徐占成，唐清蘭，徐姿靜，劉孟華，邱 雪

（四川劍南春集團(tuán)有限責(zé)任公司，四川綿竹 618200）

中國(guó)白酒界有這樣一個(gè)亙古不變的道理：“千年老窖萬(wàn)年糟，酒好需得窖池老”。泥窖是濃香型白酒的發(fā)酵容器，也是濃香型白酒區(qū)別于其他酒類重要的物質(zhì)性標(biāo)簽之一。劍南春傳承“泥窖純糧固態(tài)發(fā)酵”技藝，特別依托于其獨(dú)有的老窖窖池。老窖池中富含釀酒特殊功能微生物菌群和微量元素，每一輪投入釀酒的糧食，都是窖池的一次新生，隨著歲月的增長(zhǎng)，這些物質(zhì)不斷向窖池深處繁殖滲透，滋養(yǎng)著窖池。劍南春“天益老號(hào)”千年活窖群，經(jīng)過(guò)1500年的自然淘汰、馴化、優(yōu)選形成一個(gè)特定的微生物菌系，賦予了劍南春芳香優(yōu)雅、綿柔甘洌的典型滋味特色。對(duì)于濃香型白酒企業(yè)而言，釀酒發(fā)酵窖池窖泥功能微生物的相對(duì)豐度直接決定產(chǎn)品優(yōu)級(jí)品率的高低。因此利用現(xiàn)代生物技術(shù)解析窖泥微生態(tài)系統(tǒng)多樣性特征，在優(yōu)質(zhì)老窖泥中選育窖泥功能微生物應(yīng)用于釀酒生產(chǎn)，對(duì)新窖老熟及窖池養(yǎng)護(hù)具有重大的現(xiàn)實(shí)意義。

1 材料與方法

1.1 材料

窖泥樣品：劍南春股份有限公司各釀酒車間，窖齡為2年、5年、10年、20年以及50年以上。

1.2 窖泥微生物群落結(jié)構(gòu)

1.2.1 窖泥總RNA提取

窖泥樣品按10 cm2/mL 加Trizol 后，于室溫放置5 min，使其充分裂解。12000 r/min 離心5 min，棄沉淀。按200 μ L 氯仿/mL Trizol 加入氯仿，振蕩混勻15 min，室溫放置15 min。4 ℃、12000 r/min離心15 min。吸取上層水相，至另一離心管中，按0.5 mL 異丙醇/mL Trizol 加入異丙醇混勻，室溫放置5～10 min，4 ℃、12000 r/min 離心10 min，棄上清，RNA 沉于管底。按1 mL 75 %vol 乙醇/mL Trizol 加入75%vol 乙醇，溫和振蕩離心管，懸浮沉淀。4 ℃、8000 r/min 離心5 min，盡量棄上清液。室溫晾干或真空干燥5～10 min?？捎?0 μ L H2O溶解RNA 樣品。RNA 經(jīng)提取后，經(jīng)富集mRNA、去除rRNA 及反轉(zhuǎn)錄生成cDNA 等過(guò)程，獲取供高通量測(cè)序用的實(shí)驗(yàn)樣品。利用Illumina 的HiSeq2000測(cè)序儀進(jìn)行測(cè)序。測(cè)序工作委托商業(yè)測(cè)序公司完成。

1.2.2 基因組、轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)的處理及生物信息學(xué)分析

基因組數(shù)據(jù)處理包括DNA 片段統(tǒng)計(jì)和拼接、生物信息解釋、基因表達(dá)分析(RNA-Seq)等。宏基因組與轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)放在一起進(jìn)行拼接，以獲得盡可能長(zhǎng)的DNA 重疊組。具體分析過(guò)程如下：①利用Newbler 軟件（454 Life Science）和SOAPdenovo 軟件（http://soap.genomics.org.cn）進(jìn)行基因組的組裝；②與NCBI 的nr/nt 庫(kù)進(jìn)行序列比對(duì)，根據(jù)已知序列定位Contigs 之間的連接順序；③結(jié)合MG-RAST等軟件進(jìn)行生物信息學(xué)數(shù)據(jù)分析。

1.3 窖泥功能微生物選育

1.3.1 窖泥功能微生物分離

培養(yǎng)基配方：乙酸鈉0.5 %，酵母膏0.5 %，K2HPO40.04 %，(NH4)2SO40.05 %，MgSO40.02 %，調(diào)pH6.0～6.5，121 ℃高壓滅菌20 min，冷卻至65 ℃，在無(wú)菌條件下加入2%無(wú)水乙醇。

無(wú)菌條件下取10 g窖泥于裝有90 mL無(wú)菌水并放有玻璃珠的250 mL 三角瓶中，室溫振蕩30 min，于80 ℃水浴中處理10 min，取菌液按10 倍的梯度逐級(jí)稀釋到10-6，取各稀釋度菌液1 mL 于無(wú)菌平皿中，倒入滅菌后冷卻至50 ℃的培養(yǎng)基，混勻，待凝固后放入35 ℃厭氧培養(yǎng)箱培養(yǎng)5～7 d。挑單菌落于液體培養(yǎng)中于35 ℃培養(yǎng)至產(chǎn)氣為止。取發(fā)酵液1 mL于小試管中，加入0.5 mL乙醚和2%硫酸銅溶液1 mL，充分搖勻，靜置分層后，在乙醚層呈現(xiàn)藍(lán)色，即證明有己酸生成。顏色越深，含量越高，共篩選到15 株產(chǎn)己酸能力較高的單菌株，分別命名為F1、F2、F3、F4、F5、F6、F7、F8、F9、F10、F11、F12、F13、F14、F15。

1.3.2 發(fā)酵條件優(yōu)化

選取溫度、發(fā)酵天數(shù)、乙酸鈉和乙醇濃度進(jìn)行4因素3水平設(shè)計(jì)正交實(shí)驗(yàn)，結(jié)果見后表1。

1.3.3 功能微生物定性

（1）菌株16S rDNA序列分析

DNA 提取和PCR 擴(kuò)增，把擴(kuò)增后的片段送往上海生工進(jìn)行測(cè)序分析。

（2）全自動(dòng)微生物鑒定儀鑒定

采用Biolog微生物鑒定儀鑒定，方法如下：

第一步、在Biolog 推薦的培養(yǎng)基上培養(yǎng)微生物：將獲得的純培養(yǎng)菌種接種至Biolog 推薦的培養(yǎng)基BUA+B 上，35 ℃厭氧培養(yǎng)。在BUA+B 上培養(yǎng)兩代。培養(yǎng)時(shí)間為24～48 h。第二步、準(zhǔn)備接種物：使用未接種的含有接種液的干凈接種管調(diào)整濁度儀透光度100 %。用棉簽從瓊脂平板中有細(xì)胞生長(zhǎng)的地方沾取菌落，調(diào)整細(xì)胞濃度到65%T。第三步、接種微孔板：按每孔100 μ L 的量將菌懸液按順序加入微孔板的所有孔中。蓋好微孔板的蓋子。第四步、孵育微孔板：放入?yún)捬豕ぷ髡局信囵B(yǎng)20～24 h。培養(yǎng)溫度35 ℃。讀板，詮釋結(jié)果。

1.4 窖泥功能微生物的應(yīng)用

將功能菌株逐級(jí)擴(kuò)大培養(yǎng)應(yīng)用于人工培養(yǎng)窖泥中，菌株增殖培養(yǎng)工藝流程：純菌株→厭氧管液體培養(yǎng)（一級(jí)種子液）→厭氧瓶液體培養(yǎng)（二級(jí)種子液）→發(fā)酵罐液體厭氧培養(yǎng)（三級(jí)種子液）→成熟功能菌發(fā)酵液→應(yīng)用于生產(chǎn)。

將功能菌發(fā)酵液一部分應(yīng)用于公司擴(kuò)建工程新窖人工培養(yǎng)窖泥的培養(yǎng)工藝中，在窖泥培養(yǎng)過(guò)程中分階段加入一定量功能菌液，添加功能菌液培養(yǎng)成熟的人工窖泥與同批次未添加功能菌液的人工窖泥做對(duì)比分析，同時(shí)對(duì)糊窖后窖池發(fā)酵產(chǎn)酒酒體中己酸乙酯含量進(jìn)行對(duì)比分析。

將功能菌發(fā)酵液一部分添加到糟醅中進(jìn)行強(qiáng)化發(fā)酵，以同批次不添加發(fā)酵液的處理作對(duì)照，最后對(duì)發(fā)酵產(chǎn)酒酒體中己酸乙酯含量進(jìn)行對(duì)比分析。

2 結(jié)果與討論

2.1 窖泥微生物群落結(jié)構(gòu)

2.1.1 門水平下窖泥中的微生物組成

基于功能基因，利用MG-RAST 中的M5NR 數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)其進(jìn)行注釋，在門水平對(duì)不同窖齡窖泥中微生物的種類進(jìn)行分析，其結(jié)果如圖1 所示。對(duì)比結(jié)果表明，2年、5年窖齡窖泥中優(yōu)勢(shì)功能微生物主要分布在厚壁菌門（Firmicutes）、廣古菌門（Euryarchaeota）、擬桿菌門（Bacteroidetes）、變形菌門（Proteobacteria）、放線菌門（Actinbacteria）中，相對(duì)豐度總和均超過(guò)85%；而10年、20年、50年以上窖齡及天益老號(hào)窖泥中優(yōu)勢(shì)功能微生物只分布在厚壁菌門（Firmicutes）、廣古菌門（Euryarchaeota）、擬桿菌門（Bacteroidetes）中，相對(duì)豐度總和超過(guò)80%。

圖1 窖泥樣品微生物組成（門水平）

其中，厚壁菌門（Firmicutes）中的梭菌屬（Clostridium）可對(duì)大分子有機(jī)物進(jìn)行代謝并生成小分子揮發(fā)性有機(jī)酸。在已有研究中，其被認(rèn)為是己酸合成的主要微生物之一。而己酸及己酸乙酯則是酒中風(fēng)味物質(zhì)的主要貢獻(xiàn)者。在所有窖泥樣品中，厚壁菌門（Firmicutes）的相對(duì)豐度在40.6%～45.03%范圍內(nèi)。最大值在2年窖齡窖泥中獲得；最小值在天益老號(hào)窖泥中獲得；隨著窖齡的增加厚壁菌門相對(duì)豐度呈下降趨勢(shì)，10年后趨于穩(wěn)定。不同窖齡窖池中該類微生物的相對(duì)豐度差異并不顯著。

廣古菌門（Euryarchaeota）包含了古菌中的大多數(shù)種類，其中包括產(chǎn)甲烷菌。在窖池這一厭氧環(huán)境中，甲烷菌的廣泛分布已有較多報(bào)道。從廣古菌門（Euryarchaeota）的相對(duì)豐度值分析，其變化范圍介于22.5 %～26.32 %之間。其中，天益老號(hào)窖泥中，該類微生物的相對(duì)豐度最低；而在2年窖齡窖泥中，廣古菌門（Euryarchaeota）則獲得了最高的相對(duì)豐度值；隨著窖齡的增加，廣古菌門相對(duì)豐度呈下降趨勢(shì)，10年后趨于穩(wěn)定。不同窖齡窖泥中該類微生物的相對(duì)豐度并無(wú)顯著差異。

擬桿菌門（Bacteroidetes）包含了擬桿菌綱、黃桿菌綱及鞘脂桿菌綱三大類細(xì)菌。窖池中的擬桿菌屬和噬胞菌屬，可以降解纖維素，為其他微生物提供能源。擬桿菌門（Bacteroidetes）的相對(duì)豐度值變化范圍介于6.50%～15.85%之間。其中，2年窖齡窖泥中，該類微生物的相對(duì)豐度最低；而在20年及以上窖齡窖泥中，擬桿菌門（Bacteroidetes）則獲得了最高的相對(duì)豐度值；隨著窖齡的增加擬桿菌門相對(duì)豐度呈上升趨勢(shì)，10年后趨于穩(wěn)定。

變形菌門（Proteobacteria）是一類外膜主要由脂多糖組成的革蘭氏陰性菌，大多數(shù)具有固氮能力，兼性或?qū)Ｐ詤捬酢Ｗ冃尉T在窖齡短的窖泥中所占的相對(duì)豐度值較高，2年窖齡中其相對(duì)豐度值達(dá)3.40%，5年窖齡其相對(duì)豐度值為3.01%。

放線菌門（Actinbacteria）是原核生物中的一個(gè)類群，是一類革蘭氏陽(yáng)性細(xì)菌。因其菌落呈放射狀而得名。大多有基內(nèi)菌絲和氣生菌絲，少數(shù)無(wú)氣生菌絲，多數(shù)產(chǎn)生分生孢子，有些形成孢囊和孢囊孢子。大多數(shù)為好氧，可以產(chǎn)生抗生素。放線菌門（Actinbacteria）在窖齡短的窖泥中所占的相對(duì)豐度值較高，在2～5年窖齡窖泥中其相對(duì)豐度值為3 %～4 %，而在10年以上窖齡窖泥中其相對(duì)豐度值下降到1.2%左右?；诠δ芑虻娜郝浞治霰砻?，不同窖齡窖池內(nèi)的優(yōu)勢(shì)微生物，在門水平上，其相對(duì)豐度并無(wú)顯著差別。

2.1.2 屬水平下窖泥中的微生物組成（圖2）

圖2 窖泥樣品微生物組成（屬水平）

基于功能基因，利用MG-RAST 中的M5NR 數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)其在屬水平進(jìn)行注釋，不同窖齡窖泥中微生物的種類分析結(jié)果如圖2。根據(jù)各屬的相對(duì)豐度值，選擇數(shù)值最高的前10 類微生物進(jìn)行展示，分別為：梭菌屬（Clostridium）、甲烷囊菌屬（Methanoculleus）、擬桿菌屬（Bacteroides）、乳酸桿菌屬（Lactobacillus）、甲烷八疊球菌屬（Methanosarcina）、紫單胞菌屬（Parabacteroides）、互營(yíng)單胞菌屬（Syntrophomonas）、芽孢桿菌屬（Bacillus）、真桿菌屬（Eubacterium）和一種產(chǎn)氫細(xì)菌（Ethanoligenens）。

梭菌屬（Clostridium）是一類能形成芽孢、厭氧生長(zhǎng)的革蘭氏陽(yáng)性菌，它們可對(duì)大分子有機(jī)物進(jìn)行代謝并生成小分子揮發(fā)性有機(jī)酸。在已有研究中，其被認(rèn)為是己酸合成的主要微生物之一。在所檢測(cè)窖泥樣品中，梭菌屬的相對(duì)豐度在5.32 %～13.26%范圍內(nèi)變化。其中，最小值在2年窖齡窖泥中獲得；最大值則在50年及以上窖齡窖泥中獲得。隨著窖齡的增加，梭菌屬相對(duì)豐度值呈增長(zhǎng)趨勢(shì)，10年后趨于穩(wěn)定。10年以上窖泥梭菌屬相對(duì)豐度值為2年的2.31倍，為5年的1.46倍。

甲烷囊菌屬（Methanoculleus）是產(chǎn)甲烷微生物，以二氧化碳為底物，通過(guò)氫營(yíng)養(yǎng)途徑進(jìn)行甲烷的合成；但是該類產(chǎn)甲烷菌不能以乙酸為底物，通過(guò)乙酸營(yíng)養(yǎng)途徑進(jìn)行甲烷合成。在所有樣品中，甲烷囊菌屬（Methanoculleus）的相對(duì)豐度值介于9.75 %～13.55 %之間。最小值在天益老號(hào)窖泥中獲得，最大值在5年窖齡窖泥中獲得。隨著窖齡的增加，甲烷囊菌屬相對(duì)豐度值呈下降趨勢(shì)。

擬桿菌屬（Bacteroides）是一類革蘭氏染色陰性菌，無(wú)芽孢，專性厭氧。該類微生物可代謝大分子有機(jī)物，產(chǎn)生乙酸、丁酸等有機(jī)酸。在所分析窖泥樣品中，該類微生物的相對(duì)豐度值介于5.56%～6.17 %之間。不同窖齡窖泥間的擬桿菌屬（Bacteroides）相對(duì)豐度差異極小。

乳酸桿菌屬（Lactobacillus）是一群桿狀的革蘭氏陽(yáng)性菌，它們能把碳水化合物（主要指葡萄糖）發(fā)酵成乳酸。釀酒微生物可以利用乳酸為底物進(jìn)行其他物質(zhì)的生物合成，如丙酸菌可以利用乳酸產(chǎn)生丙酸，丁酸菌利用乳酸為碳源生成丁酸，己酸菌利用乳酸為碳源生成己酸，乳酸通過(guò)酯化反應(yīng)生成乳酸乙酯，丁酸可進(jìn)一步生成丁酸乙酯，己酸可進(jìn)一步生成己酸乙酯等。乳酸菌在釀酒中還發(fā)揮代謝活性作用，能直接為其他微生物提供生長(zhǎng)繁殖可利用的必需氨基酸和各種維生素，還能提高礦物元素的生物學(xué)活性，為固態(tài)法白酒發(fā)酵微生物提供必需的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，促進(jìn)釀酒微生物的生長(zhǎng)繁殖。在所分析窖泥樣品中，乳酸桿菌屬的相對(duì)豐度值介于5.41 %～8.11 %之間。其中，最小值由2年窖齡窖泥獲得；最大值由天益老號(hào)窖泥獲得；隨著窖齡的增加，乳酸桿菌屬的相對(duì)豐度值呈增加趨勢(shì)。

甲烷八疊球菌屬（Methanosarcina）也是一種產(chǎn)甲烷古菌，其既可利用二氧化碳為底物，通過(guò)氫營(yíng)養(yǎng)途徑進(jìn)行甲烷的合成；也可以乙酸為底物，通過(guò)乙酸營(yíng)養(yǎng)途徑進(jìn)行甲烷合成。在各年窖齡窖泥中，甲烷八疊球菌屬（Methanosarcina）的相對(duì)豐度分別為2年0.28 %、5年0.48 %、10年5.18 %、20年5.25%、50年5.30%、天益老號(hào)5.35%；隨窖齡的增加呈增長(zhǎng)趨勢(shì)。經(jīng)方差分析發(fā)現(xiàn)，不同窖齡窖泥間，甲烷八疊球菌屬（Methanosarcina）的相對(duì)豐度值具有顯著差異（p＜0.05）?；谝酝芯浚淄榘睡B球菌屬（Methanosarcina）在20年以上窖齡窖泥中是2年窖齡窖泥的18.75 倍以上；是5年窖齡窖泥的11.14倍，其相對(duì)豐度有顯著提升。

甲烷八疊球菌屬（Methanosarcina）為典型小聚集體八疊狀。有時(shí)聚集體為大的胞囊，具有一個(gè)共同的外壁而包裹單獨(dú)的球狀細(xì)胞。該類微生物不產(chǎn)生芽孢。單個(gè)的球形細(xì)胞可能對(duì)去污劑裂解或高滲敏感，無(wú)鞭毛，不可運(yùn)動(dòng)，是一種極端嚴(yán)格厭氧微生物。其最適NaCl 濃度為0.1～0.5 mol/L，中溫菌的最適溫度為30～40 ℃，嗜熱菌的最適溫度為50～55 ℃。該類產(chǎn)甲烷菌可利用乙酸或二氧化碳作為底物進(jìn)行甲烷合成代謝，但從不利用甲酸?？稍谌毖醯暮Ｋ练e物、湖水沉積物或厭氧消化器等體系內(nèi)發(fā)現(xiàn)分離。

在窖泥的微生物代謝網(wǎng)絡(luò)中，微生物將大分子有機(jī)物（纖維素等多糖、蛋白質(zhì)、脂類）分解為小分子有機(jī)酸（如乙酸等）的過(guò)程中，氫氣作為代謝產(chǎn)物會(huì)同時(shí)生成。老窖泥中含有大量甲烷八疊球菌屬（Methanosarcina），這些菌群能利用氫氣、二氧化碳或乙酸產(chǎn)生甲烷，這些物質(zhì)都是釀酒發(fā)酵過(guò)程中的副產(chǎn)物，尤其是氫氣，如果不去除，就會(huì)抑制有益發(fā)酵菌群的生長(zhǎng)。甲烷菌實(shí)際上起到了調(diào)控發(fā)酵過(guò)程的作用，它們將氫氣利用掉，產(chǎn)己酸菌才能正常生長(zhǎng)，而在窖齡較小的窖泥中，由于pH 值較低，會(huì)抑制產(chǎn)甲烷菌的生長(zhǎng)。因此，該菌的存在可有效降低乙酸和氫氣的累積，消除抑制效應(yīng)，使后續(xù)的碳鏈延長(zhǎng)（丁酸、己酸的合成）過(guò)程得以順利實(shí)現(xiàn)。

紫單胞菌屬（Parabacteroides）、互營(yíng)單胞菌屬（Syntrophomonas）、芽孢桿菌屬（Bacillus）、真桿菌屬（Eubacterium）、一種產(chǎn)氫細(xì)菌（Ethanoligenens）在不同窖齡窖泥中的相對(duì)豐度值略小，都呈現(xiàn)新窖池（2～5年）窖泥中相對(duì)豐度值高于老熟窖池（10年及以上）窖泥。紫單胞菌屬（Parabacteroides）能代謝生成丁酸、乙酸等有機(jī)酸類；互營(yíng)單胞菌屬（Syntrophomonas）可通過(guò)與耗氫微生物的共培養(yǎng)而降解熱力學(xué)上難利用的釀酒纖維素等原料；芽孢桿菌屬（Bacillus）能代謝生成丁酸、乳酸類物質(zhì)；真桿菌屬（Eubacterium）能利用葡萄糖或蛋白胨產(chǎn)生丁酸、乙酸或甲酸；產(chǎn)氫細(xì)菌（Ethanoligenens）主要發(fā)酵產(chǎn)物為H2，起調(diào)節(jié)微生物群落代謝平衡作用。

從屬水平多樣性分析發(fā)現(xiàn)，甲烷囊菌屬、互營(yíng)單胞菌屬在新窖池窖泥中明顯高于老窖池窖泥；而梭菌屬、甲烷八疊球菌屬在老窖池窖泥中遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于新窖池窖泥。研究結(jié)果表明，梭菌屬和甲烷八疊球菌屬微生物是窖泥老熟度的標(biāo)志性微生物。

2.2 窖泥功能微生物選育

2.2.1 菌株產(chǎn)己酸發(fā)酵條件優(yōu)化

選取溫度、發(fā)酵時(shí)間、乙酸鈉和乙醇濃度進(jìn)行4因素3水平設(shè)計(jì)正交實(shí)驗(yàn)，實(shí)驗(yàn)結(jié)果見表1。

表1 不同發(fā)酵條件對(duì)菌種產(chǎn)己酸的影響

表1 結(jié)果表明，乙醇濃度對(duì)菌株產(chǎn)己酸影響較大，其次為乙酸鈉濃度。溫度和發(fā)酵時(shí)間影響相對(duì)較小。產(chǎn)己酸的最適條件為：溫度35 ℃，培養(yǎng)時(shí)間15 d為宜，乙醇濃度2%，乙酸鈉濃度1%。

菌株發(fā)酵產(chǎn)己酸優(yōu)化培養(yǎng)基：乙酸鈉1.5%，黃水2%，酵母膏1.0%，葡萄糖0.5%，K2HPO40.05%，(NH4)2SO40.05 %，MgSO40.02 %，pH6.0～6.5，滅菌后加入2 %無(wú)水乙醇。采用優(yōu)化后發(fā)酵培養(yǎng)條件對(duì)15 株代謝己酸的單菌株進(jìn)行產(chǎn)己酸試驗(yàn)。產(chǎn)己酸對(duì)比分析結(jié)果見圖3。

圖3 菌株產(chǎn)己酸量對(duì)比分析圖

從圖3 可知，F(xiàn)6 產(chǎn)己酸能力最強(qiáng)。經(jīng)發(fā)酵工藝的進(jìn)一步優(yōu)化，產(chǎn)己酸能力可達(dá)到18000 mg/L，為此對(duì)F6 菌株進(jìn)行了16S rDNA 基因的序列分析和全自動(dòng)微生物鑒定儀分析。

2.2.2 菌株16S rDNA序列分析

擴(kuò)增后的片段測(cè)序（上海生工測(cè)序），通過(guò)美國(guó)國(guó)家生物技術(shù)信息中心的BLAST 搜索程序，把試驗(yàn)中得到的序列信息與基因庫(kù)中的基因序列進(jìn)行比較而獲得同源性分析結(jié)果（見表2）。

表2 以16 S rDNA序列為基礎(chǔ)各菌株的同源性比對(duì)分析

由表2 可知，該菌株與生孢梭菌、嗜胺梭菌、匙形梭菌和無(wú)害梭菌的同源性均達(dá)到了99 %，需進(jìn)行進(jìn)一步判定。

2.2.3 全自動(dòng)微生物鑒定儀鑒定

采用Biolog 微生物鑒定儀鑒定該菌株結(jié)果見表3。經(jīng)Biolog 微生物鑒定儀鑒定，篩選得到高產(chǎn)己酸的菌株為生孢梭菌。因此，結(jié)合分子和Biolog微生物鑒定儀鑒定結(jié)果，確定菌株為生孢梭菌（Clostridium sporogense）。

該菌株為革蘭氏陽(yáng)性桿菌、產(chǎn)芽孢，次端生。在濕潤(rùn)培養(yǎng)基上，菌落平坦、邊緣擴(kuò)散，呈灰色，表面無(wú)光澤，半透明。生孢梭菌采用FEI QUANTA250掃描電鏡掃描到的形態(tài)結(jié)構(gòu)如圖4。

2.3 窖泥功能微生物的應(yīng)用

圖4 生孢梭菌（Clostridium sporogense）超微形態(tài)圖

2.3.1 功能菌株的培養(yǎng)

將選育的窖泥特殊功能菌株擴(kuò)大培養(yǎng)應(yīng)用于人工窖泥的培養(yǎng)和促進(jìn)新窖老熟。培養(yǎng)成熟后菌液具有純正窖香味，色澤金黃，有懸絲。我們將擴(kuò)大培養(yǎng)的窖泥功能菌液應(yīng)用于人工窖泥的培養(yǎng)和促進(jìn)新窖老熟。具體按照?qǐng)D5所示進(jìn)行培養(yǎng)。

2.3.2 應(yīng)用于人工窖泥的培養(yǎng)（圖6）

采用微生物強(qiáng)化技術(shù)添加功能菌液的人工窖泥培養(yǎng)技術(shù)，所培養(yǎng)的人工窖泥窖香純正，手感柔和，細(xì)膩，黏性好，使成熟窖泥中芽孢桿菌數(shù)提高了50%以上，產(chǎn)己酸能力提高了1倍（表4）。

采用宏基因組技術(shù)檢測(cè)人工窖泥培養(yǎng)技術(shù)優(yōu)化前后生產(chǎn)的成熟人工窖泥微生物多樣性特征，分析結(jié)果顯示：添加窖泥功能菌的成熟人工窖泥微生物種類基本一致，但生產(chǎn)的窖泥老熟度標(biāo)志性微生物梭菌屬提高了1.73 倍，甲烷八疊球菌屬提高了2.04 倍，從窖泥微生物菌落結(jié)構(gòu)和老熟度標(biāo)志性微生物豐度分析已接近5年窖齡水平。

表3 篩選的細(xì)菌鑒定結(jié)果

表4 成熟人工培養(yǎng)窖泥性能對(duì)比分析表

表5 窖池噴淋功能菌液發(fā)酵結(jié)果對(duì)比分析

圖5 人工窖泥的培養(yǎng)流程圖

圖6 人工窖泥樣品微生物組成

2.3.3 應(yīng)用于窖齡較短的窖池淋窖，促進(jìn)新窖泥老熟

將培養(yǎng)成熟的窖泥菌液用酒尾稀釋（1∶50）后噴淋到剛出窖完畢的窖池窖壁（窖齡約5年），裝入糧醅進(jìn)行發(fā)酵，同時(shí)做同期對(duì)比實(shí)驗(yàn)。

釀酒發(fā)酵研究結(jié)果表明，窖泥功能菌液的應(yīng)用，對(duì)出酒率無(wú)顯著影響，酒體中（酒樣為65 %vol～70%vol 的基酒）己酸乙酯含量提高了35%左右，己酸乙酯含量與乳酸乙酯含量比接近2∶1(表5)，達(dá)到濃香型白酒兩大酯最佳比例，酒體感官評(píng)價(jià)：香氣濃郁，味甜厚，尾味凈，未噴淋功能菌的窖池酒體感官評(píng)價(jià)香氣悶，味甜，尾味較凈。所生產(chǎn)的基酒質(zhì)量產(chǎn)品優(yōu)級(jí)品率提高1倍以上。

3 小結(jié)

3.1 基于宏基因組學(xué)-功能基因研究劍南春不同窖齡的窖泥微生物多樣性特征發(fā)現(xiàn)，窖泥微生物主要由細(xì)菌和古菌兩大類構(gòu)成，在門水平上，新窖池窖泥中優(yōu)勢(shì)功能微生物主要分布在厚壁菌門、廣古菌門、擬桿菌門、變形菌門、放線菌門中，相對(duì)豐度總和均超過(guò)85 %；而老窖池窖泥中優(yōu)勢(shì)功能微生物只分布在厚壁菌門、廣古菌門、擬桿菌門中，相對(duì)豐度總和超過(guò)80%。

3.2 從屬水平多樣性分析發(fā)現(xiàn)，甲烷囊菌屬、互營(yíng)單胞菌屬在新窖池窖泥中明顯高于老窖池窖泥；而梭菌屬、甲烷八疊球菌屬在老窖池窖泥中含量遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于新窖池窖泥。研究結(jié)果表明，梭菌屬和甲烷八疊球菌屬微生物是窖泥老熟度的標(biāo)志性微生物。

3.3 在劍南春老窖泥中分離到1 株高產(chǎn)己酸的功能微生物，產(chǎn)己酸能力可達(dá)18000 mg/L，定性為生孢梭菌。

3.4 窖泥功能微生物應(yīng)用于人工窖泥的培養(yǎng)，人工窖泥產(chǎn)己酸能力提高近一倍，酒體中己酸乙酯含量提高了60 %，有效縮短了新窖老熟周期。應(yīng)用于新窖老熟，同樣使得酒體中的己酸乙酯提高了67%，確保濃香型白酒濃郁幽雅的典型風(fēng)味特征，產(chǎn)品優(yōu)級(jí)品率提高了1倍以上。