楊 穎，楊志芳，才 層，張瑞麗，路鵬霏，賈春麗，李志鵬，毛 睿，張 華，包永星

新疆醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院腫瘤中心，新疆 烏魯木齊 830011

肝細(xì)胞肝癌是一種常見的惡性腫瘤，在全球范圍發(fā)病率居第五位，死亡率居第三位［1］，近年來發(fā)病率呈逐年遞增的趨勢(shì)，嚴(yán)重威脅人類健康。肝癌起病隱匿，發(fā)展迅速，大多數(shù)患者確診時(shí)已到中晚期［2］，化療是目前中晚期患者主要治療手段。在臨床上順鉑（cisplatin，DDP）是肝癌的化療藥物之一，但由于肝癌細(xì)胞對(duì)化療藥物常出現(xiàn)敏感性下降，甚至產(chǎn)生多藥耐藥（multidrug resistance，MDR）的情況，從而導(dǎo)致治療效果不佳。因此，尋找增強(qiáng)肝癌化療敏感性的方法是一種提高肝癌治療效果的有效途徑。

MicroRNA（miRNA，miR）是一類長約22 nt的單鏈非編碼RNA，可通過調(diào)節(jié)與修飾不同靶點(diǎn)，在腫瘤細(xì)胞對(duì)化療藥物敏感性方面發(fā)揮重要作用［3-4］。近期研究發(fā)現(xiàn)，miR-27a-3p在肺鱗癌、結(jié)直腸癌和肝癌等多種腫瘤中低表達(dá)［5-7］，與腫瘤的生長、侵襲、轉(zhuǎn)移等生物學(xué)行為密切相關(guān)。但是，miR-27a-3p的表達(dá)水平與肝癌化療敏感性相關(guān)的報(bào)道尚不多見，本研究旨在探索其表達(dá)對(duì)肝癌細(xì)胞DDP敏感性的影響。

1 材料和方法

1.1 主要試劑及細(xì)胞系

人肝癌細(xì)胞系HepG2、PLC購自中國科學(xué)院典藏培養(yǎng)物保藏委員會(huì)細(xì)胞庫/中國科學(xué)院上海生命科學(xué)研究院細(xì)胞資源中心；胎牛血清、OPTI-MEM、DMEM培養(yǎng)基、胰蛋白酶-EDTA消化液購自美國Gibco公司；二甲亞砜（dimethyl sulfoxide，DMSO）購自美國Sigma公司；脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染試劑LipofectamineTM3000購自美國Invitrogen公司；miR-27a-3p相關(guān)質(zhì)粒購自上海吉?jiǎng)P基因化學(xué)技術(shù)有限公司；四甲基偶氮唑鹽（methyl thiazolyl tetrazolium，MTT）細(xì)胞增殖檢測(cè)試劑盒購自上海碧云天生物技術(shù)有限公司；PE-AnnexinV凋亡檢測(cè)試劑盒、PI/RNase染色液購自美國BD Pharmingen公司；蛋白［質(zhì)］印跡法（Western blot）檢測(cè)試劑盒購自瑞士Roche公司；PI3K、p-AKT、C-caspase-3和β-actin抗體購自美國Cell Signaling Technology 公司。

1.2 癌癥基因組圖譜（The Cancer Genome Atlas，TCGA）數(shù)據(jù)分析

我們使用公開可訪問的TCGA數(shù)據(jù)庫進(jìn)行TCGA數(shù)據(jù)分析（https：//tcga-data.nci.nih.gov/tcga/）。收集并分析372例肝細(xì)胞肝癌患者的臨床資料，包括年齡、性別、種族、TNM分期、和miR-27a-3p表達(dá)等。通過TCGA數(shù)據(jù)庫對(duì)miR-27a-3p進(jìn)行表達(dá)定量。根據(jù)TCGA規(guī)范化協(xié)議，值為上四分位數(shù)標(biāo)準(zhǔn)化。

1.3 細(xì)胞培養(yǎng)、轉(zhuǎn)染及分組

上述細(xì)胞系均接種于含有10%胎牛血清的高糖DMEM，在37 ℃、CO2體積分?jǐn)?shù)為5%的培養(yǎng)箱中溫育，取對(duì)數(shù)生長期的細(xì)胞用于實(shí)驗(yàn)。細(xì)胞轉(zhuǎn)染采用脂質(zhì)體瞬時(shí)轉(zhuǎn)染方法，將miR-27a-3p過表達(dá)質(zhì)粒（miR-27a）與陰性對(duì)照質(zhì)粒（miR-control）轉(zhuǎn)染肝癌細(xì)胞株HepG2；將miRinhibitor-27a-3p敲低質(zhì)粒（miR-inhibitor-27a）與陰性對(duì)照質(zhì)粒（miR-inhibitor-control）轉(zhuǎn)染PLC細(xì)胞；實(shí)驗(yàn)設(shè)立6組：HepG2過表達(dá)細(xì)胞miR-27a+DDP組，miR-control+DDP組，空白對(duì)照組+DDP組；PLC敲低細(xì)胞，miR-inhibitor-27a+DDP組，miR-inhibitor-control+DDP組，空白對(duì)照組+DDP組。

1.4 四甲基偶氮唑藍(lán)（methyl thiazolyl tetrazolium，MTT）法檢測(cè)細(xì)胞增殖

將肝癌細(xì)胞HepG2、PLC以4×104個(gè)/孔的密度接種到96孔板培養(yǎng)，轉(zhuǎn)染后培養(yǎng)24 h后加入藥物。實(shí)驗(yàn)組：為不同濃度DDP組（0、3、6、9和12 μg/mL），另設(shè)加藥對(duì)照組和空白組，每個(gè)濃度設(shè)3個(gè)復(fù)孔。加藥后的細(xì)胞繼續(xù)培養(yǎng)48 h后，于實(shí)驗(yàn)終止前4 h每孔加入10 μL的MTT溶液，繼續(xù)培養(yǎng)4 h。用酶標(biāo)儀測(cè)定各孔波長490 nm處的光密度值（D），計(jì)算并繪制藥物劑量-存活率曲線，利用GraphPad PRISM 6.0軟件計(jì)算IC50，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.5 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡

將肝癌細(xì)胞HepG2、PLC以4×104個(gè)/孔的密度接種到96孔板培養(yǎng)，轉(zhuǎn)染后培養(yǎng)48 h后加入DDP（3 μg/mL）。依據(jù)凋亡試劑盒說明書操作，采用流式細(xì)胞術(shù)進(jìn)行檢測(cè)。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.6 Western blot檢測(cè)

收集細(xì)胞，磷酸緩沖鹽溶液（phosphatebuffered saline，PBS）浸洗各組細(xì)胞2次后，于冰上加入細(xì)胞裂解液進(jìn)行裂解45 min，每隔15 min震蕩1次，后加入一定量的上樣緩沖液。加入一定量的蛋白樣品與十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE），濕轉(zhuǎn)法移到硝酸纖維素膜上，5%脫脂奶粉室溫溫育封閉2 h，溫育一抗，4 ℃過夜，PBS洗滌3遍，每次15 min。加入對(duì)應(yīng)的二抗溫育1 h，再次洗膜后加入熒光發(fā)光液檢測(cè)。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié)果

2.1 miR-27a-3p在肝癌組織中低表達(dá)

從公開可訪問的TCGA數(shù)據(jù)庫進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，發(fā)現(xiàn)miR-27a-3p的表達(dá)量在肝癌組織中明顯低于癌旁組織，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05，圖1）。提示miR-27a-3p可能是一種抑癌miR。

圖1 miR-27a-3p在肝癌組織與癌旁組織中的表達(dá)情況Fig.1 Expression of miR-27a-3p in hepatocellular carcinoma and adjacent tissues

2.2 miR-27a-3p可增強(qiáng)肝癌細(xì)胞對(duì)DDP的敏感性

采用MTT 實(shí)驗(yàn)檢測(cè)各組細(xì)胞活性，在不同濃度DDP（0、3、6、9和12 μg/mL）作用48 h 后，HepG2 過表達(dá)細(xì)胞中，實(shí)驗(yàn)組miR-27a+DDP 細(xì)胞對(duì)DDP 的半數(shù)抑制濃度（IC50）為（1.02±0.03）μg/mL，明顯低于對(duì)照組的I C50（1.27±0.08）μg/m L與空白組的I C50（1.73±0.08）μg/m L，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；在PLC 敲低細(xì)胞中，實(shí)驗(yàn)組miR-inhibitor-27a+DDP的IC50［（3.87±0.08）μg/m L］較對(duì)照組［（2.97±0.08）μg/m L］和空白組［（1.02±0.03）μg/mL］均明顯升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），以上空白組與對(duì)照組結(jié)果均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，提示miR-27a-3p可增強(qiáng)肝癌細(xì)胞對(duì)DDP的敏感性（圖2）。

圖2 不同濃度順鉑對(duì)2株肝癌細(xì)胞活性的抑制率Fig.2 Inhibitory rate of different concentrations of cisplatin on cell activity of hepatocellular carcinoma

2.3 miR-27a-3p可增強(qiáng)DDP促進(jìn)肝癌細(xì)胞凋亡的作用

采用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)各組細(xì)胞凋亡率，經(jīng)3 μg/mLDDP作用48 h后，在HepG2過表達(dá)細(xì)胞中，實(shí)驗(yàn)組miR-27a+DDP細(xì)胞凋亡率為（31.03±0.20）%，較對(duì)照組的（18.51±2.96）%與空白組的（8.73±1.58）%顯著升高（P＜0.05）；在PLC敲低細(xì)胞中，實(shí)驗(yàn)組miRinhibitor-27a+DDP凋亡率（5.57±0.26）%較對(duì)照組的（13.58±1.50）%和空白組（12.52±0.70）%均明顯降低（P＜0.05），提示miR-27a-3p可明顯增強(qiáng)DDP促進(jìn)肝癌細(xì)胞凋亡的作用（圖3）。

圖3 順鉑對(duì)2株肝癌細(xì)胞凋亡率的影響Fig.3 Effect of cisplatin on apoptotic rate of hepatocellular carcinoma cells

2.4 miR-27a-3p可促進(jìn)PI3K/AKT信號(hào)通路激活，增強(qiáng)肝癌細(xì)胞化療敏感性

Western blot檢測(cè)結(jié)果顯示，3 μg/L DDP作用48 h后，HepG2過表達(dá)細(xì)胞中，PI3K和p-AKT蛋白表達(dá)量在miR-control組高于miR-27a組，DDP組高于miR-27a+DDP組，而miR-27a組C-caspase-3表達(dá)量較miR-control組升高，miR-27a+DDP組較DDP組升高（P＜0.05）；在PLC敲低細(xì)胞中，PI3K和p-AKT蛋白表達(dá)量在DDP組中低于miR-inhibitor-27a+DDP組，在miR-inhibitorcontrol組低于miR-inhibitor-27a組（P＜0.05），而C-caspase-3表達(dá)量在DDP組較miR-inhibitor-27a+DDP組升高，在miR-inhibitor-control組較miR-inhibitor-27a組升高（P＜0.05）。這說明DDP作用于肝癌細(xì)胞后，PI3K/AKT/caspase-3通路處于激活狀態(tài)，可提高細(xì)胞凋亡率，而miR-27a-3p可增強(qiáng)這種效果（圖4）。

圖4 Western blot檢測(cè)順鉑作用后2株肝癌細(xì)胞PI3K/AKT信號(hào)通路中相關(guān)蛋白的表達(dá)Fig.4 Expression of proteins involved in PI3K/AKT signaling pathway of hepatocellular carcinoma cells treated with cisplatin detected by Western blot

3 討 論

肝癌已成為我國惡性腫瘤中的第二號(hào)殺手［8］，因其早期缺乏特異性癥狀和有效的篩查方法，大多數(shù)患者發(fā)現(xiàn)時(shí)已處于中晚期，錯(cuò)過了外科手術(shù)的最佳時(shí)機(jī)，而相關(guān)輔助治療的效果也十分有限［9-10］。雖然近年來肝癌的治療方案不斷更新和改進(jìn)，但由于在腫瘤治療過程中化療藥物的耐藥性在臨床上普遍存在，導(dǎo)致化療效果欠佳。近年來，隨著生物分子機(jī)制的研究不斷深入，研究發(fā)現(xiàn)miR作為一類長19～22 nt的內(nèi)源性非編碼小RNA，可以通過與靶基因特定區(qū)域互補(bǔ)配對(duì)結(jié)合，干預(yù)靶基因在轉(zhuǎn)錄后水平的表達(dá)，進(jìn)而影響腫瘤的發(fā)生、發(fā)展［11］。也有研究報(bào)道，miR作為一種重要的靶基因修飾因子，對(duì)調(diào)節(jié)腫瘤的生長、侵襲和化療耐藥性有不可或缺的作用［12］。因此，探討miR對(duì)增強(qiáng)肝癌化療敏感性的作用和調(diào)節(jié)機(jī)制，為提高肝癌化療效果奠定了一定實(shí)驗(yàn)依據(jù)和理論基礎(chǔ)。

DDP屬于細(xì)胞周期的非特異性藥物，可抑制癌細(xì)胞DNA復(fù)制過程，并損傷其細(xì)胞膜上的結(jié)構(gòu)，是一類較強(qiáng)的廣譜抗癌藥物，但在臨床治療中常容易發(fā)生腫瘤耐藥，從而降低療效［13］。Chen等［14］發(fā)現(xiàn)，miR-27a可以作為一種新的調(diào)節(jié)因子，通過抑制FZD7/β-catenin信號(hào)通路來逆轉(zhuǎn)肝癌細(xì)胞中的獲得性多藥耐藥。Zhang等［15］發(fā)現(xiàn)miR-27a通過促進(jìn)Apaf-1-caspase-9復(fù)合體的形成，增強(qiáng)大腸癌干細(xì)胞對(duì)腫瘤壞死因子（tumor necrosis factor，TNF）相關(guān)的凋亡誘導(dǎo)配體（TNF-related apoptosis-inducing ligand，TRAIL）的敏感性，從而改善大腸癌干細(xì)胞對(duì)TRAIL的化療抵抗性。本研究發(fā)現(xiàn)，miR-27a-3p在肝癌組織中的表達(dá)量明顯低于癌旁組織，這與Li等［16］的研究報(bào)道一致。MTT結(jié)果顯示，在HepG2過表達(dá)細(xì)胞中，不同濃度DDP作用48 h后，與對(duì)照組和空白組相比，實(shí)驗(yàn)組miR-27a+DDP細(xì)胞對(duì)DDP的半數(shù)抑制濃度（IC50）明顯降低，而PLC敲低細(xì)胞的結(jié)果相反，表明miR-27a-3p可增強(qiáng)DDP抑制肝癌細(xì)胞增殖的能力。值得關(guān)注的是，流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)結(jié)果顯示，HepG2過表達(dá)細(xì)胞經(jīng)3 μg/mLDDP作用48 h后，實(shí)驗(yàn)組miR-27a+DDP細(xì)胞凋亡率明顯升高，而將PLC敲低凋亡率卻降低，結(jié)果表明miR-27a-3p可增強(qiáng)DDP促進(jìn)肝癌細(xì)胞凋亡作用。上述結(jié)果與Chen等［14］的研究發(fā)現(xiàn)相似，即miR-27a-3p可能逆轉(zhuǎn)化療的多藥耐藥性，改善肝癌的化療敏感性，提高化療效果。以上結(jié)果提示，miR-27a-3p可能改善肝癌細(xì)胞株對(duì)DDP的敏感性。

PI3K/AKT信號(hào)級(jí)聯(lián)放大反應(yīng)是非常重要的細(xì)胞內(nèi)通路，經(jīng)常在多種腫瘤中激活［17］，最近的研究表明，PI3K/AKT通路在化療耐藥產(chǎn)生過程中起著重要的作用［18］。Zhang等［19］發(fā)現(xiàn)使用PI3K抑制劑LY294002阻斷PI3K/AKT信號(hào)通路可以逆轉(zhuǎn)肝癌細(xì)胞的EMT及耐藥，說明在肝癌化療耐藥機(jī)制中，PI3K/AKT通路激活是獲得性耐藥的重要途徑。而caspase-3是一種影響細(xì)胞凋亡的蛋白，在促進(jìn)腫瘤細(xì)胞凋亡過程中起重要作用。為探究miR-27a-3p是否可通過激活PI3K/AKT信號(hào)通路影響肝癌細(xì)胞凋亡。我們采用Western blot檢測(cè)各組細(xì)胞PI3K/AKT信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路相關(guān)蛋白及凋亡蛋白C-caspase-3的表達(dá)量。結(jié)果顯示，經(jīng)3 μg/mL DDP作用48 h后，在HepG2過表達(dá)細(xì)胞中，PI3K和p-AKT蛋白表達(dá)量在miR-control組、miR-27a組、DDP組和miR-27a+DDP組細(xì)胞中依次降低，而C-caspase-3表達(dá)量則依次升高，在PLC敲低細(xì)胞中趨勢(shì)完全相反，表明miR-27a-3p有通過調(diào)節(jié)PI3K/AKT信號(hào)通路促進(jìn)肝癌細(xì)胞凋亡進(jìn)而改善DDP化療敏感性的可能性。

綜上所述，本研究證明miR-27a-3p可調(diào)控PI3K/AKT通路介導(dǎo)在DDP化療敏感性中的作用，這將為增強(qiáng)DDP化療敏感性提供新的思路。