汪育娟 杜鵑 江義笛 陳筑△

(1.貴陽市口腔醫(yī)院牙體牙髓病科，貴州 貴陽 550001；2.東陽市中醫(yī)院，浙江 金華 322100)

慢性牙周病是人類口腔疾病中最常見的感染性疾病之一，在我國35～44歲的成人中，慢性牙周病的發(fā)病率高達(dá)97.2%[1]。隨著慢性牙周炎的不斷進(jìn)展，在牙周炎晚期時(shí)，可以因牙周支持組織及牙槽骨的大量喪失導(dǎo)致牙齒脫落，這也是目前我國成人失牙的首要原因。有研究[2]證實(shí)，在慢性牙周炎的發(fā)病過程中，宿主對致病菌的免疫應(yīng)答的異常，與嚙齒類動(dòng)物慢性牙周炎發(fā)生、發(fā)展有密切的關(guān)系。因此，本實(shí)驗(yàn)通過檢測慢性牙周炎小鼠模型中，免疫細(xì)胞—脾臟細(xì)胞表面分子的表達(dá)情況及小鼠血清中各型細(xì)胞因子的變化情況，探討相關(guān)因子在牙周炎發(fā)展過程中的作用，為進(jìn)一步理解慢性牙周炎的發(fā)病機(jī)制及免疫調(diào)節(jié)治療提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1主要實(shí)驗(yàn)試劑及儀器 腦心浸萃液態(tài)培養(yǎng)基(BHI，廣州環(huán)凱)；氯化血紅素(Sigma，美國)；抗酒石酸酸性磷酸酶染液(南京，建成)；FACS Calibur(Becton，Dickinson and Company，美國)；anti-mouse FITC-CD11b流式抗體(eBioscience，美國)；小鼠IFN-γ，IL-6，IL-10，TNF-α的ELISA檢測試劑盒(深圳晶美)。

1.2實(shí)驗(yàn)動(dòng)物和細(xì)菌菌株 選用健康C57BL/6小鼠，6～8周齡12只，雌性，無齲壞及牙周疾病，咬合關(guān)系正常。將小鼠分為兩組，PBS對照組和牙齦卟啉單胞菌(Porphyromonas.Gingivalis，P.Gingivalis)組。于室溫、相對濕度平均為50%且通風(fēng)、無菌條件下正常喂養(yǎng)飼料，自由飲水?dāng)z食。動(dòng)物利用細(xì)菌(或PBS)持續(xù)感染1周：每天利用棉棒蘸取菌液涂抹于小鼠口腔及牙面、牙齦溝處，每次感染1 h后再給予食物和飲水。將P.GingivalisATCC33277接種于含0.5%氯化血紅素的BHI血瓊脂培養(yǎng)基上，于37 ℃厭氧培養(yǎng)箱(10% CO2、10% H2、80% N2)培養(yǎng)5～7 d，待培養(yǎng)基表面可見明顯黑色菌落，革蘭染色形態(tài)檢查為純培養(yǎng)物時(shí)，刮取菌落，重懸至BHI液體培養(yǎng)基內(nèi)，培養(yǎng)24 h后，于紫外分光光度計(jì)600 nm處測定并計(jì)算細(xì)菌濃度(CFU/mL)。制備成109CFU/mL的菌液用于小鼠口腔、牙面和牙齦溝的感染。實(shí)驗(yàn)4周后，取小鼠外周血，將小鼠吸入CO2后處死取脾臟組織。

1.3流式細(xì)胞術(shù)檢測脾臟細(xì)胞表面分子 分別取感染組、對照組小鼠的脾臟，制備成脾臟組織單細(xì)胞懸液，分別加入FITC標(biāo)記抗CD11b抗體，4 ℃避光染色30 min后，250 g離心10 min，流式緩沖液洗滌3次。100 μL流式緩沖液重懸后，采用流式細(xì)胞儀檢測，F(xiàn)lowjo 6.0軟件分析流式細(xì)胞術(shù)結(jié)果。

1.4ELISA法檢測小鼠血清中各型細(xì)胞因子的水平 利用內(nèi)眥靜脈取血的方法采集小鼠靜脈血約1 mL，至于無菌不含抗凝劑的Ep管中，靜置30 min，離心(3 000 rpm/min，10 min)，分離收集上層血清，分裝后置于-20 ℃冰箱內(nèi)冷凍保存。小鼠血清中IFN-γ，IL-6，IL-10，TNF-α含量的檢測按照ELISA試劑盒說明說進(jìn)行檢測。

2 結(jié) 果

2.1小鼠脾臟細(xì)胞表面分子CD11b檢測結(jié)果 小鼠脾臟細(xì)胞表面分子CD11b的表達(dá)均呈現(xiàn)中高表達(dá)的趨勢，見表1。與對照組相比(圖1)，感染組小鼠的脾臟細(xì)胞表面分子CD11b表達(dá)率顯著高于對照組(P<0.05)。

圖1 小鼠脾臟細(xì)胞表面分子CD11b表達(dá)率

表1 小鼠脾臟細(xì)胞表面分子CD11b表達(dá)率(%)

2.2小鼠血清中各型細(xì)胞因子水平的檢測結(jié)果 小鼠血清中不同細(xì)胞因子TNF-α、IL-6、IFN-γ、IL-10的表達(dá)情況，見圖2。與對照組相比，感染組血清中TNF-α和IL-6的表達(dá)水平均升高(P<0.001)，IFN-γ的表達(dá)水平下降(P<0.01)，IL-10表達(dá)水平下降(P<0.01)，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

圖2 小鼠血清中各型細(xì)胞因子的表達(dá)水平

3 討 論

目前，較為公認(rèn)的慢性牙周炎致病菌為牙齦卟啉單胞菌[3]，其分泌的毒力因子例如脂多糖、菌毛素和蛋白酶等與牙周炎的發(fā)病有著密切的相關(guān)性[4]。利用Pg感染動(dòng)物模型口腔中的牙周組織，構(gòu)建慢性牙周炎的動(dòng)物模型也得到了很多學(xué)者的證實(shí)。慢性牙周炎的發(fā)生、發(fā)展及預(yù)后，與宿主T細(xì)胞的代謝和功能有著十分密切的聯(lián)系[5-6]，通常認(rèn)為宿主體內(nèi)活化的CD4+T淋巴細(xì)胞可以通過產(chǎn)生多種不同類型的細(xì)胞因子對炎癥和牙槽骨吸收的過程進(jìn)行調(diào)節(jié)，這其中，已經(jīng)有學(xué)者[7]證實(shí)了宿主體內(nèi)TNF-α細(xì)胞因子的水平與牙槽骨吸收密切相關(guān)，同時(shí)，也有報(bào)道證明了IL-6等細(xì)胞因子水平的高低，與成人慢性牙周炎的發(fā)病程度有明顯的相關(guān)性[8]。因此，研究動(dòng)物慢性牙周炎發(fā)病過程中，體內(nèi)細(xì)胞因子水平的變化，對于理解慢性牙周炎發(fā)病機(jī)制有很好的意義。

由于脾臟是體內(nèi)T細(xì)胞貯存和活化過程中重要的器官，在不同生理或病理過程中，脾臟細(xì)胞中T細(xì)胞的活化水平可以在一定程度上代表體內(nèi)T細(xì)胞水平的變化，因此，對脾臟細(xì)胞T細(xì)胞表面分子的研究有助于理解Pg感染小鼠后，動(dòng)物體內(nèi)T細(xì)胞活化水平的變化情況，也可以反映出宿主自身免疫細(xì)胞狀態(tài)，提示T細(xì)胞被致病菌誘導(dǎo)活化過程中的變化情況。CD11b作為骨髓來源的未分化成熟的重要表面分子[9]，是衡量體內(nèi)大量由骨髓發(fā)育而來的一系列未分化成熟細(xì)胞的重要標(biāo)志物，本研究中獲得的數(shù)據(jù)表明，在Pg感染的病理狀態(tài)下，動(dòng)物體內(nèi)的免疫器官(如脾臟)會(huì)聚集大量由骨髓發(fā)育而來的未分化成熟的T細(xì)胞；同時(shí)，CD11b作為T細(xì)胞表面分子，在細(xì)胞間的識別和信號傳導(dǎo)等方面也具有十分重要的作用，有研究證實(shí)了CD11b表面分子被封閉后，T細(xì)胞失去了其特有的增殖能力和免疫效應(yīng)的能力，也顯示出了這一表面分子的重要作用。

同時(shí)，由于細(xì)菌感染狀態(tài)下，機(jī)體的免疫系統(tǒng)會(huì)分泌產(chǎn)生TNF-α和IL-6等促炎因子改變宿主的免疫反應(yīng)，從而增加致病菌對宿主的易感性[10-11]，因此，需要對本動(dòng)物模型血清中的TNF-α和IL-6細(xì)胞因子進(jìn)行檢測，以確定系統(tǒng)免疫系統(tǒng)的變化情況。另一方面，TNF-α也是牙周病原體感染機(jī)體后最先誘導(dǎo)出的促炎因子之一，參與了牙周病的早期發(fā)展，其又可以通過刺激破骨細(xì)胞形成、誘導(dǎo)牙槽骨破壞和結(jié)締組織退化。IFN-γ、IL-10等細(xì)胞因子參與了造成機(jī)體牙周組織破壞的過程，因此也是慢性牙周炎發(fā)病過程中極為重要的指標(biāo)[12-15]。

因此，本實(shí)驗(yàn)證實(shí)了慢性牙周病動(dòng)物模型血清中，各型細(xì)胞因子的表達(dá)水平差異，提示了慢性牙周炎免疫狀態(tài)及T細(xì)胞功能的變化情況；同時(shí)對脾臟細(xì)胞中T細(xì)胞表面分子CD11b的表達(dá)情況進(jìn)行了研究，以期為慢性牙周炎發(fā)病機(jī)制提供更多的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

(本文圖1見封三)