馮靖，彭效明，李翠清，王騰，居瑞軍，湯晨洋，邱曉

(北京石油化工學(xué)院 燃料清潔化及高效催化減排技術(shù)北京市重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 化學(xué)化工國(guó)家級(jí)示范中心，北京 102617)

銀杏葉是我國(guó)藥用歷史悠久的中藥材，產(chǎn)量大、價(jià)格低廉。銀杏葉中總黃酮的藥理作用有抗癌、抗衰老、抗炎等。至今已從銀杏葉中分離得到46種黃酮類化合物，廣泛應(yīng)用在藥品、保健品中[1-5]。傳統(tǒng)方法提取量低，耗時(shí)長(zhǎng)，而微波-超聲聯(lián)合提取的方法可以提高提取效率，國(guó)內(nèi)外對(duì)此提取方法研究尚少，前景廣闊。大孔樹(shù)脂是一種穩(wěn)定的純化用吸附劑，具有效率高、選擇性強(qiáng)、可循環(huán)利用等優(yōu)點(diǎn)[6-8]。

本文采用微波-超聲雙輔助的方法從銀杏葉中提取黃酮類化合物粗品，探究大孔樹(shù)脂純化銀杏葉總黃酮的最佳工藝條件，純化效率高，且效果顯著。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 試劑與儀器

銀杏葉，飲片級(jí)；蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品；乙醇、硝酸鋁、亞硝酸鈉、氫氧化鈉、鹽酸均為分析純；大孔吸附樹(shù)脂HPD-100、D-101、AB-8、DM130、DM-301均為工業(yè)品，性質(zhì)見(jiàn)表1。

表1 大孔樹(shù)脂的性質(zhì)Table 1 Macroporous resin properties

CP224C天平；UV-2600紫外-可見(jiàn)光分光光度計(jì)；DT5-4B低速離心機(jī)；KQ-300DB超聲波清洗機(jī)；JY96-IIN超聲波細(xì)胞粉碎機(jī)；ZN-20L小型粉碎機(jī)；XH-100A微波催化合成萃取儀；SHB-III循環(huán)水式多用真空泵；DF-101S集熱式磁力加熱攪拌器；HY-4調(diào)速多用振蕩器；WB-2000水浴鍋；R-1001VN旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀；DL-1510節(jié)能型低溫冷卻液循環(huán)機(jī)；10N冷凍干燥機(jī)。

1.2 銀杏葉中黃酮類化合物的提取

25 mL錐形瓶中加入銀杏葉0.5 g，10 mL的70%乙醇溶液，置于微波萃取合成發(fā)生器中，微波功率100 W，微波時(shí)間2 min，隨后放入超聲波細(xì)胞粉碎儀中，超聲功率75 W，超聲時(shí)間8 min，放入低速離心機(jī)中，轉(zhuǎn)速1 500 r/min，離心時(shí)間3 min。取上清液，放入25 mL錐形瓶中。離心管中固體進(jìn)行二次提取，兩次上清液混合為提取液，將提取液旋蒸，保證液體中沒(méi)有乙醇后預(yù)凍36 h[9-10]，隨后凍干樣品至樣品溫度為常溫，得到粗品，純度為24%，粗品配制成0.75 mg/mL 的黃酮類化合物水溶液，備用[11]。

1.3 黃酮粗品的純化

1.3.1 大孔樹(shù)脂的預(yù)處理 大孔樹(shù)脂用去離子水沖洗，除去白色漂浮物，吸水紙吸走樹(shù)脂表面的水分，樹(shù)脂用95%乙醇浸泡24 h。用去離子水淋洗樹(shù)脂至無(wú)醇味，4% HCl溶液浸泡2 h。用去離子水淋洗樹(shù)脂至中性，4% NaOH 溶液浸泡2 h，用去離子水淋洗樹(shù)脂至中性，以濾紙吸去樹(shù)脂表面水分，備用[12]。

1.3.2 銀杏葉中總黃酮的純化 錐形瓶中加入大孔樹(shù)脂2 g，20 mL粗品黃酮類化合物含量為0.75 mg/mL的溶液，將錐形瓶置于搖床中，振蕩速率為100次/min，振蕩2 h，使之達(dá)到吸附平衡，取樣，用紫外分光光度儀在510 nm處測(cè)量吸光度，計(jì)算吸附率。

25 mL錐形瓶中加入達(dá)到吸附平衡的2 g大孔樹(shù)脂，20 mL 60%的乙醇水溶液，將錐形瓶置于搖床中，振蕩速率為100次/min，振蕩3 h，使之達(dá)到解吸平衡，取樣進(jìn)行檢測(cè)，計(jì)算解吸率。

吸附量Qt=(C0-Ct)/C0×V/M

吸附率(解吸率)At=(C0-Ct)/C0

其中，C0為吸附或解吸前溶液黃酮類化合物含量；Ct為吸附或解吸后溶液黃酮類化合物含量；V為溶液體積；M為樹(shù)脂質(zhì)量。

1.4 標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立

取蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品5.0 mg，去離子水定容至50 mL，配制成0.1 mg/mL的蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品母液，分別用移液槍移取母液0.00，0.10，0.2，0.4，0.6，0.8，1.0，1.4，1.6 mL到10 mL比色管中，70%乙醇溶液定容至2 mL，加入5% NaNO2水溶液 0.3 mL，搖勻靜置6 min，加入10% Al(NO)3水溶液 0.3 mL，搖勻靜置6 min，最后加入10% NaOH水溶液 3 mL，搖勻，靜置15 min。分別放入已經(jīng)校準(zhǔn)過(guò)基線的紫外分光光度儀中，依次在510 nm處測(cè)量吸光度，以吸光度作為縱坐標(biāo)，蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品濃度作為橫坐標(biāo)，繪制蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線[13]，見(jiàn)圖1，線性回歸得標(biāo)準(zhǔn)曲線方程y=12.257x+0.004。

圖1 蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.1 Rutin standard curve

2 結(jié)果與討論

2.1 大孔樹(shù)脂的篩選

5種大孔樹(shù)脂達(dá)到吸附和解吸平衡時(shí)的吸附率、吸附量、解吸率、解吸量見(jiàn)表2。

表2 5種大孔樹(shù)脂的吸附與解吸效果比較Table 2 Comparison of adsorption and desorption effects of five macroporous resins

由表2可知，吸附效果最好的是HPD-100與D101，二者吸附效果不相上下，吸附率均達(dá)到80%以上，而HPD-100的解吸率比D101高8.4%，可以使黃酮類化合物很好的被洗脫。因此，選定大孔樹(shù)脂HPD-100作為后續(xù)吸附黃酮類化合物的樹(shù)脂[14]。

2.2 大孔樹(shù)脂HPD-100吸附解吸動(dòng)力學(xué)

取大孔樹(shù)脂HPD-100 2 g于錐形瓶中，加入20 mL粗品黃酮類化合物含量為0.75 mg/mL的溶液，將錐形瓶置于搖床中，振蕩速率為100次/min，振蕩10，20，30，60，90，120，180，240 min，取樣 1 mL，進(jìn)行檢測(cè)，繪制大孔樹(shù)脂HPD-100的吸附動(dòng)力學(xué)曲線，利用Boyd擴(kuò)散方程計(jì)算樹(shù)脂對(duì)銀杏葉黃酮的吸附速率[15]。

Ln[Q平/(Q平-Qt)]=kt

式中Q平——吸附平衡時(shí)的吸附量，mg/g；

Qt——t時(shí)刻的吸附量，mg/g；

k——平衡速率常數(shù)。

25 mL錐形瓶中，分別加入達(dá)到吸附平衡的大孔樹(shù)脂HPD-100 2 g，20 mL 60%的乙醇水溶液，將錐形瓶置于搖床中，振蕩速率為100次/min。振蕩10，20，30，60，90，120，180，240 min取樣1 mL進(jìn)行檢測(cè)，繪制大孔樹(shù)脂HPD-100的解吸動(dòng)力學(xué)曲線，結(jié)果見(jiàn)圖2、圖3。

圖2 大孔樹(shù)脂HPD-100吸附動(dòng)力學(xué)曲線Fig.2 Adsorption kinetics curve of HPD-100

圖3 大孔樹(shù)脂HPD-100的解吸動(dòng)力學(xué)曲線Fig.3 Desorption kinetics curve of HPD-100

由圖2與圖3可知，大孔樹(shù)脂HPD-100在120 min達(dá)到吸附平衡，吸附率最高可達(dá)80.12%，吸附量3.68 mg/mL。解吸過(guò)程在180 min達(dá)到平衡，解吸率最高可達(dá)99.18%，解吸量 36.68 mg/mL，吸附與解吸速度很快，且效率高，根據(jù)Boyd擴(kuò)散方程擬合結(jié)果見(jiàn)表3。

表3 大孔樹(shù)脂HPD-100對(duì)黃酮類化合物的吸附動(dòng)力學(xué)方程Table 3 Adsorption kinetic equation of macroporous resin HPD-100 for flavonoids

由表3可知，樹(shù)脂HPD-100可以很好的擬合吸附效果，吸附速度快，擬合相關(guān)系數(shù)高，可以使得黃酮類化合物很好的被洗脫。

2.3 單因素實(shí)驗(yàn)

2.3.1 上樣濃度對(duì)黃酮類化合物吸附效果的影響 25 mL錐形瓶中，分別加入粗品黃酮類化合物含量為0.25，0.5，0.75，1.0，1.25，1.5 mg/mL的溶液20 mL，大孔樹(shù)脂HPD-100 2.0 g，錐形瓶放到空氣浴搖床中振蕩2 h。分別取樣檢測(cè)，吸附率最高所對(duì)應(yīng)的上樣濃度為最佳上樣濃度。

實(shí)驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)圖4。

圖4 上樣濃度對(duì)黃酮類化合物吸附率的影響Fig.4 Effect of loading concentration on the adsorption rate of flavonoids

由圖4可知，上樣濃度為0.75 mg/mL時(shí)，吸附率最高，達(dá)到80.98%，所以最佳上樣濃度為0.75 mg/mL。上樣液濃度過(guò)低，使得大孔樹(shù)脂沒(méi)有完全發(fā)揮吸附的效果，上樣液濃度過(guò)高，使得黃酮類化合物沒(méi)有完全被吸附，所以上樣液濃度過(guò)高或過(guò)低均會(huì)使得吸附率降低。

2.3.2 上樣液pH對(duì)黃酮類化合物吸附效果的影響 以稀釋的NaOH和HCl溶液調(diào)節(jié)0.75 mol/L的黃酮類化合物溶液pH至1，2，3，4，5，6，7，8，9各20 mL，加入大孔樹(shù)脂HPD-100 2.0 g，將錐形瓶放到空氣浴搖床中振蕩2 h。分別取樣，吸附率最高所對(duì)應(yīng)的上樣液pH為最佳上樣液pH。實(shí)驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)圖5。

由圖5可知，上樣液pH為6時(shí)吸附率最高，達(dá)到81.23%，所以最佳上樣液pH為6。當(dāng)上樣液pH高于7或者低于5時(shí)，過(guò)堿過(guò)酸的環(huán)境使得黃酮類化合物穩(wěn)定性較差。這可能由于黃酮類化合物結(jié)構(gòu)中存在酚羥基，使黃酮類化合物顯弱酸性，在弱酸性的條件下比較穩(wěn)定。

圖5 上樣液pH對(duì)黃酮類化合物吸附率的影響Fig.5 Effect of pH of the sample solution on the adsorption rate of flavonoids

2.3.3 上樣流速與上樣體積對(duì)大孔樹(shù)脂吸附效果的影響 向吸附平衡的樹(shù)脂上加入濃度60%的洗脫液，分別以0.5，1.0，1.5，2.0，2.5，3.0 BV/h的流速淋洗。每相隔10 mL測(cè)量收集液中黃酮濃度。上樣流速與上樣體積對(duì)吸附效果的影響見(jiàn)圖6。

圖6 上樣流速與上樣體積對(duì)吸附效果的影響Fig.6 The effect of load flow rate and loading volume on the adsorption effect

由圖6可知，當(dāng)流速為0.5 BV/h時(shí)，收集液體積達(dá)到160 mL時(shí)，泄露點(diǎn)出現(xiàn)，總黃酮濃度有上升趨勢(shì)，證明樹(shù)脂吸附將達(dá)到飽和，此時(shí)，黃酮類化合物與樹(shù)脂接觸比較充分，使得黃酮吸附率較高。當(dāng)流出液體積達(dá)到360 mL時(shí)，流出液濃度與上樣液濃度接近，吸附達(dá)到飽和。當(dāng)流速為1.0 BV/h時(shí)，收集液體積達(dá)到140 mL時(shí)，泄露點(diǎn)相比較0.5 BV/h提前出現(xiàn)，總黃酮濃度有上升趨勢(shì)，證明樹(shù)脂吸附將達(dá)到飽和，當(dāng)流出液體積達(dá)到360 mL時(shí)，流出液濃度與上樣液濃度接近，吸附達(dá)到飽和。當(dāng)流速為1.5 BV/h時(shí)，曲線沒(méi)有出現(xiàn)泄漏點(diǎn)，證明流速過(guò)快，樹(shù)脂和黃酮類化合物沒(méi)有充分接觸便流出，黃酮類化合物沒(méi)有完全被吸附，證明此流速是不合理的。

2.3.4 洗脫液濃度對(duì)黃酮類化合物解吸效果的影響 分別稱取10份2 g達(dá)到吸附平衡的樹(shù)脂置于錐形瓶中，加入10%，20%，30%，40%，50%，60%，70%，80%，90%，100%乙醇水溶液20 mL，放于空氣浴搖床上振蕩3 h，使之達(dá)到解吸平衡。分別測(cè)量解吸液中黃酮類化合物的含量，計(jì)算解吸率。解吸率最高時(shí)對(duì)應(yīng)的乙醇濃度即為最佳洗脫液濃度。實(shí)驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)圖7。

圖7 洗脫液濃度對(duì)黃酮類化合物解吸效果的影響Fig.7 Effect of eluent concentration on desorption of flavonoids

由圖7可知，洗脫液濃度60%時(shí)解吸率最高，達(dá)到99.99%。洗脫液濃度過(guò)低，造成黃酮類化合物解吸不完全，洗脫液濃度過(guò)高，解吸率呈現(xiàn)微弱下降趨勢(shì)，猜測(cè)原因是洗脫液濃度過(guò)高，破壞了黃酮類化合物結(jié)構(gòu)[15]。

2.3.5 洗脫液流速與洗脫液體積對(duì)大孔樹(shù)脂吸附效果的影響 吸附平衡的樹(shù)脂上加入濃度60%的洗脫液，分別以0.5，1.0，1.5，2.0，2.5，3.0 BV/h的流速淋洗。每隔10 mL測(cè)量收集液中黃酮濃度。洗脫液流速與洗脫液體積對(duì)大孔樹(shù)脂吸附效果的影響見(jiàn)圖8。

圖8 洗脫液流速與洗脫液體積對(duì)大孔樹(shù)脂吸附效果的影響Fig.8 Effect of eluent flow rate and eluent volume on adsorption of microporous resin

由圖8可知，當(dāng)洗脫流速為2.0 BV/h 以及2.5 BV/h時(shí)，峰型尖銳且無(wú)拖尾現(xiàn)象，當(dāng)洗脫流速為2.0 BV/h，解吸率最高，解吸量也最高。所以洗脫流速為2.0 BV/h時(shí)，洗脫效果最佳，最佳洗脫體積為55 mL時(shí)解吸率最高，達(dá)到95.28%，解吸量達(dá)到2.57 mg/g。當(dāng)流速小于2.0 BV/h或大于2.5 BV/h時(shí)，峰型較鈍，出現(xiàn)拖尾現(xiàn)象，洗脫不集中。因此實(shí)驗(yàn)中選擇2.0 BV/h。

2.4 大孔樹(shù)脂的再生

解吸完全后的樹(shù)脂用去離子水沖洗至無(wú)白色漂浮物，95%乙醇浸泡24 h。用去離子水淋洗樹(shù)脂至無(wú)醇味，4% HCl溶液浸泡2 h。用去離子水淋洗樹(shù)脂至中性，4% NaOH 溶液浸泡2 h。用去離子水淋洗樹(shù)脂至中性(pH=7.0)，濾紙吸去樹(shù)脂表面水分，再次使用。大孔樹(shù)脂HPD-100再生次數(shù)對(duì)大孔樹(shù)脂吸附效果的影響見(jiàn)圖9。

圖9 大孔樹(shù)脂再生次數(shù)對(duì)黃酮類化合物吸附效果的影響Fig.9 Effect of regeneration times of macroporous resin on adsorption of flavonoids

由圖9可知，大孔樹(shù)脂利用6次，靜態(tài)吸附率為74.4%，7次以上，黃酮類化合物靜態(tài)吸附率降低到72.2%以下，且下降比較明顯，不利于回收再利用，所以大孔樹(shù)脂HPD-100可回收再利用6次。

2.5 銀杏葉總黃酮的純化驗(yàn)證性實(shí)驗(yàn)

按照最佳工藝條件，即上樣濃度0.75 mg/mL，pH=6，流速0.5 BV/h，體積360 mL，洗脫液乙醇濃度60%，流速2.0 BV/h，體積55 mL，對(duì)銀杏葉黃酮進(jìn)行動(dòng)態(tài)吸附與解吸，將洗脫后的溶液進(jìn)行旋蒸、凍干，得到銀杏葉黃酮精品，對(duì)精品進(jìn)行純度檢測(cè)，結(jié)果見(jiàn)表4。

表4 黃酮類化合物純化前后純度對(duì)比Table 4 Purity comparison of flavonoids before and after purification

由表4可知，黃酮類化合物的產(chǎn)物純度由24%提高到74%，且3次實(shí)驗(yàn)RSD值為1.9%，小于3%，符合要求，實(shí)驗(yàn)方案可行。

3 結(jié)論

考察了5種大孔樹(shù)脂對(duì)銀杏葉黃酮的吸附與解吸效果，結(jié)果表明，大孔樹(shù)脂HPD-100可作為銀杏葉黃酮的最佳吸附樹(shù)脂，吸附率高達(dá)81.23%，解吸率高達(dá)99.99%，最佳實(shí)驗(yàn)條件為：上樣濃度0.75 mg/mL，pH=6，流速0.5 BV/h，體積360 mL，洗脫液乙醇濃度60%，流速2.0 BV/h，體積55 mL。同時(shí)，此種樹(shù)脂2 h達(dá)到吸附平衡，3 h達(dá)到解吸平衡，吸附和解吸的速度快，凍干后銀杏葉黃酮純度可由24%提高到74%，大孔樹(shù)脂可回收再利用6次。大孔樹(shù)脂HPD-100非常適合銀杏葉總黃酮純化，相比較其他純化方法，選擇性強(qiáng)、環(huán)保、成本低廉，為銀杏葉黃酮的工業(yè)化提供了強(qiáng)有力的支持。