杲修杰， 王 尚， 劉偉麗， 王 坤， 陳照立， 王新興

(軍事科學(xué)院軍事醫(yī)學(xué)研究院環(huán)境醫(yī)學(xué)與作業(yè)醫(yī)學(xué)研究所， 天津 300050)

當(dāng)機(jī)體處于熱環(huán)境中時，會引起產(chǎn)熱增加、出汗增多、心血管系統(tǒng)緊張性增加、消化液分泌減弱、中樞神經(jīng)系統(tǒng)興奮性降低等應(yīng)激反應(yīng)。熱暴露溫度過高或持續(xù)時間過長可引起細(xì)胞凋亡，而線粒體在促凋亡信號和Caspases激活之間起著不可替代的作用，線粒體膜電位(mitochondrial membrane potential，MMP)降低是細(xì)胞凋亡的早期信號?；钚匝踝杂苫?reactive oxygen species, ROS)是需氧細(xì)胞在代謝過程中產(chǎn)生的一系列活性氧簇。中、高濃度的ROS通過細(xì)胞氧化應(yīng)激反應(yīng)誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡甚至導(dǎo)致其壞死，也可雙向調(diào)控某些腫瘤細(xì)胞的凋亡和增殖[1]。Sestrin2蛋白是一種重要的抗氧化應(yīng)激的蛋白，在細(xì)胞的生長、凋亡、自噬等過程中起著重要作用[2-4]。本實(shí)驗(yàn)通過調(diào)控Beas-2B細(xì)胞中Sestrin2蛋白的表達(dá)水平，探討Sestrin2在熱暴露引起的細(xì)胞凋亡過程中的保護(hù)作用，為深入研究熱暴露致細(xì)胞凋亡的分子機(jī)制提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞與主要試劑

Beas-2B細(xì)胞購于中國科學(xué)院典型培養(yǎng)物保藏委員會細(xì)胞庫，JC-1線粒體膜電位檢測試劑盒(北京雷根生物技術(shù)公司)，活性氧檢測試劑盒(上海碧云天生物技術(shù)公司)，Caspase-9活性檢測試劑盒(上海碧云天生物技術(shù)公司)，Annexin V-FITC細(xì)胞凋亡檢測試劑盒(上海碧云天生物技術(shù)公司)，Sestrin2和SOD一抗(美國Sigma公司)。

1.2 熱暴露細(xì)胞模型的建立

Beas-2B細(xì)胞培養(yǎng)使用含F(xiàn)BS10%的DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)，培養(yǎng)箱中CO2濃度為5%，溫度為37℃，使用胰酶消化液消化并傳代培養(yǎng)，細(xì)胞接種于六孔板中，密度為105cells/well。接種12 h后開始實(shí)驗(yàn)。不同溫度熱暴露實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ椭?，對照組細(xì)胞不做任何處理，熱暴露組細(xì)胞水浴鍋中水浴升溫至39℃、40℃、41℃。不同時間熱暴露實(shí)驗(yàn)中，對照組不做任何處理，熱暴露組于41℃分別處理3 h、6 h或12 h。

1.3 基因轉(zhuǎn)染

轉(zhuǎn)染用的Sestrin2高表達(dá)核酸序列來源于GeneBank(NM_031459.4)，將其克隆入高表達(dá)質(zhì)粒pcDNA3.1+中。轉(zhuǎn)染采用Invitrogen公司的Lipfectamine 2000試劑。

1.4 Western blot檢測Sestrin2、超氧化物歧化酶(SOD)的表達(dá)

分別取不同溫度熱暴露組或暴露不同時間的細(xì)胞(約106cells/well)，用胰酶消化收集細(xì)胞后，加入RIPA裂解液冰上處理后，12 000 r/min離心15 min，收集上清，-80℃保存?zhèn)溆?。采用BCA法檢測蛋白總量后，取適量進(jìn)行SDS-PAGE電泳，然后進(jìn)行轉(zhuǎn)膜，脫脂奶粉封閉1 h后，孵育相應(yīng)的一、二抗體進(jìn)行WB檢測，觀察Sestrin2和SOD在細(xì)胞內(nèi)的表達(dá)。

1.5 細(xì)胞線粒體膜電位檢測

采用流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞線粒體膜電位(mitochondrial membrane potential， MMP)，使用JC-1線粒體膜電位檢測試劑盒，細(xì)胞按照試劑盒說明書進(jìn)行處理后上機(jī)檢測。

1.6 ROS活性檢測

細(xì)胞中的活性氧檢測采用上海碧云天生物技術(shù)公司出產(chǎn)的活性氧檢測試劑盒。各組細(xì)胞去除培養(yǎng)液后，加入稀釋后的DCFH-DA，37℃培養(yǎng)20 min，用培養(yǎng)液洗滌3次后收集細(xì)胞，使用熒光分光光度計檢測。

1.7 Caspase-9活性和細(xì)胞凋亡率檢測

采用上海碧云天生物技術(shù)公司生產(chǎn)的Caspase-9活性檢測試劑盒檢測細(xì)胞中Caspase-9活性。各組細(xì)胞收集后用PBS緩沖液洗3次后，裂解，12 000 r/min離心15 min后取上清用BCA法定量蛋白濃度，然后按照試劑盒說明書進(jìn)行活性檢測。細(xì)胞凋亡檢測采用上海碧云天生物技術(shù)公司生產(chǎn)的Annexin V-FITC細(xì)胞凋亡檢測試劑盒和流式細(xì)胞儀檢測。細(xì)胞消化后按照產(chǎn)品說明書進(jìn)行細(xì)胞的處理并上機(jī)檢測。

1.8 統(tǒng)計學(xué)處理

2 結(jié)果

2.1 熱暴露對Sestrin2、線粒體功能和細(xì)胞凋亡的影響

隨著熱暴露溫度的升高，與37℃組比較，熱暴露Beas-2B細(xì)胞中Sestrin2蛋白表達(dá)水平逐漸降低，41℃組顯著降低(P<0.05)。在41℃暴露條件下，隨著暴露時間的延長，Beas-2B細(xì)胞中Sestrin2蛋白表達(dá)水平也逐漸降低，12 h組顯著降低(P<0.05)(圖1)，細(xì)胞的線粒體膜電位MMP逐漸下降(P<0.05)；41℃熱暴露組，隨著時間的延長，細(xì)胞Caspase-9活性顯著增強(qiáng)(P<0.05)，細(xì)胞凋亡率增加(表1)。

Fig.1Expressions of Sestrin2 in Beas-2B cells exposed to different temperatures for multiple time points (n=3)

Time (Thermal exposure 41℃)MMP (590 nm/530 nm)Activity of Caspsse-9(% 0 h)ApoptosisRatio (%)0 h2.20±0.19 100±193.6±0.33 h1.60±0.13? 260±20?6.0±0.6?6 h0.86±0.22? 420±41?14.0±1.0?12 h0.60±0.11? 676±62?22.0±2.3?

*P<0.05vscontrol group

2.2 Sestrin2對線粒體膜電位和細(xì)胞凋亡的調(diào)控作用

在Beas-2B細(xì)胞中轉(zhuǎn)染高表達(dá)Sestrin2載體，Sestrin2蛋白表達(dá)升高，說明成功構(gòu)建高表達(dá)Sestrin2載體Beas-2B細(xì)胞。在41℃暴露條件下，高表達(dá)Sestrin2組細(xì)胞與對照組相比，隨暴露時間延長引起細(xì)胞MMP的下降趨勢得到明顯緩解(P<0.05)，同時細(xì)胞凋亡率降低(P<0.05，圖2)。

Fig.2Effects of Sestrin2 on cell mitochondrial membrane potential and apoptosis(n=3)

A： Expression of Sestrin2 in Beas-2B cells after high-expression plasmid transfected； B： MMP of Beas-2B cells exposed for different times； C： Apoptosis ratio in Beas-2B cells exposed for different times

*P<0.05vs0 h

2.3 ROS在熱暴露Beas-2B細(xì)胞凋亡過程中的作用

ROS檢測結(jié)果表明，在41℃暴露條件下，隨著暴露時間的延長，細(xì)胞中的ROS水平顯著升高(P<0.05，圖3)，而Sestrin2蛋白高表達(dá)組與空載體組比較，ROS水平的顯著降低(P<0.05)。細(xì)胞高表達(dá)SOD，可顯著降低熱暴露導(dǎo)致細(xì)胞MMP水平下降的趨勢(P<0.05)，并能夠有效抑制熱暴露引起的細(xì)胞凋亡(P<0.05)。

3 討論

Sestrin2是sestrins蛋白家族中的重要成員，進(jìn)化上高度保守，其編碼基因位于6號染色體q臂21位點(diǎn)。研究表明，Sestrin2與細(xì)胞的增殖和活力密切相關(guān)，具有重要的抗氧化應(yīng)激作用[5]。當(dāng)細(xì)胞處于應(yīng)激條件時，Sestrin2表達(dá)水平升高，進(jìn)而激活相應(yīng)的轉(zhuǎn)錄因子，如P53、FoxO、CCAAT、ATF4、AP-1等，通過基因轉(zhuǎn)錄、蛋白翻譯等過程調(diào)控細(xì)胞的生長、凋亡和自噬等。有研究報道，Sestrin2可緩解肥胖、糖尿病、胰島素抵抗、心血管疾病等所引起的氧化應(yīng)激損傷[6-8]。本研究細(xì)胞學(xué)實(shí)驗(yàn)表明，Beas-2B細(xì)胞中Sestrin2蛋白表達(dá)水平，隨著暴露溫度的升高逐漸降低，在41℃條件下，隨著暴露時間的延長Sestrin2蛋白水平降低，12 h暴露可引起細(xì)胞中Sestrin2蛋白水平的顯著下降 (圖1A，1B)。

Fig.3Role of ROS in Sestrin2 protecting against heat exposure in Beas-2B cells(n=3)

A: The ROS level of Beas-2B cells exposed for different times; B: The ROS level in Beas-2B cells after Sestrin2 high-expression plasmid transfected; C: Expression of SOD in Beas-2B cells exposed to different temperatures; D: The expression of SOD after SOD high-expression plasmid transfected; E: The ROS level after SOD high-expression plasmid transfected; F: MMP of Beas-2B cells after the high-expression of SOD; G: The apoptosis ratio after Sestrin2 high-expressed

*P<0.05vs0 h

細(xì)胞凋亡是為維持內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定，由基因控制細(xì)胞自主的程序性死亡。線粒體是各種死亡刺激的感受器和凋亡過程的重要場所。細(xì)胞受到外部刺激因素如DNA損傷、射線、激素等刺激后，線粒體外膜通透性增大，線粒體膜去極化，跨膜電位下降，線粒體膜轉(zhuǎn)運(yùn)孔道開放，線粒體間隙中的細(xì)胞色素C釋放至胞質(zhì)中，逐步激活下游caspase酶的級聯(lián)反應(yīng)，最終引起細(xì)胞的凋亡[9]。本研究建立的熱暴露細(xì)胞模型中，41℃熱暴露12 h組，細(xì)胞線粒體膜電位MMP顯著降低，細(xì)胞Caspase-9活性顯著增強(qiáng)，進(jìn)而引起細(xì)胞凋亡率顯著增加(圖1 C-E)。高表達(dá)Sestrin2蛋白可有效緩解高溫暴露引起的細(xì)胞MMP降低和細(xì)胞凋亡率的升高(圖2)，這些研究結(jié)果表明，Sestrin2蛋白在熱暴露引起的細(xì)胞凋亡過程中發(fā)揮重要作用。

氧化應(yīng)激是由細(xì)胞內(nèi)氧化反應(yīng)和抗氧化反應(yīng)不平衡引起的，過量的ROS可激發(fā)體內(nèi)的抗氧化防御系統(tǒng)，造成體內(nèi)內(nèi)環(huán)境異常，進(jìn)而引起細(xì)胞內(nèi)多種氧化應(yīng)激反應(yīng)，造成蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)突變或生物活性喪失、DNA受損、位點(diǎn)突變，以及原癌基因與腫瘤抑制基因突變，最終導(dǎo)致機(jī)體產(chǎn)生氧化損傷[10-12]。有研究表明，Sestrin2可作為p53的轉(zhuǎn)錄調(diào)控底物分子在氧化應(yīng)激反應(yīng)中被活化，進(jìn)而發(fā)揮保護(hù)細(xì)胞生存和維持細(xì)胞繁殖等作用[13]。本研究結(jié)果表明，Beas-2B細(xì)胞在41℃熱暴露條件下，隨著暴露時間的延長，細(xì)胞中的Sestrin2蛋白表達(dá)水平下降，細(xì)胞中的ROS水平顯著升高。通過轉(zhuǎn)染高表達(dá)載體提高Sestrin2蛋白和SOD表達(dá)水平，可有效緩解高溫暴露引起的ROS水平升高，從而減輕了熱暴露引起細(xì)胞膜電位的降低和細(xì)胞凋亡率的升高(圖3)。因此，我們有理由推測，熱暴露引起細(xì)胞中Sestrin2蛋白表達(dá)水平下降，進(jìn)而引起細(xì)胞中SOD水平降低，這二者水平的下降導(dǎo)致細(xì)胞中ROS水平升高，加劇了細(xì)胞的氧化應(yīng)激損傷，最終導(dǎo)致細(xì)胞凋亡率的升高。

綜上，Sestrin2蛋白在熱暴露細(xì)胞模型中發(fā)揮著重要的靶點(diǎn)作用。細(xì)胞在受到外部熱應(yīng)激刺激時，Sestrin2蛋白水平表達(dá)下降，進(jìn)而引起細(xì)胞中SOD水平的下降，細(xì)胞中ROS水平升高，從而加劇了細(xì)胞的氧化應(yīng)激損傷，最終加劇細(xì)胞凋亡的進(jìn)程(圖4)。Sestrin2蛋白可能通過這一途徑調(diào)節(jié)細(xì)胞在熱環(huán)境暴露下的凋亡過程，對肺上皮細(xì)胞具有保護(hù)作用，本研究為探討熱暴露條件下細(xì)胞凋亡發(fā)生機(jī)理提供了重要的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

Fig.4Schematic diagram of mechanism of Sestrin2 in the process of apoptosis induced by heat exposure