孫 潔，陳 雨，吳 峰，王津津，陳 兵，鄭曉聰，陶 虹，劉建利，陳書(shū)琨，林慶燕，秦智鋒,

(1.深圳海關(guān)動(dòng)植物檢驗(yàn)檢疫技術(shù)中心，廣東深圳518045；2.深圳市檢驗(yàn)檢疫科學(xué)研究院，廣東深圳518045；3.大連海洋大學(xué)水產(chǎn)與生命學(xué)院，遼寧大連116023；4.清華大學(xué)深圳研究生院，廣東深圳518001)

禽流感病毒(Avian Influenza virus，AIV)為正粘病毒科甲型流感病毒屬，基因組為8條單股負(fù)鏈RNA，可編碼10個(gè)蛋白[1]。 禽流感危害大，變異強(qiáng)，是傳播性很強(qiáng)的傳染病和人獸共患病[2]。免疫層析技術(shù)(Immu-nochromatography assay，ICA)在ELISA技術(shù)、單克隆抗體技術(shù)和新材料技術(shù)基礎(chǔ)上發(fā)展起來(lái)的快速檢測(cè)技術(shù)，由于其操作簡(jiǎn)便、耗時(shí)短而在檢測(cè)領(lǐng)域飛速發(fā)展[3-6]。用量子點(diǎn)替代傳統(tǒng)膠體金標(biāo)記的免疫層析技術(shù)靈敏度高于膠體金標(biāo)記的免疫層析技術(shù)10倍～100倍，目前，基于量子點(diǎn)標(biāo)記技術(shù)的免疫層析技術(shù)已廣泛用于病原體、蛋白標(biāo)志物、核酸等的檢測(cè)[7-8]。本研究應(yīng)用熒光量子點(diǎn)來(lái)代替常規(guī)的酶標(biāo)記物和膠體金作為標(biāo)記材料，建立了H5亞型AIV熒光量子點(diǎn)免疫層析現(xiàn)場(chǎng)檢測(cè)方法(H5-AIV-QD-LFIA)，提高了檢測(cè)的靈敏度，特異性和重復(fù)性。

1 材料與方法

1.1 主要試驗(yàn)材料 AIV H5(Re-1、Re-4、Re-5、Re-6、Re-7、Re-8)亞型、H7亞型、H7N9亞型、H9亞型、豬流感病毒H1N1亞型、H3N2亞型血凝抑制試驗(yàn)抗原、新城疫(NDV)抗原，購(gòu)自哈爾濱獸醫(yī)研究所。傳染性支氣管炎病毒(IBV)、傳染性喉氣管炎(ILTV)、減蛋綜合征病毒76株(EDS-76)、510份泄殖腔/喉棉拭子樣品,均由深圳檢疫局動(dòng)植中心保存；SP2/0-Ag14(簡(jiǎn)稱SP2)骨髓瘤細(xì)胞，禽流感滅活疫苗(H5N2，D7株),購(gòu)自華大基因科技服務(wù)有限公司；重組禽流感病毒H5亞型二價(jià)滅活疫苗(Re-6株+Re-4株)，購(gòu)自廣東永順生物有限公司；禽流感病毒H5亞型二價(jià)滅活疫苗(Re-6株+Re-10株)，購(gòu)自哈爾濱維科生物技術(shù)有限公司。A/Vietnam/1194/2004(H5N1)HA 蛋白(HA-1)、A/bar-headed goose/Qinghai/14/2008(H5N1)HA重組蛋白(HA-2)、A/American green-wingedteal/California/HKWF609/2007(H5N2) HA重組蛋白(HA-3)、A/duck/NY/191255-59/2002(H5N8)HA重組蛋白(HA-4)，購(gòu)自北京義翹神州科技有限公司。AIV H5亞型檢測(cè)卡為韓國(guó)Anigen公司產(chǎn)品。

細(xì)胞培養(yǎng)基DMEM和1640、GIBCO胎牛血清，購(gòu)自 ThermoFisher公司；PVDF 膜(0.2 μm/0.45 μm)，購(gòu)自Milipore公司；NAbTIMSpin Kits for Antibody Purification、羊抗鼠IgG、弗氏完全佐劑、弗氏不完全佐劑，購(gòu)自Sigma公司；水溶性羧基化熒光量子點(diǎn)，購(gòu)自海王星辰藥業(yè)有限公司。

1.2 單克隆抗體(MAb)的制備 5次免疫，用蔗糖梯度離心純化的H5亞型病毒株免疫BALB/c小鼠，最后一次免疫使用HA-2經(jīng)尾靜脈沖擊免疫。用HA-1對(duì)雜交瘤細(xì)胞陽(yáng)性株的篩選，再用HA-2、HA-3、HA-4做3次亞克隆的篩選。篩選的陽(yáng)性雜交瘤細(xì)胞株制備小鼠腹水單抗，純化備用。

1.3 H5-AIV-QD-LFIA試紙條的研制 量子點(diǎn)用0.1 mol/L MES洗滌離心重懸后加入5 mmol/L EDC和2 mmol/L NHS反應(yīng)30 min，離心洗滌3次，用0.05 mol/L硼酸溶液重懸。加入0.08 mg 單抗到 1 mg活化量子點(diǎn)中，37 ℃反應(yīng)3 h，5% BSA封閉，37 ℃，30 min。反應(yīng)完后離心3次并用0.02 mol/L PBS溶液重懸，4 ℃保存。

將羊抗鼠IgG用PBS緩沖液配制為0.5 mg/mL濃度，將包被抗體用PBS緩沖液配制為2 mg/mL濃度。將羊抗鼠IgG噴涂在質(zhì)控線位置，將包被抗體噴涂在檢測(cè)線位置，37 ℃干燥4 h。玻璃纖維墊用含D-(+)海藻糖，1%BSA和0.1%Tween20的磷酸鹽緩沖液浸泡，37 ℃干燥3 h。量子點(diǎn)標(biāo)記捕捉抗體探針按10 μL/cm量噴涂在樣品墊上，37 ℃干燥3 h，切成3.5 mm寬。

樣品中存在H5亞型AIV時(shí)，H5-AIV與量子點(diǎn)標(biāo)記的單抗結(jié)合后，在檢測(cè)線位置聚集。未被捕獲的量子點(diǎn)標(biāo)記抗體被包被的羊抗鼠IgG捕獲，在質(zhì)控線位置聚集。質(zhì)控線和檢測(cè)線捕獲的量子點(diǎn)在365 nm紫外光照射下會(huì)發(fā)出明亮的紅色熒光條帶，檢測(cè)原理見(jiàn)中插彩版圖1。

1.4 H5-AIV-QD-LFIA試劑條的評(píng)估試驗(yàn)

1.4.1 特異性試驗(yàn) 檢測(cè)H5亞型AIV血凝抑制試驗(yàn)抗原(Re-1、Re-4、Re-5、Re-6、Re-7和Re-8)，禽流感滅活疫苗(H5N2，D7株)、重組禽流感病毒H5亞型二價(jià)滅活疫苗(Re-6株+Re-4株和Re-6株+Re-10株)，其他亞型流感病毒血凝抑制試驗(yàn)抗原(H7亞型、H7N9、H9亞型、H1N1、H3N2)和其他病毒(NDV、IBV、ILTV、EDS-76)。

1.4.2 敏感性試驗(yàn) 用PBS緩沖液倍比稀釋AIV H5(Re-6)亞HI抗原，濃度為0.001 ng/mL、0.01 ng/mL、0.1 ng/mL、1 ng/mL、10 ng/mL、100 ng/mL、1 000 ng/mL，用H5-AIV-QD-LFIA和AIV H5亞型膠體金檢測(cè)卡進(jìn)行檢測(cè)。

1.4.3 重復(fù)性試驗(yàn) 將純化的AIV H5(Re-6)亞型血凝抑制試驗(yàn)抗原稀釋成100 ng/mL、10 ng/mL、1 ng/mL，作為重復(fù)性試驗(yàn)待檢抗原，重復(fù)10次。

1.4.4 臨床樣品的檢測(cè) 檢測(cè)雞場(chǎng)和候鳥(niǎo)采集的510份泄殖腔/喉棉拭子，同時(shí)按國(guó)標(biāo)《H5亞型禽流感病毒熒光RT-PCR檢測(cè)方法》(GB/T 19438.2-2004)進(jìn)行比對(duì)檢測(cè)。

2 結(jié)果

2.1 獲得4株穩(wěn)定分泌單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞株 4株單克隆抗體雜交瘤細(xì)胞株H5HA9#、H5HA18#、H5HA21#和H5HA25#，對(duì)4種H5亞型的HA表達(dá)蛋白均呈現(xiàn)陽(yáng)性ELISA反應(yīng)結(jié)果，單抗?jié)舛群虴LISA效價(jià)見(jiàn)表1。

表1 4株單克隆抗體濃度與效價(jià)

將4種純化的單抗純化后兩兩配對(duì)，分別作為捕捉抗體標(biāo)記量子點(diǎn)，包被抗體噴涂于T線上，檢測(cè)H5亞型AIV滅活疫苗Re-6+Re-4和Re-6株+Re-10株的破乳疫苗，剔除假陽(yáng)性和假陰性的結(jié)果，篩選H5HA25#作為捕捉抗體來(lái)標(biāo)記熒光量子點(diǎn)，H5HA18#作為包被抗體來(lái)制備H5-AIV-QD-LFIA試劑條。

2.2 H5-AIV-QD-LFIA試劑條特異性試驗(yàn)結(jié)果 9株H5亞型標(biāo)準(zhǔn)抗原和疫苗均為陽(yáng)性結(jié)果，而5株非H5亞型流感病毒和4株家禽呼吸道病毒均為陰性結(jié)果(見(jiàn)中插彩版圖2)。

2.3 H5-AIV-QD-LFIA試劑條敏感試驗(yàn)結(jié)果 H5-AIV-QD-LFIA試紙條檢測(cè)AIV H5(Re-6)亞型血凝抑制試驗(yàn)抗原的靈敏度為1 ng/mL，高出AIV H5亞型抗原膠體金檢測(cè)卡靈敏度100倍(見(jiàn)中插彩版圖3)。

2.4 H5-AIV-QD-LFIA重復(fù)性試驗(yàn)結(jié)果 各組試劑條顯色均勻，經(jīng)免疫層析檢測(cè)儀檢測(cè)的熒光強(qiáng)度值的組內(nèi)和組間重復(fù)性試驗(yàn)的變異系數(shù)CV值均小于10%(見(jiàn)中插彩版圖4)，重復(fù)性較好。

2.5 H5-AIV-QD-LFIA臨床樣品檢測(cè)結(jié)果 結(jié)果顯示，熒光檢測(cè)試紙條檢測(cè)方法的符合率達(dá)到99.8%，膠體金檢測(cè)方法的符合率為98.4%(表2)。

表2 符合性檢測(cè)試驗(yàn)結(jié)果

3 討論

H5亞型AIV為高致病性禽流感，一旦發(fā)生，必須進(jìn)行申報(bào)。在禽流感防控中，快速準(zhǔn)確檢測(cè)是防控禽流感發(fā)生和流行的前提和基礎(chǔ)。禽流感的監(jiān)測(cè)方法包括傳統(tǒng)方法與分子生物學(xué)方法。傳統(tǒng)方法主要有病毒分離培養(yǎng)鑒定和血清學(xué)診斷，不足之處在于操作繁瑣、耗時(shí)和結(jié)果重復(fù)性不好，而分子生物學(xué)方法，如RT-PCR與基因芯片技術(shù)具有特異、敏感、簡(jiǎn)便等特點(diǎn)[9-11]，但對(duì)實(shí)驗(yàn)條件要求高，對(duì)人員的操作技能水平也有要求。1990年Beggs M等[12]人使用膠體金作為標(biāo)記材料檢測(cè)人絨毛膜促性腺激素后，免疫層析技術(shù)被廣泛用于檢測(cè)激素、病原體、疾病標(biāo)志物、農(nóng)藥/獸藥殘留等。膠體金標(biāo)記可以肉眼判斷結(jié)果，只需要幾分鐘。2007年，Liu等[13]建立了采用Qdot655量子點(diǎn)替代膠體金標(biāo)記檢測(cè)前列腺特異性抗原(PSA)，檢測(cè)靈敏度可到20 pg/mL。用超敏熒光材料標(biāo)記物替代酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(Dot-ELISA)和免疫酶層析試驗(yàn)(EICA)的酶標(biāo)記物，不需要酶促反應(yīng)底物，縮短了反應(yīng)時(shí)間[14-15]，逐漸成為快速檢測(cè)領(lǐng)域研究的新趨勢(shì)。

本研究采用H5亞型不同毒株的HA重組表達(dá)蛋白進(jìn)行免疫，提高了針對(duì)保守HA抗原決定簇的抗體雜交瘤細(xì)胞的產(chǎn)生。同時(shí)在篩選雜交瘤細(xì)胞株時(shí)，采用了H5亞型不同毒株的表達(dá)重組蛋白來(lái)進(jìn)行雜交瘤細(xì)胞株的篩選，確保篩選出的雜交瘤細(xì)胞株分泌的單抗能夠同時(shí)與不同N亞型的H5病毒反應(yīng)，以最大限度地保證篩選出單抗的廣譜性。經(jīng)過(guò)4次亞克隆，最終篩選出4株雜交瘤細(xì)胞株。經(jīng)過(guò)單克隆抗體的兩兩配對(duì)，找到了可以在免疫層析試紙條中進(jìn)行夾心配對(duì)的2株單抗。本文建立的H5-AIV-QD-LFIA能夠特異檢測(cè)禽流感H5亞型病毒，檢測(cè)靈敏度較膠體金方法高100倍，達(dá)到1 ng/mL，但其靈敏度不及實(shí)時(shí)熒光RT-PCR。本研究中所建立的H5-AIV-QD-LFIA對(duì)9種AIV H5亞型均可以檢出，對(duì)5種其他亞型的流感病毒和其他家禽呼吸道病毒無(wú)交叉反應(yīng)，特異性強(qiáng)；對(duì)臨床樣本檢測(cè)符合率較高，可適用于AIV H5亞型的快速檢測(cè)。