王紅琳,陳亞萍

(復(fù)旦大學(xué)附屬上海市第五人民醫(yī)院婦產(chǎn)科,上海 200240;*通訊作者,E-mail:honglin.wang@163.com)

妊娠期高血壓是女性在妊娠期易發(fā)的一種妊娠期并發(fā)癥。統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)顯示,妊娠期高血壓在我國(guó)的發(fā)病率為9.4%[1],是主要的妊娠期并發(fā)癥,容易造成患者子癇、抽搐、昏迷等癥狀,嚴(yán)重威脅了母嬰健康,但其發(fā)病機(jī)制目前尚不明確[2-5]。因此,研究妊娠期高血壓的發(fā)病機(jī)制,發(fā)現(xiàn)早期診斷和治療的方法,具有重要的臨床意義。一般認(rèn)為,高血壓的發(fā)病受到環(huán)境因素和遺傳因素等多重因素的影響,有研究表明,表觀遺傳學(xué)在高血壓發(fā)病過程中起到了非常重要的作用[6-10]。表觀遺傳學(xué)機(jī)制包括:組蛋白修飾、DNA甲基化、及非編碼RNA。環(huán)狀RNA(circRNA)作為一種新型的非編碼RNA,廣泛存在于動(dòng)植物細(xì)胞中,作為microRNAs海綿、RNA結(jié)合蛋白螯合劑以及核轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子發(fā)揮作用[11-13],參與調(diào)控基因表達(dá)[14,15]。根據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道,circRNA參與多種疾病的發(fā)生發(fā)展[16-19],但目前對(duì)于circRNA在妊娠期高血壓疾病中的作用知之甚少。本研究中通過使用circRNA芯片技術(shù)研究妊娠高血壓患者以及正常對(duì)照者血漿中circRNA的差異表達(dá),初步建立妊娠高血壓患者血漿circRNA的表達(dá)譜,然后擴(kuò)大樣本量,在妊娠高血壓患者與正常對(duì)照組中對(duì)差異表達(dá)的circRNAs進(jìn)行RT-qPCR驗(yàn)證,為研究circRNA在妊娠期高血壓發(fā)生發(fā)展中所扮演的角色奠定理論基礎(chǔ)。

1 資料和方法

1.1 一般資料

選擇2016-06～2018-06在我院分娩的妊娠期高血壓疾病產(chǎn)婦,符合《婦產(chǎn)科學(xué)》診斷標(biāo)準(zhǔn)[20]。選取重度子癇前期和輕度子癇前期孕婦各33例作為觀察組,選取33例正常孕婦作為對(duì)照組。每組隨機(jī)選取3例對(duì)其血樣本中circRNA行芯片篩選并對(duì)照分析,其余標(biāo)本用于RT-qPCR驗(yàn)證。按以下標(biāo)準(zhǔn)篩選標(biāo)準(zhǔn):①輕度子癇前期組:收縮壓≥140 mmHg或舒張壓≥90 mmHg,24 h蛋白尿≥300 mg,定性1+;②重度子癇前期組:收縮壓≥160 mmHg或舒張壓≥110 mmHg,24 h蛋白尿≥5.0 g,定性3+。排除心、肝、腎臟疾病以及糖尿病、雙胎、腫瘤、出血性疾病以及其他血栓疾病史的患者。所有孕婦年齡20-35歲,平均(28.3±3.6)歲;孕周為(37±2.4)周。

1.2 研究方法

1.2.1 RNA提取檢測(cè)及circRNA芯片篩選 使用適用于EVs內(nèi)RNA提取的商品化試劑盒從患者血樣本中提取總RNA,并對(duì)RNA的量和質(zhì)量進(jìn)行評(píng)估;根據(jù)Arraystar Super RNA Labeling(Arraystar,Inc.)試劑盒操作說(shuō)明書,將總RNA采用隨機(jī)引物擴(kuò)增、反轉(zhuǎn)錄為熒光標(biāo)記的cRNA;熒光標(biāo)記的cRNAs在Arraystar circRNA Array上雜交,隨后在Agilent Hybridization Oven上65 ℃孵育17 h;洗片后,在Axon GenePix 4000B掃描儀上掃描。

RNA的抽提與純化:采用PAXgene Blood miRNA Kit(Cat#763134,QIAGEN,GmBH,Germany)并且根據(jù)生產(chǎn)廠商提供的標(biāo)準(zhǔn)操作流程進(jìn)行樣品的總RNA抽提,抽提所得總RNA經(jīng)Agilent Bioanalyzer 2100(Agilent technologies,Santa Clara,CA,US)電泳質(zhì)檢合格后備用。

RNA質(zhì)檢說(shuō)明:芯片實(shí)驗(yàn)起始樣本為總RNA,總RNA經(jīng)NanoDrop ND-2000分光光度計(jì)及Agilent Bioanalyzer 2100(Agilent technologies,Santa Clara,CA,US)進(jìn)行質(zhì)檢,質(zhì)檢合格的RNA可進(jìn)行后續(xù)的芯片實(shí)驗(yàn)。

RNA的放大和標(biāo)記:實(shí)驗(yàn)樣品RNA采用Agilent表達(dá)譜芯片配套試劑盒,Low Input Quick Amp WT Labeling Kit(Agilent technologies,Santa Clara,CA,US)和標(biāo)準(zhǔn)操作流程對(duì)樣品總RNA進(jìn)行放大和標(biāo)記,并用RNeasy mini kit(QIAGEN,GmBH,Germany)純化標(biāo)記后的cRNA。

芯片雜交:按照Agilent表達(dá)譜芯片配套提供的雜交標(biāo)準(zhǔn)流程和配套試劑盒,Gene Expression Hybridization Kit(Agilent technologies,Santa Clara,CA,US),在滾動(dòng)雜交爐Hybridization Oven(Agilent technologies,Santa Clara,CA,US)中65 ℃,10 r/min,滾動(dòng)雜交17 h,雜交cRNA上樣量1.65 μg,并在洗缸staining dishes(Thermo Shandon,Waltham,MA,US)中洗片,洗片所用的試劑為Gene Expression Wash Buffer Kit(Agilent technologies,Santa Clara,CA,US)。

芯片掃描:完成雜交的芯片采用Agilent Microarray Scanner(Agilent technologies,Santa Clara,CA,US)進(jìn)行掃描,軟件設(shè)置Dye channel:Green,Scan resolution=3 μm,PMT 100%,20 bit。用Feature Extraction software 10.7(Agilent technologies,Santa Clara,CA,US)讀取數(shù)據(jù),最后采用R軟件中l(wèi)imma包進(jìn)行歸一化處理,所用的算法為Quantile。篩選差異基因的標(biāo)準(zhǔn)是fold change≥2或fold change≤0.5。

1.2.2 逆轉(zhuǎn)錄cDNA的合成 在Microtube管中加入2 μg的RNA,1 μl的Primer Mix,用RNase-free water補(bǔ)足體積至15 μl。在70 ℃保溫5 min,然后迅速置于冰上5 min。離心數(shù)秒使上述溶液聚集于管底部,加入5 μl的5×buffer,2 mmol/L dNTPs 6.25 μl,M-MLV1μl,RNase-free water 12.75 μl,42 ℃保溫60 min,即可獲得cDNA。

1.2.3 PCR擴(kuò)增反應(yīng)驗(yàn)證差異表達(dá)的circRNAs 從芯片檢測(cè)結(jié)果中差異表達(dá)的circRNAs中根據(jù)差異顯著性和通路兩方面選取4個(gè)circRNAs進(jìn)行驗(yàn)證。

配制PCR反應(yīng)液:2 mmol/L dNTPs 4 μl、前引物1 μl、后引物1 μl、MgSO40.8 μl、C3H8O32 μl、10×KOD buffer 2 μl,體積總量為20 μl,PCR擴(kuò)增引物見表1。

表1 PCR擴(kuò)增引物序列

Table 1 Primer sequences for the PCR amplification

基因名稱 引物序列(5′-3′) hsa-circ-0039342F:TTCAACTCCTTCCGCCTCCGR:CAGCTGCCATGTACGTGCTG hsa-circ-0054441F:AAACGTTATTGTGCCAAATGTACTGTR:TCGGGAGCGCTGAATCTGAA hsa-circ-0003171F:ACCTCAGCTAGTGACGTATGGAR:TCTCTCACGCTGTCCGAAGT hsa-circ-0085752F:AATCCAGCTTTGGCGGTTGCR:GGTCAAGGTAAGCAGCTGCC GAPDHF:CGCTCTCTGCTCCTCCTGTTCR:ATCCGTTGACTCCGACCTTCAC

反應(yīng)條件:熱變性94 ℃ 5 min,變性94 ℃ 20 s,退火60 ℃ 30 s,延伸68 ℃ 30 s,循環(huán)35-45次,最后延伸68 ℃ 10 min。反應(yīng)結(jié)束后確認(rèn)擴(kuò)增曲線和溶解曲線。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

運(yùn)用統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件SPSS17.0對(duì)circRNAs內(nèi)參基因表達(dá)量進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析,對(duì)所獲得數(shù)據(jù)進(jìn)行正態(tài)分布檢驗(yàn),如若符合正態(tài)分布就采用t檢驗(yàn),否則采用秩和檢驗(yàn)。P<0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 RNA質(zhì)檢結(jié)果

用于芯片檢測(cè)的三組共9個(gè)樣品的RNA都進(jìn)行了嚴(yán)格的質(zhì)檢,進(jìn)行高通量檢測(cè)的RNA質(zhì)量合格,AI表示RNA質(zhì)量合格。結(jié)果見表2。

表2 RNA質(zhì)檢結(jié)果

Table 2 Results of the RNA test

分組樣品濃度(μg/μl)體積(μl)總量(μg)A260/A280RIN28S/18S結(jié)果正常組1260.47519.532.147.71.0A12194.57514.592.178.41.4AI3227.97517.092.158.31.3AI輕度子癇前期組1107.3758.052.187.81.1AI2262.97519.722.107.00.7AI3168.37512.622.177.91.1AI重度子癇前期組1117758.782.197.40.7AI2132.1759.912.188.61.4AI3139.77510.482.178.41.2AI

2.2 統(tǒng)計(jì)學(xué)結(jié)果分析

circRNA芯片一共檢測(cè)到超過88 000個(gè)表達(dá)的circRNA,其中在輕度子癇前期-正常樣本組、重度子癇前期-正常樣本組、重度子癇前期-輕度子癇前期組樣本組間分別有1 075(其中上調(diào)279,下調(diào)796)、1 747(其中上調(diào)396,下調(diào)1351)、1 426(其中上調(diào)428,下調(diào)998)個(gè)circRNA表達(dá)差異(見表3、圖1)。輕度子癇前期和重度子癇前期與正常樣本有316個(gè)共同的差異circRNA,這些circRNA很可能與妊娠期高血壓的發(fā)生有關(guān)。

表3 各組間樣本差異表達(dá)circRNA(個(gè))

Table 3 Differentially expressed circRNA between different groups(numbers)

組別 差異表達(dá)基因下調(diào)基因上調(diào)基因輕度子癇前期與正常組1075796279重度子癇前期與正常組17471351396重度子癇前期與輕度子癇前期1426998428

2.3 生物信息學(xué)結(jié)果分析

對(duì)芯片檢測(cè)的差異circRNA的親本基因做KEGG富集分析,三個(gè)比較組的下調(diào)基因富集在“黏著斑通路”(P<2.66×10-5,P<2.78×10-9,P<1.36×10-7)(見圖2);重度子癇前期-正常組、重度子癇前期-輕度子癇前期組下調(diào)的基因富集在“HPV感染通路”(P<3.46×10-7,P<3.08×10-5)。GO通路分析顯示hsa-circ-0039342(ADCY7),hsa-circ-0003171(PTK2),hsa-circ-0085752(PTK2)的親本基因都作用于“鈣信號(hào)通路”,“趨化因子信號(hào)通路”和“GnRH信號(hào)通路”,并且這3個(gè)circRNA都是下調(diào)的。

2.4 實(shí)時(shí)定量PCR法驗(yàn)證差異表達(dá)的circRNA

從芯片檢測(cè)結(jié)果中差異表達(dá)的circRNAs中根據(jù)差異顯著性和通路兩方面來(lái)選取4個(gè)circRNAs進(jìn)行驗(yàn)證,驗(yàn)證結(jié)果顯示有3個(gè)circRNAs表達(dá)下調(diào),有1個(gè)circRNA表達(dá)上調(diào)。與circRNA測(cè)序結(jié)果一致。每個(gè)樣品的上樣量都是2 μl,結(jié)果見表4。

紅色表示fold change>2,綠色代表fold change<0.5圖1 circRNA表達(dá)分布圖Figure 1 The distributions of the circRNA expressions in different groups

A.輕度子癇前期vs正常組 B.重度子癇前期組vs正常組 C.重度子癇前期組vs輕度子癇前期組圖2 circRNA親本基因在通路上富集情況Figure 2 The significant enrichment of the parental genes of differentially expressed circRNA

表4 實(shí)時(shí)定量PCR法驗(yàn)證差異表達(dá)的circRNAs

Table 4 The fold changes of differentially expressed circRNAs by real-time quantitative PCR

circRNA編號(hào)表達(dá)的差異倍數(shù)上調(diào)/下調(diào)宿主基因hsa-circ-00393420.003092085下調(diào)ADCY7hsa-circ-00544413.297850772上調(diào)PRKCEhsa-circ-00031710.043062584下調(diào)PTK2hsa-circ-00857520.173169147下調(diào)PTK2

3 討論

circRNA在妊娠期高血壓發(fā)生發(fā)展過程中發(fā)揮了內(nèi)源性競(jìng)爭(zhēng)的作用,即病程的加重與circRNA的下調(diào)存在一定的相關(guān)性。本研究中輕度子癇前期組與正常組相比,重度子癇前期組與輕度子癇前期組相比,circRNA都是呈現(xiàn)上調(diào)趨勢(shì),通過對(duì)下調(diào)circRNA進(jìn)行KEGG通路分析,我們發(fā)現(xiàn),下調(diào)circRNA的親本基因都顯著富集在黏著斑通路上,說(shuō)明該通路可能與妊娠期高血壓的疾病發(fā)生和病程發(fā)展密切相關(guān)。Heimrath等[21]研究表明,在子癇前期的發(fā)生中,黏附分子在活化內(nèi)皮細(xì)胞上的表達(dá)增強(qiáng)了炎癥過程,并進(jìn)一步導(dǎo)致內(nèi)皮損傷。一些激活和損傷內(nèi)皮細(xì)胞的因素可能具有重要意義。

選取不同病程的妊娠期高血壓患者,通過進(jìn)行差異性基因及通路分析發(fā)現(xiàn),HPV通路和妊娠期高血壓有著極顯著的關(guān)聯(lián)性。檢索相關(guān)文獻(xiàn),溫海燕等[22]收集了102例子癇前期和對(duì)照病人,比較了兩組病人的HPV感染情況，發(fā)現(xiàn)高危型HPV感染陽(yáng)性的孕婦和子癇有著顯著的正相關(guān)性(r=0.572,P=0.014),徐文等[23]用Meta分析的方法,收集了2017年12月19日前相關(guān)的12篇公開發(fā)表的文獻(xiàn),統(tǒng)計(jì)分析高危型HPV病毒是否會(huì)導(dǎo)致不良的妊娠結(jié)局,同時(shí)分析了對(duì)子癇前期的影響,結(jié)果也證實(shí)了有統(tǒng)計(jì)相關(guān)性。本課題研究結(jié)果中,重度組與輕度子癇前期及正常組的KEGG信號(hào)通路分析顯示:差異circRNA的親本基因顯著富集在HPV感染相關(guān)的通路上,妊娠期高血壓患者可能與HPV感染存在強(qiáng)烈的相關(guān)性,這與之前的文獻(xiàn)研究是相符的[22]。也提示著我們可以進(jìn)一步研究探討其分子機(jī)制。

因此,本文通過對(duì)妊娠期高血壓患者血樣標(biāo)本進(jìn)行生物芯片的檢測(cè)和分析,得出結(jié)論:circRNA(hsa-circ-0039342、hsa-circ-0054441、hsa-circ-0003171和hsa-circ-0085752)在妊娠期高血壓病程發(fā)展中起著重要作用,而且妊娠期高血壓發(fā)病可能與HPV的感染及黏著斑通路相關(guān)。當(dāng)然,本次的臨床試驗(yàn)數(shù)據(jù)還不足以判斷circRNA的表達(dá)情況同妊娠期高血壓之間關(guān)系存在的規(guī)律和機(jī)制,但是,對(duì)于妊娠期高血壓的病程發(fā)生以及臨床上的預(yù)防和治療研究有一定的參考價(jià)值。