孫建松

(貴州省人民醫(yī)院耳鼻咽喉頭頸外科，貴州 貴陽 520002)

先天性極重度感音神經(jīng)性聾是影響人類健康和造成人類殘疾的常見疾病[1]。研究[2]發(fā)現(xiàn)，大約60%的先天耳聾由遺傳性因素導致。研究[3-9]發(fā)現(xiàn)，導致中國人群耳聾的三個最重要的致病基因SJB2、SLC26A4(PDS)和線粒體(mtDNA)12SrRNA(A1555G和C1494T)檢出率分別為21%、14.5%和4.4%。目前臨床上對重度和極重度感音神經(jīng)性聾的惟一有效的治療方法是人工耳蝸植入(cochlear implant，CI)。我院為配合中國殘聯(lián)貧困聾兒人工耳蝸搶救性康復項目的順利啟動和正確實施，在貴州地區(qū)率先開展CI手術，術前應用基因診斷技術對102例接受CI手術的極重度感音神經(jīng)性聾患兒GJB2、GJB3、SLC26A4和線粒體12SrRNA突變位點進行檢測，分析他們可能的致病基因。本研究基于對此類致聾基因與CI術后的療效觀察，初步探討致聾基因與CI術后的相關性，為術前預估術后效果提供臨床參考，也為建立和完善符合中國耳聾人群遺傳特征的基因篩查提供參考。

1 資料與方法

1.1一般資料 選擇2012年6月至2014年5月在我院接受單側CI的兒童102例，其中語前聾98例，語后聾4例。根據(jù)耳聾基因檢測結果分為兩組：耳聾基因突變患兒組27例(觀察組)，未檢出耳聾基因突變患兒組75例(對照組)?；純褐心?7例，女45例；植入年齡1～6歲，平均(2.2±1.6)歲。納入標準：術前殘余聽力和術后康復條件較為接近，無圍手術期并發(fā)癥；手術均由同一術者完成，植入電極型號相同。術前行顳骨CT及顱腦MRI檢查排除嚴重耳蝸畸形或大腦發(fā)育不良等智力精神障礙、排除心肺功能不良等影響全麻安全的因素。前庭水管擴大(LVAS)7例，有明確氨基糖甙類藥物使用史3例，所有病例均未發(fā)現(xiàn)家族遺傳史，其家庭散布貴州地區(qū)全境。在接受檢測之前，所有受檢者監(jiān)護人均簽署了耳聾基因檢測知情同意書。

1.2耳聾基因突變分析

1.2.1基因組DNA提取 采取患兒外周血，采用天根生化科技(北京)有限公司生產(chǎn)的離心柱形血液基因組DNA提取試劑盒(TIANamp Blood DNA Kit)提取靜脈血中的全基因組DNA。除工作液外均保存于-80 ℃超低溫冰箱中。

1.2.2遺傳性耳聾中相關的9個突變位點的檢測 采用博奧生物(北京)有限公司生產(chǎn)的九項遺傳性耳聾基因檢測試劑盒(Nine Deafness Gene Mutations Detection Kit)對中國人常見的4個耳聾基因9個突變位點(見表1)采用微陣列芯片法進行檢測(詳見使用說明書)。

1.2.3基因編碼區(qū)測序 GJB2基因及GJB3基因編碼區(qū)測序，參照文獻[10]設計的引物序列合成測序引。SLC26A4基因引物序列及編碼區(qū)測序方法參見文獻[11]。線粒體DNA(mtDNA)基因引物序列及編碼區(qū)測序方法參見文獻[12]設計的方法。反應條件：94 ℃預變性5 min，94 ℃變性30 s，退火溫度58 ℃下復性30 s，72 ℃延伸30 s，30個循環(huán)，反應終止后72 ℃再延伸7 min，4 ℃保存。擴增產(chǎn)物進行正向引物測序，發(fā)現(xiàn)序列變異者則進行反向引物測序證實。

1.2.4GJB2、GJB3、SLC26A4及mtDNA基因分析 PCR產(chǎn)物送北京天根生化科技有限公司進行正向引物測序，發(fā)現(xiàn)序列變異者進行反向引物測序證實。GJB2、GJB3、SLC26A4及線粒體基因測序結果應用Genetool Lite軟件進行測定序列與標準序列的比對，標準序列參照GJB2：NM-004004；GJB3：NM-024009； SLC26A4：ENSG00000091137；mtDNA：Cambridge sequence，NC -001807。

1.3手術方法 采取圓窗入路。全麻成功后，患者取平仰臥位，術耳朝上，固定頭部。以植入模板標記植入位置，耳后切口翻瓣，皮瓣和肌骨膜瓣相對翻開，暴露顱骨。準備植入床、電極通道以植入模板確定植入床位置，磨薄顱骨，準備與植入體大小相等的植入床，電極通道和固定小孔。圓窗開窗徑路：首先切除乳突，暴露鼓竇入口及砧骨體，以此為標志，盡量削低面神經(jīng)嵴，用小型金剛鉆頭在砧骨短腳、鼓索神經(jīng)和面神經(jīng)垂直段之間開放后鼓室，暴露砧鐙關節(jié)及圓窗龕。植入人工耳蝸電極，小塊筋膜封閉小孔，固定植入體，縫合皮膚。

1.4人工耳蝸植入術后療效評估 參照聽覺意義整合量表[13](MAIS)對學齡前兒童人工耳蝸植入術前后聽覺能力的發(fā)展情況進行分析。使用T.P.Nikolopoulos 等[14]提出的聽覺行為分級標準(CAP)和言語可懂度分級標準(SIR)評估聾兒康復效果。P.K.Kuhl[15]認為規(guī)范學語時期，即咿呀語爆發(fā)(babbing spurt)兒童發(fā)音的發(fā)育是兒童語言發(fā)育過程的里程碑。聾兒該階段常常缺失或延遲。CI兒童術后該時期的出現(xiàn)標志著言語發(fā)育步入正軌。CI兒童術后定期調(diào)機時進行隨訪評估均由同一名聽力師進行，隨訪至術后12個月。

1.5統(tǒng)計學方法 用SPSS16.0軟件對評估結果進行統(tǒng)計學分析。組間數(shù)據(jù)差異統(tǒng)計學意義比較用Kruskal-Wallis Test檢驗及One Way ANOVA檢驗，P<0.05 為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結 果

2.1耳聾基因突變檢測分析 102例人工耳蝸植入患兒共檢測到27例基因突變(28個致聾基因突變位點)。GJB2基因突變患兒中1例同時合并SLC26A4基因突變；線粒體12SrRNA 基因突變3例，其中2例為C1494T位點突變，1例為A1555G位點突變。在98例語前聾中共檢測到23例致聾基因突變，分別為GJB2、SLC26A4和線粒體12SrRNA基因突變。4例語后聾患兒中均檢測到致聾基因突變，SLC26A4基因突變2例，其中1例同時合并GJB2基因突變。3例有明確氨基糖甙類藥物使用史患兒中，2例查出12srRNA C1494T基因突變。7例LVAS患者中，5例查出SLC26A4基因突變，突變率71.43%(5/7)，但1例Mondini畸形患兒未檢測出基因突變。見表1。

表1 遺傳性耳聾相關的9個突變位點及突變例數(shù)分布(n)

2.2CI術后1年聽覺言語發(fā)育結果 兩組患兒術后MAIS、CAP、SIR得分均較術前無明顯改善(P>0.05)。觀察組術后1年MAIS得分(21.980±4.458)分，CAP等級得分(5.788±0.498)分，SIR等級得分(5.526±0.898)分；對照組術后1年MAIS得分(23.120±2.186)分，CAP等級得分(5.298±0.899)分，SIR等級得分(5.122±0.898)分；兩組差異均無統(tǒng)計學意義(均P>0.05)。術后規(guī)范學語出現(xiàn)時間的隨訪結果顯示，觀察組為(7.632±3.302)個月，平均為8個月，而對照組為(8.560±3.788)個月，平均為9個月左右出現(xiàn)，差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。見圖1。

注：①術前及術后1年MAIS隨訪結果；②術前及術后1年CAP隨訪結果；③術前及術后1年SIR隨訪結果；④術后規(guī)范學語出現(xiàn)時間隨訪結果。

圖1CI術后1年聽覺言語發(fā)育結果

3 討 論

先天性耳聾的發(fā)病率為1/1 000，其中50%以上的患兒有遺傳背景。聾病分子流行病學調(diào)查數(shù)據(jù)顯示，GJB2、SLC26A4、線粒體12srRNA基因突變是導致中國遺傳性耳聾的3個最常見的致病基因。隨著耳聾基因研究及耳聾基因檢測技術的進步，耳聾基因檢測技術已經(jīng)成為臨床耳聾病因學分析的有力工具，耳聾基因突變作為CI術后的影響也逐漸成為研究人員關注的因素之一[16-17]。CI手術是一種能夠幫助雙耳重度/極度感音神經(jīng)性聾患者獲得聽覺的最有效途徑之一。

GJB2基因位于人類染色體13q12上，編碼連接蛋白(connexin，Cx)26，與遺傳性感音神經(jīng)性聾有關，可引起非綜合征性聾和綜合征性聾[18]。本研究中，16例明確為由GJB2基因突變導致，總的突變率為15.69%(16/102)，其中35delG位點突變1例(0.83%)，176del 16和299del AT各3例(2.94%)，而235delC為9例(8.82%)，這可能與本組病例均為極重度感音神經(jīng)性聾有關。研究[19]表明，GJB2基因突變導致的相關性耳聾病變位于耳蝸，但聽覺通路及聽神經(jīng)基本正常，因此用人工耳蝸替代發(fā)生病變的耳蝸，從理論上說該類患者術后效果應該較好。Y.J.Yan 等[20]研究發(fā)現(xiàn)GJB2基因突變組聽覺言語發(fā)育優(yōu)于非基因突變及SLC26A4基因突變。本組102例患者行CI術后4周開機調(diào)試發(fā)現(xiàn)舒適閾特性與閾值無顯著差異，隨訪發(fā)現(xiàn)GJB2基因突變組與其它基因突變組或非基因突變組相比聽覺言語發(fā)育無明顯差異，但其相關性仍需擴大樣本量并需長期隨訪進一步證實。

GJB3突變可以導致常染色體相關的遺傳性聾[21]，本研究未檢測到538C>T位點突變患兒，這可能與本組樣本較小及檢測位點較局限有關。

SLC26A4基因又稱PDS基因，定位于人類染色體7q31，編碼的Pendrin蛋白含有780個氨基酸[22]。SLC26A4基因突變是目前公認的僅次于GJB2突變的引起感音神經(jīng)性聾的遺傳學病因[23]，也是我國導致感音神經(jīng)性耳聾的主要原因之一，中國人群頻發(fā)的熱點突變是IVS7-2 A>G和2168A>G。本研究中攜帶SLC26A4基因2168A>G位點突變患者3例(2.94%)和IVS7-2A>G位點突變6例(5.88%)，而后者均表現(xiàn)為前庭水管擴大。SLC26A4基因表達于內(nèi)淋巴管、內(nèi)淋巴囊、橢圓囊、球囊等處，其表達區(qū)域較GJB2更廣乏，因此，其突變造成的損害也更為廣乏、直接，因此，CI效果理論上應該比GJB2患者差，這點從臨床上也得到證實[20]，也與我們的初步隨訪結果相符。本研究顯示，攜帶SLC26A4基因突變的聾兒，CI手術后在聲場助聽聽閾、言語感知和識別等聽覺言語功能方面的重建效果良好，但在術后的的各項評估測試中的表現(xiàn)與非基因突變組比較沒有統(tǒng)計學差異。M.Gratacap等[24]研究認為SCL26A4與CI術后療效無明顯相關性，這與本研究結果相似。

線粒體性耳聾分為綜合征型和非綜合征型，以非綜合征型耳聾較綜合征常見，多與氨基糖甙類藥物中毒性耳聾有關，尤其為1555腺嘌呤核苷向鳥尿環(huán)核苷突變(A1555G)[25-28]針對非綜合征型耳聾個案的CI效果比較良好。在本研究中，發(fā)現(xiàn)3例線粒體DNA 12RsRNA 基因突變(2.94%)；而3例有明確氨基糖甙類藥物史患兒中，2例檢出12SrRNA C1494T基因突變。本研究結果顯示在此類患兒CI術后的的各項評估測試中的表現(xiàn)與非基因突變組比較沒有統(tǒng)計學差異，這可能與本研究樣本較小，其相關性及突變比率需要進一步擴大樣本量進行研究驗證。

綜上所述，遺傳因素是耳聾的重要原因之一，多種致聾遺傳學病因已明確，其中包括GJB2基因突變相關耳聾，SLC26A4基因突變相關耳聾和線粒體DNA相關耳聾。通過貴州地區(qū)耳聾基因檢測，明確極重度感音神經(jīng)性聾患兒的致聾基因，初步評估CI術后效果，為深入研究遺傳性耳聾大群體以進一步驗證耳蝸植入有效性提供參考。