吳凡，梅嘯，吳鳳亭

（蘇州工業(yè)園區(qū)服務(wù)外包職業(yè)學(xué)院，江蘇蘇州 215123）

豬圓環(huán)病毒（Porcine circovirus，PCV）是一種共價(jià)閉合、單股環(huán)狀DNA病毒。2015年，從美國(guó)北卡羅來(lái)納州某豬場(chǎng)爆發(fā)的PDNS疫情中鑒定出一種新病毒，該病毒與圓環(huán)病毒科病毒具有類似基因組結(jié)構(gòu)和遺傳相似性，但與其他圓環(huán)病毒衣殼蛋白氨基酸序列同源性低于70%，將其歸類為一種新型圓環(huán)病毒，命名為PCV3[1-2]。該病毒能引起豬的多系統(tǒng)炎癥反應(yīng)，若沒(méi)有有效地控制方法，會(huì)對(duì)養(yǎng)豬產(chǎn)業(yè)帶來(lái)災(zāi)難性的經(jīng)濟(jì)損失，同時(shí)對(duì)人類健康也有潛在風(fēng)險(xiǎn)[3-4]。因此針對(duì)這種新型PCV3病毒，疫苗的研究工作尤為重要。本實(shí)驗(yàn)作為相關(guān)疫苗研究工作的基礎(chǔ)，主要對(duì)PCV3病毒進(jìn)行序列優(yōu)化后建立表達(dá)載體，對(duì)抗原蛋白發(fā)酵表達(dá)的條件進(jìn)行探索，希望能夠找到最優(yōu)發(fā)酵條件。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 主要試劑

氯化鈉、氨水、鹽酸為國(guó)藥分析純，自配；蛋白胨、酵母浸粉，購(gòu)自安琪酵母股份有限公司；無(wú)水乙醇，購(gòu)自Macklin公司。

1.1.2 實(shí)驗(yàn)對(duì)象

基因序列優(yōu)化后的PCV3病毒。

1.1.3 主要設(shè)備

高速離心機(jī)（Thermo Scientific）、細(xì)胞均質(zhì)機(jī)（AVESTIN）、高壓滅菌鍋（上海博迅）、凝膠成像儀（Bio-Rad）。

1.2 方法

1.2.1 基因序列優(yōu)化及表達(dá)載體構(gòu)建

將PCV3基因序列的N端截去4個(gè)氨基酸達(dá)到最優(yōu)序列，通過(guò)BamH1與Nco1兩個(gè)酶切位點(diǎn)把優(yōu)化后的PCV3序列構(gòu)建到帶有his標(biāo)簽的pET28b載體上。

1.2.2 搖瓶培養(yǎng)表達(dá)目的蛋白

（1）細(xì)胞轉(zhuǎn)化。BL21細(xì)胞復(fù)蘇后，加入pET28b-PCV3質(zhì)粒進(jìn)行轉(zhuǎn)染，再加入500μL普通培養(yǎng)基培養(yǎng)1 h后，離心1 min，吸取上清液，離心管內(nèi)沉淀加入BufferZ重懸，菌液涂抹在含有kan（卡那霉素）抗性的平板上，37℃過(guò)夜培養(yǎng)。

（2）搖瓶表達(dá)。從平板上挑取單克隆菌落放入100mL單抗（kan）培養(yǎng)基，稀釋混勻后吸取10mL的菌液放入含有500mL的LB培養(yǎng)基和500μL的kan培養(yǎng)基的搖瓶中，分為三組，每組8個(gè)搖瓶。每組培養(yǎng)條件如表1。

表1 各組搖瓶表達(dá)條件

培養(yǎng)過(guò)程中，在加入誘導(dǎo)劑異丙基硫代半乳糖苷IPTG之前先檢測(cè)菌液渾濁度（OD600值），達(dá)到要求后，每組按照表1加入IPTG誘導(dǎo)劑，按照各組搖菌條件培養(yǎng)過(guò)夜，讓細(xì)菌充分進(jìn)行蛋白表達(dá)后，利用破碎機(jī)將菌液破碎離心，棄去上清液，沉淀用Buffer Z重懸，放置在冰箱備用。

（3）發(fā)酵罐罐內(nèi)滅菌鏡檢后，加入種子液與卡那霉素、加氯霉素發(fā)酵后，設(shè)置罐內(nèi)培養(yǎng)參數(shù)，培養(yǎng)過(guò)程中，每過(guò)一小時(shí)監(jiān)測(cè)一次OD600的值，誘導(dǎo)12 h。

1.2.3 發(fā)酵罐培養(yǎng)表達(dá)目的蛋白

（1）種子液準(zhǔn)備。將轉(zhuǎn)化好的細(xì)菌接種在含有卡那霉素 ＆ 氯霉素雙抗平板上培養(yǎng)，37℃恒溫培養(yǎng)24 h，挑取單菌落接種在含有5mL的雙抗LB培養(yǎng)基中，37℃、250r/min搖床條件下，培養(yǎng)5～6h，作為一級(jí)種子液。再?gòu)囊患?jí)種子液中吸取20μL培養(yǎng)基加入500mL的雙抗培養(yǎng)基中，37℃、220r/min條件下培養(yǎng)過(guò)夜。

（2）發(fā)酵罐準(zhǔn)備。發(fā)酵罐使用前罐內(nèi)滅菌鏡檢，合格后按1∶4（磷酸∶氨水）的比例配制1000mL的溶液，在超凈臺(tái)上分裝入小發(fā)酵罐，同時(shí)每個(gè)發(fā)酵罐內(nèi)加入1‰的卡那霉素 ＆ 氯霉素；罐內(nèi)通氣量設(shè)為4m3/h，保持罐內(nèi)正壓，200r/min攪拌速度，溫度37℃，打開(kāi)蠕動(dòng)泵，pH調(diào)至6.95～7.05。

（3）接種。種子液混勻加入發(fā)酵罐，發(fā)酵條件穩(wěn)定在通氣量4m3/h，罐壓0.04～0.05MPa，轉(zhuǎn)速200r/min。數(shù)值穩(wěn)定10min后標(biāo)定溶氧電極，做好標(biāo)記。當(dāng)OD600值達(dá)到20～25時(shí)，降溫至28℃，溫度穩(wěn)定后30 min，快速加入IPTG（罐內(nèi)溶液體積的1‰），滅菌密封，誘導(dǎo)12 h。期間監(jiān)測(cè)OD600數(shù)據(jù)，觀測(cè)罐內(nèi)氣泡及酸堿值。

1.2.4 細(xì)菌破碎純化

將搖瓶表達(dá)的菌液與發(fā)酵菌液分別取出并進(jìn)行細(xì)胞破碎，依次通過(guò)Q柱、Butyl柱純化，用不同濃度的洗脫液洗脫雜蛋白，分別收集洗脫后的樣品以備后期電泳。

1.2.5 SDS-PAGE凝膠電泳驗(yàn)證表達(dá)蛋白量

配好膠后，將每組樣品加入適量LoadingBuffer，點(diǎn)樣后將膠體放入電泳槽，220V電壓下跑膠30 min左右。

2 結(jié)果與分析

本實(shí)驗(yàn)需要關(guān)注的3種表達(dá)蛋白分別為52kD、49kD和41kD大小，根據(jù)誘導(dǎo)劑加入量不同、OD600值不同分為以下3種情況。

2.1 OD600為0.6、IPTG500μL條件下

如圖1所示，不同洗脫條件下洗出的蛋白和雜蛋白大小及數(shù)量各不相同，在條帶8、9中，在洗脫液為100%0.5mol/LNaCl imidazole的條件下，目標(biāo)蛋白52kD、41kD和49kD處有明顯的蛋白表達(dá)，49kD的表達(dá)量相對(duì)較高，但兩條條帶中，3種蛋白表達(dá)量并不均一，分子量大的表達(dá)量也較大。

圖1 PCV3蛋白表達(dá)結(jié)果（OD600值0.6、IPTG500μL條件下）

2.2 OD600值為1.0、IPTG500μL條件下

如圖2所示，3% 0.5mol/LNaCl imidazole洗脫液中已有目標(biāo)蛋白的表達(dá)，但同時(shí)雜蛋白也較多，無(wú)法區(qū)分；在100%洗脫（條帶5、6）時(shí)，3種表達(dá)蛋白有更明確的表達(dá)，雜蛋白表達(dá)量減少，并且在同等條件下，條帶6上樣量較多，3種蛋白表達(dá)量也增多。與第1組相比，改變菌液濁度（OD600從0.6提高到1.0）后3種蛋白都有較均一的表達(dá)量，但整體3種蛋白的表達(dá)量沒(méi)有第1組高。

2.3 OD600值為1.0、IPTG100μL條件下

在本組條件中，菌液濁度不變，誘導(dǎo)劑IPTG加入的量減少到100μL，41kD、49kD與52kD3種蛋白表達(dá)量相較于前兩個(gè)條件有所增加，同樣在100%洗脫條件下的跑膠圖顯示的3種蛋白表達(dá)濃度最清晰，相互之間的表達(dá)量也較為均一，洗脫的雜蛋白的量減少，如圖3所示。

圖2 PCV3蛋白表達(dá)結(jié)果（OD600值1.0、IPTG500μL條件下）

圖3 PCV3表達(dá)蛋白結(jié)果（OD600值1.0、IPTG100μL條件下）

2.4 發(fā)酵罐菌液跑膠圖

圖4可見(jiàn)，上樣量為5μL的條帶相較于上樣量為2μL的條帶在同樣大小的蛋白處表達(dá)更高，在41kD、49kD和52kD3種蛋白大小處，條帶1和5表達(dá)均一，濃度較低；條帶2、3、4表達(dá)的蛋白濃度更高，均一度依然保持一致。

圖4 發(fā)酵罐菌液跑膠表達(dá)圖

3 結(jié)論

通過(guò)本實(shí)驗(yàn)中的搖瓶表達(dá)條件改變，發(fā)現(xiàn)在不同的菌液渾濁度下，加入不同量的IPTG都會(huì)影響到最后PCV3抗原蛋白的表達(dá)，當(dāng)OD600為1.0、加入IPTG溶液100μL時(shí)，PCV3病毒蛋白表達(dá)量相對(duì)最高，表達(dá)效果也最均一。以往認(rèn)為在OD600為1.0、IPTG溶液加入500μL時(shí)蛋白的表達(dá)量是較好的，但經(jīng)過(guò)本次探究發(fā)現(xiàn)，IPTG溶液的加入量為100μL時(shí)，PCV3病毒蛋白的表達(dá)反而更多。

目前的PCV3疫苗還處于研究階段，經(jīng)過(guò)不斷嘗試但還達(dá)不到很好的效果，對(duì)PCV3病毒蛋白的表達(dá)大多是用搖瓶和小發(fā)酵罐進(jìn)行生產(chǎn)研究，本研究提供了在優(yōu)化的條件下快速安全的進(jìn)行PCV3病毒蛋白的大量表達(dá)，為PCV3病毒疫苗的研究提供更好的基礎(chǔ)。