閆彩虹　金文杰　羊揚　劉文博　彭大新　王志強

【摘 要】隨著社會的需求，第三方檢驗檢測機構(gòu)的數(shù)量日益增多。檢測數(shù)據(jù)的準確性不僅關(guān)乎檢測機構(gòu)的檢測水平，也直接影響行政機關(guān)的執(zhí)法效力，因此檢測實驗室必須確保其檢測數(shù)據(jù)科學(xué)公正、準確可靠。核酸檢測是第三方檢驗檢測機構(gòu)中最常見的檢測項目，而氣溶膠污染是核酸檢測中最主要最常見的污染，也是困擾絕大多數(shù)實驗室的難題，必須要加以重視。本文就本中心在核酸檢測防污染方面的體會進行初步總結(jié)。

【關(guān)鍵詞】檢驗檢測機構(gòu);PCR檢測室;核酸檢測;氣溶膠污染

中圖分類號： E9393 文獻標識碼： A 文章編號： 2095-2457（2019）28-0049-002

DOI：10.19694/j.cnki.issn2095-2457.2019.28.018

【Abstract】The number of the third party inspection and testing institutions is increasing with the demands of the society.The accuracy of the testing results not only relates to the testing level of the institution，but also directly affects the enforcement effectiveness of administrative agencies.The testing results must be scientific，fair，accurate and reliable in the third party inspection and testing institutions.Nucleic acid testing is the most common project，and the aerosol pollution is the most common pollution in nucleic acid testing， and it is also a problem existed in most laboratories，so we must take it seriously.The experience of preventing the nucleic acid pollution is preliminary summarized in this paper.

【Key words】Inspection and testing institutions;PCR testing rooms;Nucleic acid testing;Aerosol pollution

隨著養(yǎng)殖企業(yè)的增多，部分養(yǎng)殖企業(yè)管理不規(guī)范，飼養(yǎng)環(huán)境惡劣，存在抗生素的濫用和疫苗的不合理使用現(xiàn)象，使得病毒也在不斷地演化，導(dǎo)致養(yǎng)殖業(yè)面臨更高的疾病暴發(fā)率，疾病的病因也越來越復(fù)雜，往往存在多種病原感染。第三方檢驗檢測機構(gòu)一般均會設(shè)立PCR檢測室，直接針對病原核酸進行檢測，核酸檢測特異性強、靈敏度高，對疾病的診斷起著至關(guān)重要的作用，但在操作過程中易受到污染，導(dǎo)致假陽性的結(jié)果[1]，其中最常見且最難消除的污染為氣溶膠污染。氣溶膠污染一般是在提取陽性樣品的核酸或PCR時使用移液器加樣時產(chǎn)生，一個氣溶膠粒子能攜帶上萬個DNA分子，這些DNA分子漂浮在空氣中，難以消除，部分可附著在檢測人員的衣物上，隨著人或物的流通而進一步污染整個實驗室，對實驗結(jié)果產(chǎn)生嚴重的干擾，因此解決和監(jiān)控氣溶膠污染是第三方檢驗檢測機構(gòu)確保檢測結(jié)果質(zhì)量的必由之路。本中心作為江蘇省內(nèi)動檢領(lǐng)域首家通過CMA認證的高校檢測機構(gòu)，在解決和監(jiān)控核酸污染方面積累了一定的經(jīng)驗，現(xiàn)總結(jié)如下。

1 PCR檢測室布局需合理

PCR整個試驗分試劑準備區(qū)（一區(qū)）、核酸提取區(qū)（二區(qū)）、擴增區(qū)（三區(qū)）和產(chǎn)物分析區(qū)（四區(qū)），流轉(zhuǎn)順序為試劑準備區(qū)→核酸提取區(qū)→擴增區(qū)→產(chǎn)物分析區(qū)，試劑、樣本等在各區(qū)之間以相應(yīng)傳遞窗單向傳遞，嚴禁人員、器材和試劑倒流。各區(qū)均設(shè)有緩沖間，工作服和清潔消毒物品不得跨區(qū)混用。各區(qū)在空間上完全獨立，不能相通，各區(qū)均有獨立的通風(fēng)系統(tǒng)，四個區(qū)域的壓力依次遞減，一區(qū)、二區(qū)保持正壓，三區(qū)、四區(qū)保持負壓狀態(tài)，各區(qū)之間壓差≥5Pa。PCR檢測室的進風(fēng)口和出風(fēng)口不能設(shè)在建筑的同一平面，以避免排出的空氣被重新吸進實驗室[2]。

2 加強實驗室的質(zhì)量控制措施

2.1 強化生物安全意識

試劑準備區(qū)（配液區(qū)）要求高度潔凈，定期監(jiān)控，不能存在病原核酸污染;核酸提取區(qū)要有相應(yīng)的生物安全設(shè)施，病料的處理需在生物安全柜內(nèi)進行;產(chǎn)物分析區(qū)使用溴化乙錠的區(qū)域要與其他操作區(qū)域相互隔離。實驗人員應(yīng)做好防護措施，實驗過程中必須穿戴相應(yīng)區(qū)域的工作服、口罩，戴一次性無粉手套，疑有污染應(yīng)立即更換。未檢測的樣品和檢畢樣品應(yīng)分開存放在冰箱指定位置，檢畢樣品超過留樣時間須經(jīng)高壓滅菌處理后再送廢棄物處理中心處置。

2.2 加強人員管理和培訓(xùn)

實驗室應(yīng)建立人員管理和培訓(xùn)制度。檢測人員必須進行崗前培訓(xùn)（包括實驗技能培訓(xùn)和生物安全培訓(xùn)）并經(jīng)考核合格后方可進行檢測工作，檢測過程全程嚴格按照實驗室標準操作規(guī)程（SOP）進行操作。移液器使用時動作要輕柔并全程在生物安全柜中進行，陰性對照加液全部在配液區(qū)完成并優(yōu)先蓋好管蓋，陽性對照和樣本除核酸外其余均在配液區(qū)加液蓋好管蓋，然后至核酸提取區(qū)加入樣本核酸并輕輕蓋好管蓋，最后加入陽性核酸對照蓋好管蓋，將所有PCR管瞬離后進行核酸擴增。擴增結(jié)束后先離心，將管帽和管壁上的液體離至管底，防止開蓋時液體濺出污染實驗室，再在PCR產(chǎn)物分析區(qū)進行電泳。實驗結(jié)束后按照SOP要求對實驗室進行清潔消毒，清潔時不同區(qū)域的抹布禁止混用，石浩宇等[3]通過熒光定量PCR方法對實驗室環(huán)境監(jiān)測發(fā)現(xiàn)不同區(qū)域的抹布混用可引起核酸污染，消毒采用紫外消毒和75%酒精擦拭、噴霧消毒相結(jié)合。實驗室應(yīng)定期對人員進行理論知識、實際操作和生物安全方面的培訓(xùn)，安排人員定期對實驗室進行消毒和環(huán)境監(jiān)測，發(fā)現(xiàn)污染及時上報處理。

2.3 按規(guī)定存放試劑和耗材

核酸檢測涉及試劑種類較多，必須按實驗室和試劑存儲要求存放于指定位置，禁止亂拿亂放。PCR反應(yīng)涉及的試劑按說明書要求存放于配液區(qū)冰箱中，配液區(qū)為整個PCR檢測室最為潔凈的區(qū)域，嚴禁任何核酸溶液（包括樣本核酸和陽性對照）進入該區(qū)域。DNA或RNA提取試劑盒在核酸提取區(qū)打開使用后只能在該區(qū)域存放，嚴禁流入其他區(qū)域。高壓過后的潔凈耗材保存在試劑準備區(qū)，并單向流轉(zhuǎn)到其他區(qū)域，最后通過污物走廊高壓滅菌處理后再送廢棄物處理中心，嚴禁試劑和耗材的倒流。

3 加強實驗室的消毒措施

3.1 化學(xué)消毒

PCR檢測室可交替使用75%酒精或6%雙氧水進行封閉消毒，每周至少消毒一次。先用裝有75%酒精的氣溶膠消毒機對實驗室空氣進行密集噴淋，以對實驗過程中產(chǎn)生的氣溶膠具有較好的沉降效果，然后再用84消毒液擦拭實驗臺面或拖擦地面，作用10min后用清水擦拭實驗臺面，以防84消毒液殘留抑制實驗結(jié)果，儀器設(shè)備表面及實驗輔助用品如指形管架等也應(yīng)使用75%乙醇定期擦拭消毒。PCR檢測室還可直接使用裝有6%雙氧水的氣溶膠消毒機對實驗室空氣進行噴霧消毒，工作20min后繼續(xù)關(guān)閉門窗熏蒸半小時至一小時，然后打開實驗室通風(fēng)設(shè)備進行換氣。

另外，也可使用商品化的氣溶膠污染清除劑進行消毒，某些核酸氣溶膠污染清除劑可有效降解95%以上的DNA氣溶膠污染和99%以上的RNA氣溶膠污染，可用于清潔設(shè)備、耗材、操作臺及環(huán)境中的核酸污染。

3.2 物理消毒

紫外消毒是一種高效、安全、環(huán)保、經(jīng)濟的技術(shù)，能夠有效地殺滅病毒、細菌和原生動物，而且?guī)缀醪划a(chǎn)生任何消毒副產(chǎn)物，無二次污染，且不受水體溫度、pH值的影響。因此，PCR檢測室各區(qū)域應(yīng)配備紫外燈，實驗結(jié)束后打開實驗室各區(qū)域的紫外燈進行紫外消毒，照射時間≥1h[4]。紫外燈管累計工作1000h或輻射強度低于70μW/cm2時應(yīng)及時更換燈管。生物安全柜在實驗開始前半小時和結(jié)束后半小時也應(yīng)進行紫外消毒。

4 定期對實驗室進行監(jiān)控

4.1 實驗室溫度、濕度控制

氣溶膠濃度在相對條件下與溫度成負相關(guān)，與濕度成正相關(guān)[5]，PCR檢測室應(yīng)合理控制實驗室溫度、濕度于規(guī)定要求范圍內(nèi)，盡量減少溫濕度的波動，以減少氣溶膠的產(chǎn)生。

4.2 定期對實驗室進行環(huán)境監(jiān)控

每個月監(jiān)控實驗室是否存在污染，清潔消毒效果是否良好。采集環(huán)境中的樣本進行核酸污染監(jiān)控，可用擦拭法對PCR檢測室的儀器設(shè)備、實驗臺面、地面、傳遞窗等部位進行相關(guān)核酸的檢測，任一部位環(huán)境監(jiān)測結(jié)果不合格，均應(yīng)采取相應(yīng)措施加強實驗室清潔消毒，直至環(huán)境監(jiān)測結(jié)果全部合格。安排檢測員記錄陽性率及假陽性的發(fā)生頻率，及時發(fā)現(xiàn)異常，若檢測過程中發(fā)現(xiàn)陽性率異常升高、陰性對照頻繁出現(xiàn)假陽性、未知擴增條帶重復(fù)出現(xiàn)等問題，極有可能發(fā)生了核酸氣溶膠污染，應(yīng)緊急進行污染源的排除和清理。

本中心作為由高校成立的非獨立法人第三方檢驗檢測機構(gòu)，為社會提供優(yōu)質(zhì)的檢測服務(wù)和公證的數(shù)據(jù)以及出具具有法律效力的檢測報告是本中心工作的重點，中心檢測水平的高低更是關(guān)乎高校的聲譽，PCR檢測作為日常檢測的重點項目更是應(yīng)該保證其檢測結(jié)果的準確性，因此檢測過程中必須嚴格執(zhí)行標準操作規(guī)程，加強防止交叉污染的意識，做好實驗室的清潔消毒和環(huán)境監(jiān)測工作，避免因核酸污染而造成假陽性結(jié)果。

【參考文獻】

[1]Kwok S，Higuchi R.Avoiding false positives with PCR[J]. Nature，1989，339（6221）：237.

[2]薛秀榮，來祝檁，韓惠云.淺談核酸檢測實驗室防污染措施[J].中國衛(wèi)生產(chǎn)業(yè)，2018，15（26）：144-145.

[3]石浩宇，劉毅，范鵬程.PCR實驗室核酸污染監(jiān)測及排除[J].中國醫(yī)療器械信息，2018，24（07）：25-26，36.

[4]郭靈安，雷紹榮，宋君.紫外線清除實驗室轉(zhuǎn)基因物質(zhì)污染的效果研究[J].中國消毒學(xué)雜志，2015，32（5）：437-439.

[5]倪沈陽，石巍，陳琬玥，等.溫濕度對氣溶膠濃度影響的模擬研究[J].吉林建筑大學(xué)學(xué)報，2016，33（6）：53-56.