張慧儉，劉佃溫，周曉麗，劉永剛，李 敏，劉世舉

1.河南中醫(yī)藥大學針灸推拿學院，河南 鄭州 450000；2.河南中醫(yī)藥大學第三附屬醫(yī)院肛腸外科，河南 鄭州450000；3.河南省腫瘤醫(yī)院普外科，河南 鄭州 450000

目前結直腸癌在中國的發(fā)病率呈逐年上升趨勢，每年新發(fā)病例為37.5萬，死亡病例為19.1萬［1］。近年來，結直腸癌靶向治療領域進展迅速，不同作用靶點的藥物給結直腸癌患者帶來了不同的治療選擇。在抗表皮生長因子受體方面，西妥昔單抗顯著降低患者進展風險［2］。在抗血管新生方面，貝伐珠單抗和瑞戈非尼的上市為患者帶了進一步的生存獲益［3］。在免疫治療方面，派姆單抗為微衛(wèi)星高度不穩(wěn)定的患者帶來新的治療選擇［4］。在輔助化療方面，基于對IDEA研究的結果，低危的Ⅲ期結腸癌推薦3個月的XELOX輔助化療方案［5］。這些不同的靶向藥物和治療模式都為患者帶來了顯著的生存獲益。

卡培他濱為基礎的輔助化療方案經過研究證實可顯著降低結直腸癌患者的術后復發(fā)風險［6］。然而，尚有很多影響該方案療效的因素。近年來免疫檢查點抑制劑成為腫瘤領域的新熱點，尤其是2018年，納武單抗在中國的上市給晚期非小細胞肺癌患者帶來新的治療希望［7］。程序性死亡配體1（programmed death-ligand 1，PD-L1）是近年來最熱門的分子，已成為目前免疫治療藥物的重要靶點［8］。該基因編碼的蛋白主要表達在腫瘤細胞表面，通過和激活的T細胞表面的PD-L1的結合后，抑制T細胞活性，引起T細胞凋亡，從而實現(xiàn)腫瘤細胞的免疫逃逸［9］。先前的研究表明，在多種腫瘤細胞中PD-L1均高表達，但是PD-L1的表達和患者的預后關系目前結論尚不統(tǒng)一［10］。

PD-L1基因位于染色體9p24.1，包含8個外顯子。作為程序性死亡配體家族中的一員，PD-L1在不同腫瘤患者中的表達也會呈現(xiàn)較大的個體差異［11］。Xie等［12］的研究探討了在肝癌患者當中，PD-L1基因遺傳變異位點rs2297136的臨床意義。研究結果提示，在肝癌患者中PD-L1基因的多態(tài)性位點與肝癌的易感性及預后均顯著相關。然而，目前在結直腸癌輔助化療領域，尚未見PD-L1基因遺傳變異和預后的關聯(lián)研究。

因此，本研究旨在評估PD-L1基因rs2297136位點對接受卡培他濱為基礎輔助化療的結直腸癌患者的無病生存期（disease-free survival，DFS）和總生存期（overall survival，OS）的影響，并探討該位點對結直腸癌組織中PD-L1基因mRNA表達水平的影響。

1 資料和方法

1.1 研究設計及入組患者基線臨床資料

研究設計為回顧性分析，納入2010年1月—2017年12月在河南省腫瘤醫(yī)院普外科和河南中醫(yī)藥大學第三附屬醫(yī)院肛腸外科納入接受手術切除治療的結直腸癌患者。具體的入組標準包括：①年齡：18～80歲，美國東部腫瘤協(xié)作組（Eastern Oncology Cooperative Group，ECOG）評分在0～2分，心功能正常（左心室射血分數(shù)＞50%），腎功能正常（肌酐≤1.5×ULN），骨髓功能正常（中性粒細胞計數(shù)≥1.5×109/L，血小板計數(shù)≥100×109/L，血紅蛋白≥9 g/dL）；②病理學診斷為結直腸癌患者且接受了手術切除治療；③預期壽命至少3個月。排除標準為：①沒有接受卡培他濱為基礎輔助化療的患者；②沒有合適標本檢測PD-L1基因遺傳變異的患者；③家族性腺瘤性息肉病，其他遺傳性結直腸癌綜合征；④直腸癌患者后期接受放療的患者；⑤失訪的患者。最終，符合入排標準并納入本研究的患者為213例。

接受卡培他濱為基礎的輔助化療，具體用法用量為：術后3～4周，卡培他濱，1 000 mg/m2，每天2次，第1～14天，每21 d為1個周期。奧沙利鉑，130 mg/m2，靜脈滴注，第1天。輔助化療結合患者情況6～8個周期。根據治療過程中出現(xiàn)的血液學或非血液學毒性調整相應的給藥劑量，一旦發(fā)生可能威脅生命的毒性反應時治療中止。本研究得到醫(yī)院倫理委員會的批準。

1.2 血液樣本收集DNA提取及基因分型

每位入組研究的患者在接受輔助化療之前收集患者的外周血樣本大約4 mL，用苯酚氯仿法提取基因組DNA，之后于-20 ℃保存。設計rs2297136位點的上下游PCR引物，對該位點及附近的DNA片段進行擴增，上游引物為：5’-GCTCCCTGTTTGACTCCATC-3’，下游引物為：5’-TTTTTCCCCAGACCACTTCC-3’，產物片段為274 bp，用TaqⅠ內切酶通過限制性片段長度多態(tài)性聚合酶鏈反應（polymerase chain reaction-restriction fragment length polymorphism，PCR-RFLP）方法對該位點進行基因分型。通過條帶大小判斷該位點的基因型。TT型1條條帶：1條274 bp條帶。TC型3條條帶：1條274 bp條帶，1條105 bp條帶，1條169 bp條帶。CC型2條條帶：1條105 bp條帶，1條169 bp條帶。部分樣本的分型結果通過直接測序的方法進行驗證。

1.3 組織樣本收集及PD-L1基因mRNA表達分析

納入研究的部分患者在手術過程中收集每個患者被切除的結直腸癌癌組織標本，最終納入79例癌組織標本，液氮保存。之后用TRIzol試劑進行RNA提取，采用羅氏診斷產品（上海）有限公司real-time PCR儀進行PD-L1基因mRNA表達分析，PD-L1基因的上游引物為：5’-CTTCCCGAGGCTCCGCACCA-3’，下游引物為：5’-GCCCCGATGAACCCCTAAAC-3’。實時熒光定量PCR（real-time fluorescence quantitative PCR，RTFQ-PCR）反應體系如下：SYBN Premix Ex Tag 溶液10 μL，PD-L1基因上游引物（20 μmol/L）0.2 μL，PD-L1基因下游引物（20 μmol/L）0.2 μL，ddH2O 7.6 μL，cDNA2 μL，反應體系總計20 μL，GAPDH mRNA 表達用作內參。PD-L1基因mRNA 用相對定量法2-ΔΔCt進行計算。

1.4 統(tǒng)計學處理

本研究當中所有的變量均采用SPSS統(tǒng)計分析軟件進行（19.0版本）相應的統(tǒng)計分析。χ2檢驗分析多態(tài)性位點基因分型是否符合哈迪溫伯格平衡。在基線臨床資料當中，離散型的變量和rs2297136位點不同基因型的分布采用χ2檢驗，當數(shù)據較少時用Fisher精確檢驗。連續(xù)型的變量和rs2297136位點不同基因型的分析采用非參數(shù)Mann-WhitneyU檢驗。

通過Stata繪制Kaplan-Meier曲線比較不同基因型患者DFS和OS的差異，曲線間的差異用對數(shù)秩和檢驗進行比較。DFS為從手術日至疾病進展或任何原因導致的死亡（以先發(fā)生的計算），OS為從手術日至任何原因導致的死亡，未出現(xiàn)進展死亡的，截至末次隨訪記錄。多變量分析時，對DFS構建采用COX風險比例模型，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 入組患者基線臨床資料

本研究入組的213例結直腸癌患者的基線臨床資料如表1所示，納入研究患者的中位年齡49歲，范圍為18～80歲。男性患者122例（57.28%）。ECOG評分中0分患者151例（70.89%）。結腸癌和直腸癌分別130和83例。腫瘤分化方面，高中低分化患者分別為45、145和16例。腫瘤分期上，Ⅱ期患者45例，Ⅲ期患者168例。錯配修復（mismatch repair，MMR）基因狀態(tài)上，錯配修復基因缺失（deficient mismatch repair，dMMR）患者12例，錯配修復基因存在（proficient mismatch repair，pMMR）患者135例，無法評價患者66例。輔助化療方面，接受卡培他濱單藥輔助化療患者52例，接受卡培他濱聯(lián)合奧沙利鉑輔助化療患者161例。

表1 213例結直腸癌患者的基線臨床資料及rs2297136位點基因型分布比較Tab.1 Comparison of baseline characteristics of 213 colorectal cancer patients according to rs2297136 genotype status

Rs2297136位點的基因分型結果為：野生TT型148例（69.48%），TC型59例（27.70%），CC型6例（2.82%），最小等位基因頻率為0.17，3種基因型分布頻率符合哈迪溫伯格平衡（P=0.967）。后期分析中把TC和CC基因型患者合并。該位點不同基因型患者在基線臨床資料中的分布基本均衡（表2）。

表2 構建的影響總生存期的基線臨床資料和多態(tài)性位點的單因素分析Tab.2 Univariate analysis for OS according to other characteristics and polymorphism

2.2 PD-L1基因rs2297136位點對預后的影響

本研究最后一次隨訪時間為2018年6月，所有患者從納入研究到最后一次隨訪的中位隨訪時間為65.4個月（隨訪時間7.2～90.0個月）。

納入研究的213例患者均按時復查評估，整體人群的中位DFS為4.6年（95% CI:3.83～5.35），中位OS為6.5年（95% CI：5.74～7.27）。

將TC和CC基因型患者合并后，共計65例。在針對DFS的單變量分析中，野生型TT基因型患者和TC/CC基因型患者在DFS上明顯不同，TT和TC/CC基因型患者的中位DFS分別為4.7和3.3年，差異有統(tǒng)計學意義（P=0.001，圖1）。

在OS方面，兩種基因型患者的中位OS分別為6.5和4.7年，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.001，圖2）。

圖1 PD-L1基因rs2297136位點不同基因型的213例結直腸癌患者的DFS曲線對比Fig.1 DFS of the 213 colorectal cancer patients according to PD-L1 rs2297136 genotype status

圖2 PD-L1基因rs2297136位點不同基因型的213例結直腸癌患者的OS曲線對比Fig.2 OS of the 213 colorectal cancer patients according to PD-L1 rs2297136 genotype status

為了進一步校正其他混雜因素的影響，本研究構建了COX風險比例模型，先進行了單因素分析。多變量分析時將單變量分析中差異有統(tǒng)計學意義的風險因素如年齡、ECOG評分、病理學分期及rs2297136位點納入該模型。經過多變量校正rs2297136位點對OS獨立的影響意義依然存在，差異無統(tǒng)計學意義（OR=1.89，P=0.006），其他的在COX模型當中差異有統(tǒng)計學意義的變量為年齡（OR=1.42，P=0.015）、ECOG評分（OR=2.21，P=0.005）和腫瘤分期（OR=2.98，P＜0.001，表3）。

2.3 PD-L1基因rs2297136位點對PD-L1基因mRNA表達的影響

本研究收集了79例術后切除的結直腸癌組織標本并納入表達分析。通過提取的RNA對PD-L1基因的mRNA表達情況進行探討，并與rs2297136位點的基因型進行相關性分析。首先對79例癌組織標本進行了rs2297136位點的基因分型，其中TT型55例，TC型21例，CC型3例，3種基因型分布頻率同樣符合哈迪溫伯格平衡（P=0.582）。TT型患者相對較少，同樣將TT型和CC型患者合并，共計24例。Rs2297136位點不同基因型患者的PD-L1基因mRNA表達如圖3所示，TC/CC型患者相對于野生型TT基因型患者，癌組織中PD-L1基因mRNA表達水平明顯較高（4.08±1.21vs2.67±1.88），差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.001）。

表3 對OS構建校正其他變量的多變量Cox風險比例模型Tab.3 Multivariate COX regression analysis for OS according to other characteristics

圖3 PD-L1基因rs2297136位點不同基因型PD-L1基因mRNA表達情況對比Fig.3 Relative expression level of PD-L1 gene mRNA according to PD-L1 rs2297136 status

3 討 論

本研究納入了213例經過手術切除的結直腸癌患者，通過對PD-L1基因rs2297136位點基因分型并和患者的預后進行關聯(lián)性分析，發(fā)現(xiàn)該位點攜帶C等位基因的TC/CC基因型患者相對于野生型TT型患者來說具有顯著較差的DFS和OS，并通過79例癌組織標本的PD-L1基因mRNA表達水平分析發(fā)現(xiàn)了該位點不同的基因型患者的mRNA表達水平呈現(xiàn)較大的差異。rs2297136位點可能通過影響PD-L1基因的mRNA表達進而改變接受卡培他濱為基礎輔助化療治療的結直腸癌患者的預后。

結直腸癌是異質性較強的惡性腫瘤，在臨床治療效果和預后上也有較大的個體差異［13］。目前已經有較多的可以預測結直腸癌療效的生物標志物的研究成果：2018年報道的胸苷磷酸化酶（thymidine phosphorylase，TYMP）基因多態(tài)性對接受卡培他濱輔助化療的結直腸癌患者療效影響［14］；2017年報道的亞甲基四氫葉酸還原酶（methylenetetrahydrofolate reductase，MTHFR）多態(tài)性對氟尿嘧啶療效的影響［15］；2016年報道的胸苷酸合成酶（thymidylate synthase，TS）多態(tài)性對結腸癌一線5-FU放療效果的影響［16］。這些研究結果都提示了藥物基因組學在結直腸癌療效預測方面的價值。

本研究在中國首次報道了結直腸癌患者接受卡培他濱為基礎的輔助化療方案時，PD-L1基因rs2297136位點的C等位基因攜帶者可能通過影響該基因的表達，從而改變接受卡培他濱為基礎輔助化療的結直腸癌患者的預后。首先，本研究中rs2297136位點的最小等位基因頻率為0.17，這和美國國家生物技術信息中心（National Center for Biotechnology Information，NCBI）數(shù)據庫中中國人群中的突變頻率一致，另外也與之前Xie等［12］的研究中rs2297136位點的分布頻率基本一致。Xie等［12］的研究納入225例肝癌患者和200位健康志愿者，通過對PD-L1基因上4個多態(tài)性位點進行基因分型。結果發(fā)現(xiàn)，rs2297136位點CC基因型與肝癌發(fā)生風險顯著相關。另外，在該位點和肝癌患者預后分析方面，Xie等［12］的研究和本研究結果也基本一致。他們的研究結果也表明，rs2297136位點較少等位基因攜帶患者的預后較差。然而，他們的研究并沒有深入探討該位點和PD-L1基因表達方面的關聯(lián)性。另外，Du等［17］的研究探討了位于PD-L1基因的3’-UTR區(qū)域的多態(tài)性rs2297136位點對非小細胞肺癌的易感性的影響，熒光素酶報告實驗的結果表明，rs2297136位點通過擾亂miR-296-5p、miR-138及PD-L1基因mRNA從而可影響非小細胞肺癌的易感性。他們研究的rs2297136位點的分布頻率與本研究不太一致，可能是納入研究的癌種差異，這在Xie等［12］納入的肝癌患者的研究中也初步提示有類似趨勢。然而Du等［17］的研究并沒有繼續(xù)探討rs2297136位點不同基因型患者的PD-L1基因表達情況。

另一方面，PD-L1是目前腫瘤免疫治療領域的熱點基因，多項免疫治療的臨床研究結果顯示，PD-L1的表達水平可以預測PD-1和PD-L1抑制劑的療效［18］。然而，在PD-L1基因表達水平和接受常規(guī)化療的結直腸癌患者預后的關聯(lián)上，目前尚存在較大的爭議。本研究結果初步表明PD-L1基因mRNA高表達的人群在接受卡培他濱輔助化療時具有較差的預后，這與之前Enkhbat等［19］的研究結果是一致的。他們的研究納入了116例手術切除的Ⅱ期和Ⅲ期的結直腸癌患者，分析了PD-1和PD-L1表達水平的相關性以及和預后的關系，發(fā)現(xiàn)PD-L1高表達的人群預后較差。然而，另一方面也有很多研究結果發(fā)現(xiàn)，PD-L1基因編碼的蛋白主要表達在腫瘤細胞表面，通過和激活的T細胞表面的PD-1的結合后，抑制T細胞活性，引起T細胞凋亡，在體內的作用還有一些尚不清楚。然而，也有部分臨床研究的結果表明PD-L1高表達人群患者的預后較好［20］。這些結果可能和納入研究樣本的異質性，接受輔助化療等情況相關，總之還需要進一步的深入研究。

總之，本研究發(fā)現(xiàn)了在中國結直腸癌人群當中PD-L1基因rs2297136位點是一個獨立的預后影響因素。當然，本研究也有部分局限性，首先納入研究的樣本量不大，沒有在大樣本當中評估該位點的預后指導意義。另外，研究為回顧性分析，有一些偏倚無法避免。不過本研究還是比較充分地對rs2297136位點的預后影響意義進行了評估，同時也從PD-L1基因mRNA表達層面去揭示了該位點造成預后差異的部分原因，對結直腸癌患者預后的指導具有臨床指導意義。