程貴鳳，李肖純，秦芳林，何川川，劉金明，古少鵬，金亞美

(1.山西農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院，山西太谷030801 ; 2.中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院上海獸醫(yī)研究所 農(nóng)業(yè)部動(dòng)物寄生蟲(chóng)學(xué)重點(diǎn)開(kāi)放實(shí)驗(yàn)室，上海閔行200241 ; 3.上海師范大學(xué)生命與環(huán)境科學(xué)學(xué)院，上海徐匯200233)

血吸蟲(chóng)病是由血吸蟲(chóng)感染引起的一種人獸共患寄生蟲(chóng)病，感染者超過(guò)2億，有將近8億人面臨著感染風(fēng)險(xiǎn)[1-3]，在我國(guó)主要流行的是日本血吸蟲(chóng)病。血吸蟲(chóng)是雌雄異體[4]，雌蟲(chóng)只有與雄蟲(chóng)持續(xù)不斷地合抱才能促進(jìn)和維持卵黃腺和卵巢的發(fā)育與成熟，才能正常產(chǎn)卵[5]。成熟雌蟲(chóng)所產(chǎn)大量蟲(chóng)卵隨宿主糞便排出體外造成血吸蟲(chóng)病的流行，同時(shí)沉積在宿主體內(nèi)的蟲(chóng)卵會(huì)引起嚴(yán)重的病理?yè)p害[6]。而單性感染的雌蟲(chóng)，缺乏與雄蟲(chóng)的接觸，生殖系統(tǒng)發(fā)育停滯，不能正常產(chǎn)卵。此外，當(dāng)配對(duì)的雌蟲(chóng)與雄蟲(chóng)分離，雌蟲(chóng)將退回到未成熟狀態(tài)并停止產(chǎn)卵[7-8]。因此，研究與血吸蟲(chóng)生殖發(fā)育和產(chǎn)卵相關(guān)的通路和基因，深入了解日本血吸蟲(chóng)雌蟲(chóng)性成熟和產(chǎn)卵的調(diào)控機(jī)制，對(duì)控制該病的發(fā)生和傳播十分重要。

本研究用RNA-seq高通量測(cè)序技術(shù)對(duì)日本血吸蟲(chóng)25日齡MF和SF的轉(zhuǎn)錄組進(jìn)行測(cè)序、定量及差異表達(dá)基因的篩選，利用生物信息學(xué)分析差異表達(dá)基因，尋找與雌蟲(chóng)生殖發(fā)育和產(chǎn)卵相關(guān)的基因，以期為研究日本血吸蟲(chóng)雌蟲(chóng)的生長(zhǎng)發(fā)育、性成熟和產(chǎn)卵機(jī)制提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 主要試劑與儀器 Prime-ScriptRTreagent Kit with gDNA Eraser、SYBR?Premix ExTaqTMⅡ,購(gòu)自TaKaRa生物工程有限公司；TRIZol?試劑,購(gòu)自上海英濰捷基生物公司；ABI 7500實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀(美國(guó)ABI公司)。

1.1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物與蟲(chóng)株 日本血吸蟲(chóng)中國(guó)大陸株尾蚴由中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院上海獸醫(yī)研究所血吸蟲(chóng)病研究室提供；4～6周齡雄性BALB/c小鼠，購(gòu)自上海斯萊克實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限責(zé)任公司。

1.2 方法

1.2.1 25日齡MF和SF的收集 采用腹部貼片法感染小鼠，于感染25 d剖殺，以肝門(mén)靜脈灌注法收集合抱分開(kāi)的雌蟲(chóng)；以單釘螺逸出的尾蚴感染小鼠，25 d剖殺，結(jié)合形態(tài)觀(guān)察，收集SF蟲(chóng)體，SF較MF小，所收集蟲(chóng)體用PBS洗滌3 次，液氮罐凍存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 RNA的提取及日本血吸蟲(chóng)mRNA文庫(kù)的構(gòu)建 按照TRIZol說(shuō)明書(shū)提取總RNA，并用NanoDrop1000分光光度計(jì)評(píng)估RNA的質(zhì)量?？俁NA樣品用DNA酶I處理以降解任何可能的DNA污染，使用Oligo(dT)磁珠來(lái)富集mRNA，向得到的mRNA中加適量片段化緩沖液，在高溫條件下使其片段化，再以片段化后的mRNA為模板, 合成cDNA，經(jīng)磁珠純化、末端修復(fù)、3′末端加堿基A、加測(cè)序接頭后，進(jìn)行PCR擴(kuò)增，從而完成整個(gè)文庫(kù)制備工作，并進(jìn)行測(cè)序。

1.2.3 參考基因組比對(duì)及測(cè)序評(píng)估 將測(cè)序結(jié)果與日本血吸蟲(chóng)基因組數(shù)據(jù)庫(kù)比對(duì)并進(jìn)行測(cè)序飽和度分析，通過(guò)對(duì)比對(duì)數(shù)據(jù)的統(tǒng)計(jì)和分析，判定該數(shù)據(jù)是否可用于后續(xù)分析。

1.2.4 差異表達(dá)基因篩選 基因表達(dá)量的計(jì)算采用RPKM方法消除基因長(zhǎng)度和測(cè)序量差異對(duì)計(jì)算基因表達(dá)的影響，得到的基因表達(dá)量直接用于比較不同樣品間的基因表達(dá)差異，公式為：RPKM=106C/(NL/103)，RPKM為基因表達(dá)量，C為唯一比對(duì)到該基因的讀取數(shù)，N為唯一比對(duì)到參考基因的總讀取數(shù)，L為該基因編碼區(qū)的堿基數(shù)。以│Log2Ratio│≥1, p-Value<0.001為標(biāo)準(zhǔn)篩選差異表達(dá)基因，其中錯(cuò)誤檢出率小于0.001。

1.2.5 生物信息學(xué)分析 用BLAST將檢測(cè)到的基因與Nr(Non-redundant protein sequence database in GenBank)數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行比對(duì)，獲得注釋信息。利用Blast2GO軟件將基因序列與GO(Gene ontology)數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行比對(duì)，從生物學(xué)進(jìn)程，細(xì)胞組分和分子功能這3個(gè)層面進(jìn)行基因GO注釋?zhuān)⒑Y選出差異基因富集的顯著性GO條目；同時(shí)將基因于KEGG(Kyoto encyclopedia of genes and genomes)數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行通路注釋?zhuān)@得差異表達(dá)基因相應(yīng)的通路信息。

1.2.6 熒光實(shí)時(shí)定量RT-PCR(qRT-PCR)檢測(cè)差異基因的轉(zhuǎn)錄水平 為驗(yàn)證測(cè)序結(jié)果的可靠性，從MF和SF差異表達(dá)的基因中隨機(jī)選取5個(gè)上調(diào)基因和5個(gè)下調(diào)基因進(jìn)行qRT-PCR檢測(cè)。用Primer 5.0設(shè)計(jì)這些基因的特異性引物，見(jiàn)表1(由上海英濰捷基生物公司合成)。提取25 d MF和SF蟲(chóng)體的總RNA，按Prime-ScriptRTreagent說(shuō)明書(shū)反轉(zhuǎn)錄為cDNA，并按SYBR?Premix ExTaqTMⅡ說(shuō)明書(shū)進(jìn)行qRT-PCR，每個(gè)反應(yīng)均做三孔重復(fù)。利用ABI 7500 Software v2.0.5分析結(jié)果，以tublin基因作為內(nèi)參，得出相對(duì)于每百萬(wàn)持家基因的目的基因含量。

1.2.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 用GraphPad Prism 5進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，差異表達(dá)基因在MF與SF的差異性分析用t-test進(jìn)行檢驗(yàn)；P-values≤0.05或0.01視為差異顯著或極顯著。

表1 qRT-PCR檢測(cè)的基因序列和擴(kuò)增長(zhǎng)度

2 結(jié)果與分析

2.1 原始數(shù)據(jù)分析 從MF和SF中分別獲得3 696 376和3 662 109條clean reads，且clean reads占測(cè)序總讀數(shù)的99.5%，樣品質(zhì)量良好。將clean reads數(shù)匹配到日本血吸蟲(chóng)基因組數(shù)據(jù)庫(kù)，匹配率達(dá)79%左右。

2.2 測(cè)序飽和度 測(cè)序飽和度結(jié)果顯示，當(dāng)測(cè)序量達(dá)到一定值時(shí)，25天MF和SF中鑒定到的基因數(shù)量不再增加，說(shuō)明測(cè)序結(jié)果是全面且飽和的，可進(jìn)行后續(xù)生物學(xué)分析。

2.3 差異表達(dá)基因的篩選 RNA-seq共檢測(cè)到11 171個(gè)基因。在這些基因中，以│Log2Ratio│≥1,p-Value<0.001為條件，篩選到775個(gè)在MF和SF之間顯著差異表達(dá)的基因，其中401個(gè)基因在MF中上調(diào)， 374個(gè)基因在SF中上調(diào)。

2.4 GO功能分析 從BP(Biological process, 生物學(xué)進(jìn)程)、CC(Cellular components, 細(xì)胞組分)、MF(Molecular function, 分子功能) 3個(gè)層面進(jìn)行GO注釋?zhuān)鐖D1所示，在生物學(xué)進(jìn)程中，差異表達(dá)基因更多的參與細(xì)胞進(jìn)程，代謝進(jìn)程和單一生物進(jìn)程。在細(xì)胞組分中，差異表達(dá)基因集中在細(xì)胞、細(xì)胞器和細(xì)胞膜中。在分子功能中，大多數(shù)差異表達(dá)基因與結(jié)合和催化活性相關(guān)。

GO功能富集分析還結(jié)合了表達(dá)模式的聚類(lèi)分析，如表2所示，差異表達(dá)基因的主要生物學(xué)功能集中在：氧化磷酸化，離子跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)，血紅素結(jié)合和鐵離子結(jié)合。

圖1 差異基因的GO注釋

GO功能分類(lèi)GO功能基因數(shù)/差異基因數(shù)GO功能基因數(shù)/鑒定到的基因數(shù)P-value生物進(jìn)程 氧化還原進(jìn)程39/261(14.9%)196/3763(5.2%)4.39e-07 電子傳遞鏈21/261(8.0%)73/3763(1.9%)6.50e-06 氧化磷酸化15/261(5.7%)39/3763(1.0%)1.17e-05 單一生物進(jìn)程112/261(42.9%)1168/3763(31.0%)0.01390細(xì)胞組分 呼吸鏈13/212(6.1%)49/2953(1.7%)0.00359 膜組分66/212(31.1%)611/2953(20.7%)0.01968 膜102/212(48.1%)1078/ 2953(36.5%)0.03226分子功能 氫離子跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)活性23/267(8.6%)88/3952(2.2%)1.60e-06 離子跨膜45/267(16.9%)288/3952(7.3%)7.45e-06 血紅素結(jié)合8/267(3.0%)22/3952(0.6%)0.01130 鐵離子結(jié)合9/267(3.4%)31/3952(0.8%)0.02867

2.5 差異表達(dá)基因的KEGG分析 本研究將所有顯著差異基因與KEGG數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行比較，發(fā)現(xiàn)這些差異基因富集到206個(gè)途徑。其中顯著性富集途徑涉及到代謝途徑，肌動(dòng)蛋白細(xì)胞骨架的調(diào)節(jié)，溶酶體等，見(jiàn)圖2。

2.6 差異表達(dá)基因的驗(yàn)證 為了驗(yàn)證RNA-seq結(jié)果，從鑒定到的差異基因中隨機(jī)選擇5個(gè)上調(diào)基因和5個(gè)下調(diào)基因用于qRT-PCR驗(yàn)證，結(jié)果顯示,這些基因在轉(zhuǎn)錄水平上也表現(xiàn)出相應(yīng)的上調(diào)或下調(diào)，見(jiàn)圖3A和3B。

圖2 差異表達(dá)基因的KEGG分析

3 討論

為探索血吸蟲(chóng)雌蟲(chóng)的生長(zhǎng)發(fā)育、產(chǎn)卵等機(jī)制，本研究使用RNA-seq技術(shù)對(duì)25天MF和SF的樣品進(jìn)行了大規(guī)模測(cè)序、定量及差異表達(dá)基因的篩選。經(jīng)測(cè)序飽和度分析表明測(cè)序結(jié)果是飽和且全面的，全部的clean reads數(shù)與日本血吸蟲(chóng)基因組序列匹配發(fā)現(xiàn)兩組樣本的匹配率皆達(dá)79%以上，但仍有20%未知標(biāo)簽，這表明存在新的基因需進(jìn)一步鑒定。

日本血吸蟲(chóng)雌蟲(chóng)的性成熟和產(chǎn)卵對(duì)血吸蟲(chóng)病的發(fā)生和傳播至關(guān)重要，為鑒定與這些生物學(xué)過(guò)程相關(guān)的基因，本研究測(cè)序后以│Log2Ratio│≥1,p-Value<0.001為條件，篩選出775個(gè)顯著差異表達(dá)的基因，其中MF中有401個(gè)上調(diào)基因，SF中有374個(gè)基因上調(diào)。生物信息學(xué)分析表明，鑒定的差異基因主要參與代謝過(guò)程，生物合成，細(xì)胞和運(yùn)動(dòng)過(guò)程。

圖3 qRT-PCR驗(yàn)證差異表達(dá)基因結(jié)果

*:P≤0.05 ; **：P≤0.01

代謝過(guò)程對(duì)血吸蟲(chóng)的生長(zhǎng)發(fā)育十分重要，本研究KEGG富集分析發(fā)現(xiàn)，兩組樣本中差異表達(dá)基因富集到的最多參與途徑是代謝過(guò)程，且參與這些代謝過(guò)程的差異基因更多地在MF中上調(diào)表達(dá)，涉及的代謝過(guò)程包括核苷酸代謝，氨基酸代謝和葡萄糖代謝。本研究富集分析發(fā)現(xiàn)參與編碼腺苷磷酸化酶、鳥(niǎo)苷酸激酶、天門(mén)冬氨酸氨基甲酰轉(zhuǎn)移酶和二氫轉(zhuǎn)移酶的基因在MF中上調(diào)，且已證明這些酶在日本血吸蟲(chóng)核苷酸代謝的自我合成途徑中起重要作用[9-11]，這說(shuō)明核苷酸代謝可為日本血吸蟲(chóng)雌蟲(chóng)提供所需的能量。同時(shí)，檢測(cè)到參與編碼酪氨酸酶和精氨酸酶的基因在MF中高表達(dá)，已有研究表明，酪氨酸可促進(jìn)雌蟲(chóng)產(chǎn)卵[12]，而精氨酸酶有助于雌蟲(chóng)自身的膠原沉積[13]。此外，葡萄糖代謝對(duì)日本血吸蟲(chóng)的能量需求非常重要，它是血吸蟲(chóng)生長(zhǎng)和發(fā)育的主要來(lái)源[14]。本研究檢測(cè)到很多參與糖酵解的酶，以及參與編碼胰島素蛋白的基因在MF中上調(diào)，這表明雌蟲(chóng)的生長(zhǎng)發(fā)育與葡萄糖代謝提供的能量是不可分割的。

蛋白質(zhì)的合成在維持日本血吸蟲(chóng)的正常運(yùn)動(dòng)和滿(mǎn)足雌蟲(chóng)產(chǎn)卵方面發(fā)揮重要作用，本研究檢測(cè)到差異基因編碼的大量蛋白在MF中上調(diào)，如膜相關(guān)蛋白，它們可調(diào)節(jié)囊泡的融合和對(duì)接[15]，并在血吸蟲(chóng)葡萄糖吸收方面起重要作用[16]。還有熱休克蛋白，它們能保護(hù)血吸蟲(chóng)免受有害環(huán)境的影響[17]。此外，差異表達(dá)基因GO富集分析發(fā)現(xiàn)，血紅素結(jié)合和鐵結(jié)合過(guò)程在MF中顯著上調(diào)，研究表明,血吸蟲(chóng)可以利用自身的組織蛋白酶降解宿主的血紅蛋白為珠蛋白和血紅素，提供所需的營(yíng)養(yǎng)來(lái)源，且成熟雌蟲(chóng)的卵黃腺中儲(chǔ)存有大量的鐵，可促進(jìn)雌蟲(chóng)的產(chǎn)卵[18]。

KEGG富集分析和GO功能注釋發(fā)現(xiàn)在SF中上調(diào)表達(dá)的基因多參與細(xì)胞通訊和運(yùn)動(dòng)，如參與編碼肌動(dòng)蛋白和肌球蛋白的基因，這些基因的高表達(dá)說(shuō)明發(fā)育阻遏雌蟲(chóng)運(yùn)動(dòng)系統(tǒng)發(fā)達(dá)，為與雄蟲(chóng)合抱做準(zhǔn)備。

4 結(jié)論

本研究分析了MF和SF之間的轉(zhuǎn)錄組差異，發(fā)現(xiàn)許多與雌蟲(chóng)生長(zhǎng)發(fā)育和產(chǎn)卵有關(guān)的差異基因和通路，為研究日本血吸蟲(chóng)雌蟲(chóng)的生殖發(fā)育機(jī)制提供基礎(chǔ)。