孫建松

(貴州省人民醫(yī)院耳鼻咽喉頭頸外科，貴州 貴陽(yáng) 520002)

先天性極重度感音神經(jīng)性聾是影響人類健康和造成人類殘疾的常見(jiàn)疾病[1]。研究[2]發(fā)現(xiàn)，大約60%的先天耳聾由遺傳性因素導(dǎo)致。研究[3-9]發(fā)現(xiàn)，導(dǎo)致中國(guó)人群耳聾的三個(gè)最重要的致病基因SJB2、SLC26A4(PDS)和線粒體(mtDNA)12SrRNA(A1555G和C1494T)檢出率分別為21%、14.5%和4.4%。目前臨床上對(duì)重度和極重度感音神經(jīng)性聾的惟一有效的治療方法是人工耳蝸植入(cochlear implant，CI)。我院為配合中國(guó)殘聯(lián)貧困聾兒人工耳蝸搶救性康復(fù)項(xiàng)目的順利啟動(dòng)和正確實(shí)施，在貴州地區(qū)率先開(kāi)展CI手術(shù)，術(shù)前應(yīng)用基因診斷技術(shù)對(duì)102例接受CI手術(shù)的極重度感音神經(jīng)性聾患兒GJB2、GJB3、SLC26A4和線粒體12SrRNA突變位點(diǎn)進(jìn)行檢測(cè)，分析他們可能的致病基因。本研究基于對(duì)此類致聾基因與CI術(shù)后的療效觀察，初步探討致聾基因與CI術(shù)后的相關(guān)性，為術(shù)前預(yù)估術(shù)后效果提供臨床參考，也為建立和完善符合中國(guó)耳聾人群遺傳特征的基因篩查提供參考。

1 資料與方法

1.1一般資料 選擇2012年6月至2014年5月在我院接受單側(cè)CI的兒童102例，其中語(yǔ)前聾98例，語(yǔ)后聾4例。根據(jù)耳聾基因檢測(cè)結(jié)果分為兩組：耳聾基因突變患兒組27例(觀察組)，未檢出耳聾基因突變患兒組75例(對(duì)照組)?；純褐心?7例，女45例；植入年齡1～6歲，平均(2.2±1.6)歲。納入標(biāo)準(zhǔn)：術(shù)前殘余聽(tīng)力和術(shù)后康復(fù)條件較為接近，無(wú)圍手術(shù)期并發(fā)癥；手術(shù)均由同一術(shù)者完成，植入電極型號(hào)相同。術(shù)前行顳骨CT及顱腦MRI檢查排除嚴(yán)重耳蝸畸形或大腦發(fā)育不良等智力精神障礙、排除心肺功能不良等影響全麻安全的因素。前庭水管擴(kuò)大(LVAS)7例，有明確氨基糖甙類藥物使用史3例，所有病例均未發(fā)現(xiàn)家族遺傳史，其家庭散布貴州地區(qū)全境。在接受檢測(cè)之前，所有受檢者監(jiān)護(hù)人均簽署了耳聾基因檢測(cè)知情同意書(shū)。

1.2耳聾基因突變分析

1.2.1基因組DNA提取 采取患兒外周血，采用天根生化科技(北京)有限公司生產(chǎn)的離心柱形血液基因組DNA提取試劑盒(TIANamp Blood DNA Kit)提取靜脈血中的全基因組DNA。除工作液外均保存于-80 ℃超低溫冰箱中。

1.2.2遺傳性耳聾中相關(guān)的9個(gè)突變位點(diǎn)的檢測(cè) 采用博奧生物(北京)有限公司生產(chǎn)的九項(xiàng)遺傳性耳聾基因檢測(cè)試劑盒(Nine Deafness Gene Mutations Detection Kit)對(duì)中國(guó)人常見(jiàn)的4個(gè)耳聾基因9個(gè)突變位點(diǎn)(見(jiàn)表1)采用微陣列芯片法進(jìn)行檢測(cè)(詳見(jiàn)使用說(shuō)明書(shū))。

1.2.3基因編碼區(qū)測(cè)序 GJB2基因及GJB3基因編碼區(qū)測(cè)序，參照文獻(xiàn)[10]設(shè)計(jì)的引物序列合成測(cè)序引。SLC26A4基因引物序列及編碼區(qū)測(cè)序方法參見(jiàn)文獻(xiàn)[11]。線粒體DNA(mtDNA)基因引物序列及編碼區(qū)測(cè)序方法參見(jiàn)文獻(xiàn)[12]設(shè)計(jì)的方法。反應(yīng)條件：94 ℃預(yù)變性5 min，94 ℃變性30 s，退火溫度58 ℃下復(fù)性30 s，72 ℃延伸30 s，30個(gè)循環(huán)，反應(yīng)終止后72 ℃再延伸7 min，4 ℃保存。擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行正向引物測(cè)序，發(fā)現(xiàn)序列變異者則進(jìn)行反向引物測(cè)序證實(shí)。

1.2.4GJB2、GJB3、SLC26A4及mtDNA基因分析 PCR產(chǎn)物送北京天根生化科技有限公司進(jìn)行正向引物測(cè)序，發(fā)現(xiàn)序列變異者進(jìn)行反向引物測(cè)序證實(shí)。GJB2、GJB3、SLC26A4及線粒體基因測(cè)序結(jié)果應(yīng)用Genetool Lite軟件進(jìn)行測(cè)定序列與標(biāo)準(zhǔn)序列的比對(duì)，標(biāo)準(zhǔn)序列參照GJB2：NM-004004；GJB3：NM-024009； SLC26A4：ENSG00000091137；mtDNA：Cambridge sequence，NC -001807。

1.3手術(shù)方法 采取圓窗入路。全麻成功后，患者取平仰臥位，術(shù)耳朝上，固定頭部。以植入模板標(biāo)記植入位置，耳后切口翻瓣，皮瓣和肌骨膜瓣相對(duì)翻開(kāi)，暴露顱骨。準(zhǔn)備植入床、電極通道以植入模板確定植入床位置，磨薄顱骨，準(zhǔn)備與植入體大小相等的植入床，電極通道和固定小孔。圓窗開(kāi)窗徑路：首先切除乳突，暴露鼓竇入口及砧骨體，以此為標(biāo)志，盡量削低面神經(jīng)嵴，用小型金剛鉆頭在砧骨短腳、鼓索神經(jīng)和面神經(jīng)垂直段之間開(kāi)放后鼓室，暴露砧鐙關(guān)節(jié)及圓窗龕。植入人工耳蝸電極，小塊筋膜封閉小孔，固定植入體，縫合皮膚。

1.4人工耳蝸植入術(shù)后療效評(píng)估 參照聽(tīng)覺(jué)意義整合量表[13](MAIS)對(duì)學(xué)齡前兒童人工耳蝸植入術(shù)前后聽(tīng)覺(jué)能力的發(fā)展情況進(jìn)行分析。使用T.P.Nikolopoulos 等[14]提出的聽(tīng)覺(jué)行為分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)(CAP)和言語(yǔ)可懂度分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)(SIR)評(píng)估聾兒康復(fù)效果。P.K.Kuhl[15]認(rèn)為規(guī)范學(xué)語(yǔ)時(shí)期，即咿呀語(yǔ)爆發(fā)(babbing spurt)兒童發(fā)音的發(fā)育是兒童語(yǔ)言發(fā)育過(guò)程的里程碑。聾兒該階段常常缺失或延遲。CI兒童術(shù)后該時(shí)期的出現(xiàn)標(biāo)志著言語(yǔ)發(fā)育步入正軌。CI兒童術(shù)后定期調(diào)機(jī)時(shí)進(jìn)行隨訪評(píng)估均由同一名聽(tīng)力師進(jìn)行，隨訪至術(shù)后12個(gè)月。

1.5統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 用SPSS16.0軟件對(duì)評(píng)估結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。組間數(shù)據(jù)差異統(tǒng)計(jì)學(xué)意義比較用Kruskal-Wallis Test檢驗(yàn)及One Way ANOVA檢驗(yàn)，P<0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1耳聾基因突變檢測(cè)分析 102例人工耳蝸植入患兒共檢測(cè)到27例基因突變(28個(gè)致聾基因突變位點(diǎn))。GJB2基因突變患兒中1例同時(shí)合并SLC26A4基因突變；線粒體12SrRNA 基因突變3例，其中2例為C1494T位點(diǎn)突變，1例為A1555G位點(diǎn)突變。在98例語(yǔ)前聾中共檢測(cè)到23例致聾基因突變，分別為GJB2、SLC26A4和線粒體12SrRNA基因突變。4例語(yǔ)后聾患兒中均檢測(cè)到致聾基因突變，SLC26A4基因突變2例，其中1例同時(shí)合并GJB2基因突變。3例有明確氨基糖甙類藥物使用史患兒中，2例查出12srRNA C1494T基因突變。7例LVAS患者中，5例查出SLC26A4基因突變，突變率71.43%(5/7)，但1例Mondini畸形患兒未檢測(cè)出基因突變。見(jiàn)表1。

表1 遺傳性耳聾相關(guān)的9個(gè)突變位點(diǎn)及突變例數(shù)分布(n)

2.2CI術(shù)后1年聽(tīng)覺(jué)言語(yǔ)發(fā)育結(jié)果 兩組患兒術(shù)后MAIS、CAP、SIR得分均較術(shù)前無(wú)明顯改善(P>0.05)。觀察組術(shù)后1年MAIS得分(21.980±4.458)分，CAP等級(jí)得分(5.788±0.498)分，SIR等級(jí)得分(5.526±0.898)分；對(duì)照組術(shù)后1年MAIS得分(23.120±2.186)分，CAP等級(jí)得分(5.298±0.899)分，SIR等級(jí)得分(5.122±0.898)分；兩組差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P>0.05)。術(shù)后規(guī)范學(xué)語(yǔ)出現(xiàn)時(shí)間的隨訪結(jié)果顯示，觀察組為(7.632±3.302)個(gè)月，平均為8個(gè)月，而對(duì)照組為(8.560±3.788)個(gè)月，平均為9個(gè)月左右出現(xiàn)，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見(jiàn)圖1。

注：①術(shù)前及術(shù)后1年MAIS隨訪結(jié)果；②術(shù)前及術(shù)后1年CAP隨訪結(jié)果；③術(shù)前及術(shù)后1年SIR隨訪結(jié)果；④術(shù)后規(guī)范學(xué)語(yǔ)出現(xiàn)時(shí)間隨訪結(jié)果。

圖1CI術(shù)后1年聽(tīng)覺(jué)言語(yǔ)發(fā)育結(jié)果

3 討 論

先天性耳聾的發(fā)病率為1/1 000，其中50%以上的患兒有遺傳背景。聾病分子流行病學(xué)調(diào)查數(shù)據(jù)顯示，GJB2、SLC26A4、線粒體12srRNA基因突變是導(dǎo)致中國(guó)遺傳性耳聾的3個(gè)最常見(jiàn)的致病基因。隨著耳聾基因研究及耳聾基因檢測(cè)技術(shù)的進(jìn)步，耳聾基因檢測(cè)技術(shù)已經(jīng)成為臨床耳聾病因?qū)W分析的有力工具，耳聾基因突變作為CI術(shù)后的影響也逐漸成為研究人員關(guān)注的因素之一[16-17]。CI手術(shù)是一種能夠幫助雙耳重度/極度感音神經(jīng)性聾患者獲得聽(tīng)覺(jué)的最有效途徑之一。

GJB2基因位于人類染色體13q12上，編碼連接蛋白(connexin，Cx)26，與遺傳性感音神經(jīng)性聾有關(guān)，可引起非綜合征性聾和綜合征性聾[18]。本研究中，16例明確為由GJB2基因突變導(dǎo)致，總的突變率為15.69%(16/102)，其中35delG位點(diǎn)突變1例(0.83%)，176del 16和299del AT各3例(2.94%)，而235delC為9例(8.82%)，這可能與本組病例均為極重度感音神經(jīng)性聾有關(guān)。研究[19]表明，GJB2基因突變導(dǎo)致的相關(guān)性耳聾病變位于耳蝸，但聽(tīng)覺(jué)通路及聽(tīng)神經(jīng)基本正常，因此用人工耳蝸替代發(fā)生病變的耳蝸，從理論上說(shuō)該類患者術(shù)后效果應(yīng)該較好。Y.J.Yan 等[20]研究發(fā)現(xiàn)GJB2基因突變組聽(tīng)覺(jué)言語(yǔ)發(fā)育優(yōu)于非基因突變及SLC26A4基因突變。本組102例患者行CI術(shù)后4周開(kāi)機(jī)調(diào)試發(fā)現(xiàn)舒適閾特性與閾值無(wú)顯著差異，隨訪發(fā)現(xiàn)GJB2基因突變組與其它基因突變組或非基因突變組相比聽(tīng)覺(jué)言語(yǔ)發(fā)育無(wú)明顯差異，但其相關(guān)性仍需擴(kuò)大樣本量并需長(zhǎng)期隨訪進(jìn)一步證實(shí)。

GJB3突變可以導(dǎo)致常染色體相關(guān)的遺傳性聾[21]，本研究未檢測(cè)到538C>T位點(diǎn)突變患兒，這可能與本組樣本較小及檢測(cè)位點(diǎn)較局限有關(guān)。

SLC26A4基因又稱PDS基因，定位于人類染色體7q31，編碼的Pendrin蛋白含有780個(gè)氨基酸[22]。SLC26A4基因突變是目前公認(rèn)的僅次于GJB2突變的引起感音神經(jīng)性聾的遺傳學(xué)病因[23]，也是我國(guó)導(dǎo)致感音神經(jīng)性耳聾的主要原因之一，中國(guó)人群頻發(fā)的熱點(diǎn)突變是IVS7-2 A>G和2168A>G。本研究中攜帶SLC26A4基因2168A>G位點(diǎn)突變患者3例(2.94%)和IVS7-2A>G位點(diǎn)突變6例(5.88%)，而后者均表現(xiàn)為前庭水管擴(kuò)大。SLC26A4基因表達(dá)于內(nèi)淋巴管、內(nèi)淋巴囊、橢圓囊、球囊等處，其表達(dá)區(qū)域較GJB2更廣乏，因此，其突變?cè)斐傻膿p害也更為廣乏、直接，因此，CI效果理論上應(yīng)該比GJB2患者差，這點(diǎn)從臨床上也得到證實(shí)[20]，也與我們的初步隨訪結(jié)果相符。本研究顯示，攜帶SLC26A4基因突變的聾兒，CI手術(shù)后在聲場(chǎng)助聽(tīng)聽(tīng)閾、言語(yǔ)感知和識(shí)別等聽(tīng)覺(jué)言語(yǔ)功能方面的重建效果良好，但在術(shù)后的的各項(xiàng)評(píng)估測(cè)試中的表現(xiàn)與非基因突變組比較沒(méi)有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。M.Gratacap等[24]研究認(rèn)為SCL26A4與CI術(shù)后療效無(wú)明顯相關(guān)性，這與本研究結(jié)果相似。

線粒體性耳聾分為綜合征型和非綜合征型，以非綜合征型耳聾較綜合征常見(jiàn)，多與氨基糖甙類藥物中毒性耳聾有關(guān)，尤其為1555腺嘌呤核苷向鳥(niǎo)尿環(huán)核苷突變(A1555G)[25-28]針對(duì)非綜合征型耳聾個(gè)案的CI效果比較良好。在本研究中，發(fā)現(xiàn)3例線粒體DNA 12RsRNA 基因突變(2.94%)；而3例有明確氨基糖甙類藥物史患兒中，2例檢出12SrRNA C1494T基因突變。本研究結(jié)果顯示在此類患兒CI術(shù)后的的各項(xiàng)評(píng)估測(cè)試中的表現(xiàn)與非基因突變組比較沒(méi)有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，這可能與本研究樣本較小，其相關(guān)性及突變比率需要進(jìn)一步擴(kuò)大樣本量進(jìn)行研究驗(yàn)證。

綜上所述，遺傳因素是耳聾的重要原因之一，多種致聾遺傳學(xué)病因已明確，其中包括GJB2基因突變相關(guān)耳聾，SLC26A4基因突變相關(guān)耳聾和線粒體DNA相關(guān)耳聾。通過(guò)貴州地區(qū)耳聾基因檢測(cè)，明確極重度感音神經(jīng)性聾患兒的致聾基因，初步評(píng)估CI術(shù)后效果，為深入研究遺傳性耳聾大群體以進(jìn)一步驗(yàn)證耳蝸植入有效性提供參考。