曹一鳴，朱永學(xué)

復(fù)旦大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院頭頸外科，復(fù)旦大學(xué)上海醫(yī)學(xué)院腫瘤學(xué)系，上海 200032

甲狀腺癌是臨床最常見(jiàn)的內(nèi)分泌系統(tǒng)惡性腫瘤，在全世界范圍內(nèi)約占全部惡性腫瘤的1%。近年來(lái)甲狀腺癌的發(fā)病率在全球范圍內(nèi)以每年接近4%的速度迅速升高，已成為全球發(fā)病率增長(zhǎng)最快的惡性腫瘤［1-4］。起源于甲狀腺濾泡上皮細(xì)胞的惡性腫瘤占全部甲狀腺癌的95%以上，主要包括甲狀腺乳頭狀癌（papillary thyroid cancer,PTC）、甲狀腺濾泡狀癌（follicular thyroid cancer，F(xiàn)TC）及甲狀腺低分化/未分化癌（anaplastic thyroid cancer/undifferentiated thyroid cancer，ATC/UTC），甲狀腺髓樣癌（medullary thyroid cancer，MTC）則起源于甲狀腺濾泡旁細(xì)胞（C細(xì)胞）。甲狀腺癌的發(fā)病目前認(rèn)為與頸部放射線(xiàn)接觸史、女性雌激素分泌等相關(guān)［5］，臨床診斷主要依賴(lài)醫(yī)師的體格檢查、甲狀腺超聲及細(xì)針抽吸細(xì)胞學(xué)檢查，但良惡性腫瘤的術(shù)前鑒別仍存在一定困難。甲狀腺癌的治療以手術(shù)治療和放射性131I治療為主，輔以甲狀腺激素抑制治療，總體預(yù)后相對(duì)較好，其中最常見(jiàn)的PTC術(shù)后10年生存率可達(dá)90%以上，但臨床上仍有部分病例侵襲性較強(qiáng)，容易出現(xiàn)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和復(fù)發(fā)［6-8］。目前臨床上對(duì)甲狀腺癌手術(shù)的范圍、頸部淋巴結(jié)清掃的選擇以及放射性131I治療的適應(yīng)證均存在爭(zhēng)議。表觀遺傳學(xué)研究或許可以為我們提供甲狀腺癌在早期診斷、治療方案選擇和預(yù)后評(píng)估方面的新思路。

近年來(lái)關(guān)于甲狀腺癌的遺傳學(xué)和表觀遺傳學(xué)研究逐漸增多，基因突變和甲基化改變?cè)诩谞钕侔┌l(fā)生、發(fā)展過(guò)程中可能發(fā)揮著重要作用。DNA甲基化是一種重要的表觀遺傳學(xué)的改變，它是指在DNA甲基轉(zhuǎn)移酶作用下，將甲基添加到DNA分子CpG二核苷酸的胞嘧啶殘基上，真核生物中CpG二核苷酸多存在于基因5’端啟動(dòng)子的CpG島區(qū)域中，啟動(dòng)子CpG島的甲基化改變具有調(diào)控基因表達(dá)、維持染色體完整性和調(diào)節(jié)DNA重組等作用［9］。因此在腫瘤細(xì)胞中，抑癌基因啟動(dòng)子的高甲基化改變可以使其表達(dá)降低，癌基因啟動(dòng)子的低甲基化改變可以使其表達(dá)升高，進(jìn)而調(diào)控腫瘤的生物學(xué)行為，甚至可能直接導(dǎo)致腫瘤的發(fā)生。DNA甲基化是惡性腫瘤發(fā)生中的一種常見(jiàn)改變，反映了環(huán)境因素與遺傳因素的相互作用，與遺傳學(xué)改變不同的是DNA甲基化具有可逆性，通過(guò)藥物治療可以實(shí)現(xiàn)去甲基化，從而恢復(fù)抑癌基因表達(dá)，達(dá)到治療腫瘤的作用，因此研究DNA的甲基化在腫瘤的發(fā)病機(jī)制、早期診斷和預(yù)后評(píng)估方面均具有重要意義［10］。

本研究致力于探索和發(fā)現(xiàn)在PTC中可能存在甲基化異常調(diào)控的基因，初步評(píng)估其在甲狀腺癌發(fā)生、發(fā)展中可能發(fā)揮的作用，并且希望找到未來(lái)可用于早期診斷和預(yù)后評(píng)估的新的分子標(biāo)志物。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 臨床標(biāo)本

收集2014年1月—2014年6月在復(fù)旦大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院頭頸外科初治行甲狀腺癌根治性手術(shù)的患者的甲狀腺癌組織及癌旁的相對(duì)正常甲狀腺組織共88對(duì)，所有標(biāo)本均經(jīng)病理組織學(xué)檢查確診為PTC，所有標(biāo)本收集后置于-80 ℃冰箱保存，所有患者的臨床和病理學(xué)特征見(jiàn)表1。

表1 標(biāo)本臨床數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)Tab.1 Clinicopathological features of PTC patients

1.1.2 主要實(shí)驗(yàn)儀器和試劑

溫度梯度PCR擴(kuò)增儀購(gòu)自美國(guó)Bio-Rad公司，生物電泳圖像分析儀購(gòu)自上海復(fù)日科技有限公司，紫外分光光度計(jì)購(gòu)自美國(guó)NanoDrop公司，DNA提取試劑盒天根生化科技（北京）有限公司，DNA膠回收試劑盒購(gòu)自美國(guó)Bio-Dev公司，PCR反應(yīng)試劑盒JumpStart購(gòu)自美國(guó)Sigma公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 DNA提取

取10 mg左右標(biāo)本組織徹底剪碎，放入1.5 mL離心管中，加入180 μL緩沖液GA，在室溫下放置使其充分混合。加入20 μL蛋白酶K，漩渦震蕩混勻10 s。在56 ℃環(huán)境下水浴2 h，期間通過(guò)漩渦振蕩混勻，待組織碎片完全消化后簡(jiǎn)短離心以收集附著在管壁及管蓋的液體。加入200 μL的緩沖液GB和1 μL Carrier RNA儲(chǔ)存液，充分顛倒混勻，70 ℃放置10 min，期間每3 min渦旋混勻10 s，簡(jiǎn)短離心以去除管蓋內(nèi)壁的液滴。加入200 μL無(wú)水乙醇，輕輕顛倒混勻樣品，室溫放置5 min，簡(jiǎn)短離心以去除管蓋內(nèi)壁的液滴。取上一步所得溶液全部轉(zhuǎn)入吸附柱中，12 000 r/min離心30 s，棄上清液，將吸附柱放回收集管中。向吸附柱中加入500 μL緩沖液GD，12 000 r/min離心30 s，棄上清液，將吸附柱放回收集管中。向吸附柱中加入600 μL漂洗液PW，12 000 r/min離心30 s，棄上清液，將吸附柱放回收集管中，重復(fù)1次，然后12 000 r/min離心2 min，倒掉上清液。將吸附柱置于室溫放置2～5 min。然后將吸附柱轉(zhuǎn)入一個(gè)干凈的1.5 mL離心管中，向吸附膜中間位置懸空滴加50 μL洗脫緩沖液TB，室溫放置5 min，12 000 r/min離心2 min將溶液收集到離心管中。通過(guò)紫外分光光度計(jì)檢測(cè)其含量和純度。

1.2.2 亞硫酸鹽處理

取1 μg標(biāo)本DNA加水至20 μL，加入3 mol/L的氫氧化鈉溶液2.3 μL，充分混勻后置于37 ℃溫浴15 min。加入亞硫酸鹽試劑230 μL，充分混勻，置于90 ℃避光溫浴30 min，簡(jiǎn)短離心以去除管蓋內(nèi)壁的液滴。將上一步所得溶液全部轉(zhuǎn)入DNA膠回收試劑盒的吸附柱中，將吸附柱放回收集管中。向吸附柱中加入500 μL溶膠液，9 000 r/min離心30 s，棄上清液，將吸附柱放回收集管中。向吸附柱中加入500 μL漂洗液，12 000 r/min離心30 s，棄上清液，將吸附柱放回收集管中。加入0.3mol/L的氫氧化鈉溶液300 μL，室溫靜置15 min，9 000 r/min離心30 s，棄上清液，將吸附柱放回收集管中。向吸附柱中加入500 μL漂洗液，12 000 r/min離心30 s，棄上清液，將吸附柱放回收集管中，重復(fù)1次。將吸附柱置于室溫放置5 min，然后將吸附柱轉(zhuǎn)入一個(gè)干凈的1.5 mL離心管中，向吸附膜中間位置懸空滴加75 μL洗脫緩沖液TB，室溫放置5 min，12 000 r/min離心3 min，重復(fù)1次，將DNA溶液收集到離心管中。

1.2.3 甲基化特異性PCR技術(shù)（methylation specific PCR，MSP）

PCR反應(yīng)體系：加入亞硫酸鹽處理過(guò)的DNA溶液4 μL、10×PCR緩沖液2 μL、10 mmol/L dNTP 0.5 μL、上下游引物（5 pmol/L）各2 μL、Taq DNA聚合酶（0.05 U/μL）0.3 μL，最后補(bǔ)充ddH2O至20 mL。

擴(kuò)增條件：94 ℃預(yù)變性3 min，94 ℃變性20 s，56～60 ℃（根據(jù)不同PCR片段的Tm）退火20 s，72 ℃延伸20s，循環(huán)35～36個(gè)周期，最后72 ℃延伸5 min。用2.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)PCR產(chǎn)物。

每組PCR反應(yīng)均包含陽(yáng)性對(duì)照與陰性對(duì)照，陽(yáng)性對(duì)照采用PTC組織提取的基因組DNA經(jīng)5-氮雜胞苷甲基化處理再由亞硫酸鹽處理制備而得，陰性對(duì)照采用ddH2O。RCP反應(yīng)引物采用http://www.urogene.org/methprimer/的網(wǎng)上引物設(shè)計(jì)軟件自行設(shè)計(jì)（MSP反應(yīng)引物見(jiàn)表2）。

1.3 研究方法

1.3.1 PTC全基因組甲基化譜式建立

早期研究中通過(guò)對(duì)1株P(guān)TC細(xì)胞株、1例正常甲狀腺組織和3對(duì)PTC組織及癌旁組織，行高通量甲基化DNA親和純化測(cè)序（Methylcap-Seq技術(shù)）初步建立甲狀腺癌全基因組甲基化譜式，數(shù)據(jù)上傳UCSC網(wǎng)站保存（http://genome.ucsc.edu/cgi-bin），通過(guò)生物信息學(xué)手段分析獲得可能存在差異的基因位點(diǎn)。

1.3.2 可疑位點(diǎn)初篩

通過(guò)對(duì)UCSC網(wǎng)站上數(shù)據(jù)的主觀分析，初步篩選出可疑存在異常甲基化的基因位點(diǎn)46個(gè)（表3）。篩選原則包括：①在基因啟動(dòng)子、增強(qiáng)子和第1外顯子中；②在CPG島中或島旁；③與甲基化峰值區(qū)域吻合；④癌組織甲基化程度與癌旁正常組織存在顯著差異。

表2 MSP引物序列Tab.2 Primer sequences of MSP

表3 初篩所得基因位點(diǎn)Tab.3 Aberrant methylation loci from screening

1.3.3 MSP篩查

針對(duì)初篩出的可疑基因位點(diǎn)分別設(shè)計(jì)MSP引物，用88對(duì)臨床標(biāo)本的DNA進(jìn)行MSP反應(yīng)檢驗(yàn)，挑選癌和癌旁存在顯著甲基化差異的基因位點(diǎn)，并分析基因甲基化與腫瘤臨床特征的關(guān)系。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

本研究使用SPSS 19.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，采用χ2檢驗(yàn)、logistic回歸分析等，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

根據(jù)前期工作Methylcap-Seq技術(shù)建立的甲狀腺癌全基因組甲基化譜式（圖1），通過(guò)生物信息學(xué)手段分析獲得可能存在差異的基因位點(diǎn)1 856個(gè)，進(jìn)一步根據(jù)主觀數(shù)據(jù)分析，初步篩選出可疑存在異常甲基化的基因位點(diǎn)46個(gè)（表3）。

圖1 甲狀腺癌全基因組甲基化譜式圖例Fig.1 The chromosome ideogram and methylation of NLRP6 by Methylcap-Seq

MSP結(jié)果最終提示HOXD10基因與FOXD2基因啟動(dòng)子區(qū)存在高甲基化改變：HOXD10基因在甲狀腺癌組織中44.4%存在高甲基化改變，而在癌旁組織中僅20.5%（P＜0.001）；FOXD2基因在甲狀腺癌組織中54.5%存在高甲基化改變，而在癌旁組織中僅38.6%（P＜0.001）。其余基因位點(diǎn)MSP結(jié)果差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（圖2，表4）。

圖2 MSP電泳圖例Fig.2 Electrophoretogram of MSP

表4 HOXD10和FOXD2基因在甲狀腺癌與癌旁組織的甲基化差異Tab.4 Difference in HOXD10 and FOXD2 methylation between PTC and adjacent tissue

分析HOXD10基因和FOXD2基因啟動(dòng)子高甲基化改變與患者臨床特征（年齡、性別、原發(fā)灶大小、是否外侵、是否多灶、是否伴有橋本甲狀腺炎、是否伴隨頸部淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移）的相關(guān)性。HOXD10基因高甲基化改變與甲狀腺癌病灶的多灶性相關(guān)（P＜0.01，OR=3.71），F(xiàn)OXD2基因高甲基化改變與甲狀腺癌病灶外侵相關(guān)（P＜0.01，OR=5.91，表5）。

表5 HOXD10和FOXD2甲基化改變與患者臨床病理學(xué)特征的相關(guān)性Tab.5 The relationship between methylation and clinicopathological features of PTC

3 討 論

近年來(lái)PTC發(fā)病率迅速上升，成為人們關(guān)注的熱點(diǎn)，但由于其預(yù)后相對(duì)較好，目前的研究方向多集中于甲狀腺癌的早期診斷及預(yù)后評(píng)估［6，11］。甲狀腺腫瘤的臨床診斷主要依賴(lài)臨床醫(yī)師的體格檢查和甲狀腺超聲，但難以區(qū)分良性和惡性腫瘤，細(xì)針抽吸細(xì)胞學(xué)檢查是近年來(lái)開(kāi)展的熱門(mén)領(lǐng)域，對(duì)甲狀腺癌術(shù)前診斷的靈敏度和特異性可達(dá)85%以上［12-13］，缺點(diǎn)為有創(chuàng)性檢查。另一方面雖然PTC的總體預(yù)后較好，但仍有部分患者出現(xiàn)反復(fù)復(fù)發(fā)，局部廣泛轉(zhuǎn)移以及131I治療抵抗，臨床上常稱(chēng)之為難治性PTC，目前臨床上對(duì)這部分患者的鑒別是一個(gè)重要的課題。因而尋求一種甲狀腺癌特異性的分子標(biāo)志物成為我們關(guān)注的焦點(diǎn)，希望其可以在PTC的早期診斷、治療方案選擇和預(yù)后評(píng)估方面提供幫助。表觀遺傳學(xué)已成為研究惡性腫瘤發(fā)生、發(fā)展及其轉(zhuǎn)歸的一個(gè)新方向，其中DNA甲基化更是最常見(jiàn)的表觀遺傳學(xué)改變，在腫瘤學(xué)研究中占據(jù)重要位置。相對(duì)于遺傳學(xué)研究，表觀遺傳學(xué)指標(biāo)作為分子標(biāo)志物的研究起步相對(duì)較晚，目前有研究表明，Rassf1A、TSHR、RARb2和TIMP3等抑癌基因和甲狀腺特異性基因均在甲狀腺癌中存在高甲基化改變和低表達(dá)調(diào)控，這與腫瘤發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)［14-16］，但這些基因均缺乏特異性，難以作為分子標(biāo)志物應(yīng)用于診斷和預(yù)后評(píng)估。本研究希望通過(guò)篩查PTC中存在異常甲基化的基因來(lái)獲取潛在的表觀遺傳學(xué)分子標(biāo)志物。

本研究篩查1 856個(gè)可疑甲基化位點(diǎn)，最終確定HOXD10與FOXD2兩個(gè)基因啟動(dòng)子區(qū)存在異常甲基化改變。HOXD10基因以往被認(rèn)為是一種特異性的轉(zhuǎn)錄因子，主要在細(xì)胞分化和胚芽發(fā)育過(guò)程中發(fā)揮調(diào)控作用［17］，幾年來(lái)研究發(fā)現(xiàn)HOX家族基因在腫瘤形成和發(fā)展中發(fā)揮重要作用［18-19］，部分基因（HoxB13、HoxA5、HoxC6等）已被證實(shí)在肺癌、乳腺癌、結(jié)腸癌中存在甲基化調(diào)控［20-22］。HOXD10基因也被證實(shí)在乳腺癌和胃癌中存在高甲基化改變。在甲狀腺癌中目前未見(jiàn)HOXD10功能及甲基化調(diào)控方面的研究報(bào)道，本研究發(fā)現(xiàn)，HOXD10基因在PTC中存在高甲基化改變，并且與腫瘤發(fā)病的多灶性相關(guān)，推測(cè)該基因很有可能在PTC中同樣發(fā)揮抑癌基因作用并受到甲基化調(diào)控，具體有待進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證。FOXD2基因是FOX轉(zhuǎn)錄因子家族的一員，F(xiàn)OX家族基因在胚胎發(fā)育過(guò)程中起著關(guān)鍵性的調(diào)控作用，與生長(zhǎng)發(fā)育、免疫調(diào)控以及腫瘤的發(fā)生相關(guān)，F(xiàn)OXE1、FOXP1等被認(rèn)為與基底細(xì)胞癌、乳腺癌和淋巴瘤發(fā)病密切相關(guān)［23］。FOXD2基因目前相關(guān)研究較少，有研究表明，在T淋巴細(xì)胞中，F(xiàn)OXD2基因通過(guò)調(diào)控cAMP通路依賴(lài)的蛋白激酶進(jìn)而調(diào)節(jié)cAMP通路的敏感性［24］，而cAMP通路正是甲狀腺癌中的重要信號(hào)通路，與TSH的調(diào)控密切相關(guān)，推測(cè)FOXD2基因甲基化有可能通過(guò)cAMP通路調(diào)控PTC的發(fā)生、發(fā)展，具體有待進(jìn)一步研究驗(yàn)證。

本研究旨在篩查出PTC中可能存在甲基化調(diào)控的基因位點(diǎn)。本研究的不足之處在于：第一，基因位點(diǎn)的選取上主觀因素過(guò)多，必然存在偏差；第二，標(biāo)本量不足，作為分子標(biāo)志物的篩查理應(yīng)盡量具備更充足的標(biāo)本量，但限于時(shí)間和工作量只收集了88對(duì)樣本進(jìn)行檢測(cè)，基因位點(diǎn)的篩選有可能存在遺漏和誤差；第三，僅有甲狀腺癌患者的標(biāo)本，沒(méi)有正常甲狀腺組織對(duì)照，且標(biāo)本均為術(shù)中收集，沒(méi)有術(shù)前穿刺標(biāo)本，因而對(duì)DNA甲基化的診斷預(yù)測(cè)價(jià)值難以做到客觀評(píng)估；第四，標(biāo)本收集過(guò)程中存在偏倚，由于大量甲狀腺乳頭狀微癌病灶過(guò)小，難以取得足夠的組織標(biāo)本進(jìn)行研究，因此研究對(duì)象中微癌患者比例較自然比例低；第五，MSP檢驗(yàn)僅采用甲基化引物，而無(wú)非甲基化引物對(duì)照，由于本研究為篩查實(shí)驗(yàn)并非驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)，因而僅關(guān)注其甲基化陽(yáng)性結(jié)果而省略了非甲基化組的對(duì)照。

鑒于HOXD10與FOXD2基因在PTC中存在高甲基化改變，我們認(rèn)為甲狀腺癌的發(fā)生、發(fā)展可能受到HOXD10與FOXD2基因的甲基化修飾調(diào)控，HOXD10與FOXD2基因的甲基化修飾有望成為PTC特異性的分子標(biāo)志物。