDNF mRNA對照組1.17±0.230.91±0.19模型組0.20±0.08??0.22±0.07??陽性對照組0.48±0.20#0.48±0.13##溫陽固本湯低劑量組0.63±0.29##0.56±0.09##溫陽固本湯中劑量組0.99±0.29##0.81±0.12##溫陽固本湯高劑量組0.85±0.27##0.61±0.15##

與對照組對比,**P<0.01;與模型組對比,#P<0.05,##P<0.01

2.5 大鼠坐骨神經超微結構變化

正常組大鼠坐骨神經橫切面圖片顯示神經髓鞘結果致密、完整、均勻,且呈現同心圓樣明暗相間的板層結構,施萬細胞結構完整,核大圓潤,軸索內可見大量神經絲、微絲、微管及線粒體,各結構完整、排列規(guī)則(見圖3A);模型組大鼠坐骨神經橫切面圖片顯示神經髓鞘板層結構分離,各層間排列雜亂,層間可見大量空泡及裂隙,神經軸索萎縮,線粒體結構紊亂,施萬細胞變性壞死(見圖3B);陽性對照組大鼠坐骨神經橫切面圖片顯示神經髓鞘空泡及裂隙數目降低,但板層結構紊亂未緩解,線粒體結構無恢復,鏡下無正常施萬細胞(見圖3C);溫陽固本湯低劑量組和中劑量組大鼠坐骨神經橫切面圖片顯示神經髓鞘空泡及裂隙數目明顯減少,髓鞘板層結構未恢復,鏡下可見結構正常的線粒體、粗面內質網及施萬細胞(見圖3D、E);溫陽固本湯高劑量組神經髓鞘結構恢復正常,且呈現同心圓樣明暗相間的板層結構,鏡下髓鞘空泡及裂隙較少,僅小部分線粒體、微絲、微管結構異常,施萬細胞結構完整(見圖3F)。

A.對照組;B.模型組;C.陽性對照組;D.低劑量組;E.中劑量組;F.高劑量組圖3 大鼠神經組織超微結構 (×8 000)Figure 3 Ultrastructure of nerve tissues in rats (×8 000)

3 討論

DPN為糖尿病患者最為多見的慢性并發(fā)癥之一,在糖尿病患者中具有較高的發(fā)病率和致殘率?！吨袊悄虿∩窠洸∽冊\療規(guī)范》(2009年)表明:確診為糖尿病的患者在其10年病程中,神經系統可隨病程的不斷增加出現不同程度的病變[6],對糖尿病患者的生活質量及預后造成嚴重危害。因此,尋找有效的防治措施對DPN患者或高?；颊呔哂兄匾獌r值,也是現階段內分泌領域研究的熱點問題。

高血糖為DPN發(fā)生的核心環(huán)節(jié),但對其發(fā)病機制尚未明確,研究認為DPN與糖脂代謝紊亂、氧化應激、神經因子缺乏及免疫功能異常等因素有關。美國糖尿病協會(American Diabetes Association,ADA)(2001年)大會McGarry提出DPN發(fā)病的“脂毒性”學說,該學說認為脂代謝異常是導致糖尿病及其并發(fā)癥病理生理學改變的主要原因[7]。本研究結果表明,模型組大鼠血清TG、TC、LDL-C含量明顯高于對照組,HDL-C低于對照組(P<0.01);溫陽固本湯中、高組血清TG、TC、LDL-C、HDL-C含量均明顯低于模型組(P<0.01);溫陽固本湯低劑量組TG、LDL-C、HDL-C含量均明顯低于模型組(P<0.01);溫陽固本湯低劑量組TC含量低于模型組(P<0.05)。結果表明神經組織發(fā)生脂代謝異常時,對神經細胞及其結構和功能可能造成直接或間接影響。與對照組相比,模型組大鼠坐骨神經細胞的髓鞘、軸索均出現損傷,溫陽固本湯各劑量組對髓鞘、軸索均有修復作用,但以高劑量組效果最好。有研究發(fā)現,高脂血癥可導致機體細胞變性和促進血小板聚集,降低血液流速,從而導致微血管血栓的形成,引起神經細胞供血、供氧障礙,從而對神經細胞的結構和功能造成直接破壞[8]。大量研究發(fā)現,機體脂代謝功能紊亂,脂質過氧化物水平升高,從而促進ROS的大量產生,引起機體的氧化應激反應。神經細胞內膜氧化應激產生的ROS對神經組織具有直接損傷作用;ROS為一種氧化應激信號分子,ROS水平異常可刺激細胞內一系列氧化應激信號通路的激活,從而通過直接或間接作用,引起神經細胞的功能異常、微循環(huán)障礙等,使神經細胞或組織功能受損及缺乏營養(yǎng)支持引起神經細胞的壞死或凋亡,從而導致DPN[9-12]。Cameron等[13]研究發(fā)現,糖尿病患者血漿中LDL-C可被AGES修飾,形成為晚期糖基化終產物修飾的低密度脂蛋白(advance glycation end product of low density lipoprotein,AGE-LDL),AGE-LDL被吞噬細胞吞噬后可于血管壁聚集,并相互交聯形成為分子量更大的AGEs,促進血管病變的進展。Tesfaye等[14]研究發(fā)現,糖化血紅蛋白和LDL-C長期持續(xù)處于高水平狀態(tài),可導致糖尿病患者DPN發(fā)病率增加,提前發(fā)病時間。

NGF和BDNF為神經營養(yǎng)因子。NGF為多肽類物質,主要分布于交感神經元和部分感覺神經元分布的區(qū)域內的組織細胞,具有維持交感和感覺神經功能的作用;BDNF為腦源性神經營養(yǎng)因子,該因子主要由神經元細胞合成分泌,對神經細胞的分化、生長及維持神經元功能具有重要作用。Kobayashi等[15]對糖尿病患者血漿中樞神經營養(yǎng)因子特別是NGF研究發(fā)現,NGF缺乏為DPN發(fā)生的主要危險因素之一。高妍等[16]對糖尿病患者應用鼠神經生長因子聯合胰島素泵后血清Cys-C水平變化研究發(fā)現,NGF對周圍神經具有顯著的保護作用,且對感覺神經也具有較好的營養(yǎng)作用。Nitta等[17]和呂翠巖等[18]研究發(fā)現,糖尿病大鼠腦組織及坐骨神經中BDNF mRNA表達水平降低,同時還發(fā)現該因子受體和促進該因子分泌的NGF mRNA表達水平顯著降低。Li等[19]對糖尿病大鼠進行研究,發(fā)現給予外源性BDNF能夠有效降低體質量和血糖水平。沈祥峰等[20]對糖尿病大鼠給予不同濃度的運脾和絡顆粒灌胃干預,結果表明高糖條件下周圍神經組織中的BDNF表達水平降低,使得受損神經纖維的修復明顯減緩。本研究采用免疫組織化學法和real-time PCR法檢測大鼠坐骨神經組織中NGF、BDNF、NGF mRNA和BDNF mRNA的表達水平,研究結果表明,大鼠坐骨神經組織中的NGF、BDNF、NGF mRNA和BDNF mRNA表達水平均存在顯著降低,中藥方劑溫陽固本湯能夠有效提高DPN大鼠NGF、BDNF、NGF mRNA和BDNF mRNA的表達。由此說明,中藥方劑溫陽固本湯對DPN的保護作用可能與促進NGF、BDNF、NGF mRNA和BDNF mRNA的表達有關。

綜上所述,中藥方劑溫陽固本湯可降低DPN大鼠血脂水平,促進NGF、BDNF、NGF mRNA和BDNF mRNA的表達,該方劑對糖尿病周圍神經的保護作用可能是通過降低血脂水平,增加NGF、BDNF、NGF mRNA和BDNF mRNA表達量有關。