邱吉漢，程齊來，郭小華，金 奇，鄭精國

(1.贛州市立醫(yī)院 贛南醫(yī)學院附屬市立醫(yī)院 藥劑科；2.贛南醫(yī)學院藥學院，江西 贛州 341000)

炎癥反應是臨床常見的病理過程，是指動物機體針對促炎因子、致炎因素、外界對機體的刺激發(fā)生的以防御反應為主的應答反應，以局部組織的變質、滲出和增生變化為主要表現(xiàn)[1]。無論中醫(yī)臨床還是西醫(yī)臨床上均有“十病九炎”的說法，主要的原因是很多疾病的病變基礎就是炎癥。目前西醫(yī)臨床治療炎癥的藥物主要為腎上腺皮質激素類和非甾體類抗炎藥等。雖然這兩種藥物在臨床應用過程中發(fā)揮了一些積極作用，但同時也表現(xiàn)出不良反應較多等弊端。中醫(yī)臨床中所涉及的瘡瘍、癰腫、疔毒等病證與西醫(yī)臨床所述的炎癥病理過程相似，一般應用有清熱解毒、活血化淤等功效的中藥進行防治[2]。已有研究結果表明，一些中草藥特別是從中提取分離得到的一些化學單體(天然產物)具有良好的抗炎效果，同時具備不良反應較少的優(yōu)點[3]。中華獼猴桃根A.chinensisRadix，又名藤梨根，是我國江西贛南地區(qū)應用較為廣泛的清熱解毒中草藥，在民間一直有其可冶“無名腫毒”之說。中華獼猴桃根中含有多種藥理活性成分，前期研究表明烏蘇烷型三萜類粗提物表現(xiàn)出較強的體外抗炎作用。TUA (2β, 3β, 23-trihydroxy-urs-12-en-28 -oic acid)是從贛南地區(qū)資源分布較豐富的中華獼猴桃根ActinidiachinensisRadix中提取、分離并鑒定得到的一個烏蘇烷型五環(huán)三萜類主要活性成份之一。目前未見有TUA抗炎作用相關報道。本研究利用脂多糖(1ipopoly- saccharide，LPS)誘導RAW 264.7細胞建立炎癥模型，通過測定TUA對細胞因子的影響，觀察體外抗炎效果，并初步闡明其抗炎作用機理，以期為臨床應用提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1藥品與試劑TUA 由本課題組前期從中華獼猴桃ActinidiachinensisRadix (Actinidiaceae) 根中提取分離得到。使用溶劑提取法與多種柱層析法對該藥材根部進行分離，利用現(xiàn)代理化分析和波譜檢測技術(UV，MS，IR，NMR等)對所得到的一系列化合物進行結構鑒定，最終得到了烏蘇烷型三萜化合物TUA，采用Agilent1100 HPLC，DAD檢測器，面積歸一法測定其純度，結果含量>96.7%。在本次實驗中， TUA 用二甲亞砜(DMSO)溶解。溶劑DMSO的最終濃度≤0.1%；實驗過程中使用的藥品一般貯存在-4 ℃冰箱中≤4天。

LPS(批號173M5115V)、MTT，Sigma公司產品；DMEM(高糖)、DMSO，Bio-Rad公司；胎牛血清(FBS)，ThermoFisher Scientific公司產品。Griess法NO檢測試劑盒，Bio-Rad公司產品； IL-10、TNF-α、IL-6、IL-1β非即用型ELISA檢測試劑盒，Promega公司產品；所用其他化學試劑均為國產分析純。

1.2主要儀器倒置光學顯微鏡(CKX41，OLYMPUS)；細胞恒溫培養(yǎng)箱(HERACELL150i，Thermo scientific)；臺式高速冷凍離心機(H1650R，上海盧湘儀)；酶標儀(SPECTRA max Plus 384，Molecular Devices公司)。

1.3細胞系及實驗動物RAW 264.7小鼠巨噬細胞瘤細胞，購自贛州陽明生物科技有限公司。

1.4實驗方法

1.4.1 TUA對RAW264.7細胞的毒性作用將正處于對數(shù)生長期的小鼠巨噬瘤細胞接種在96孔培養(yǎng)板上，細胞濃度大約是4.8×105個/mL，每孔添加細胞混懸液100 μL，使用含100 mL·L-1FBS的DMEM 高糖培養(yǎng)基作為培養(yǎng)液，周邊保濕孔中添加200 μL 磷酸緩沖鹽溶液，37 ℃、5%CO2(V/V, 體積分數(shù))條件下培養(yǎng)12 h，直到腫瘤細胞貼壁同時恢復到靜息狀態(tài)。將上述所用培養(yǎng)液吸棄，后面實驗采用的培養(yǎng)液均為不含100 mL·L-1FBS的DMEM 高糖液體培養(yǎng)基。后續(xù)實驗過程中在DMEM(高糖)培養(yǎng)液中加入不同成分作為不同實驗組，100 μL/組，具體實驗分組如下： ①對照組(CK):加入DMEM(高糖)培養(yǎng)液； ②LPS組:在DMEM(高糖)培養(yǎng)液中增添濃度是50 μg·mL-1的LPS母液，使LPS實驗濃度是1 μg·mL-1； ③TUA組:在DMEM(高糖)培養(yǎng)液中加入濃度為1 000 μg·mL-1的TUA母液，過0.22 μm濾膜，TUA組實驗濃度各自是80、60、40、20、10、5 μg·mL-1，每組6個復孔，繼續(xù)培養(yǎng)24 h。

以上各實驗組都添加20 μL、濃度是5 mg·mL-1MTT，繼續(xù)培養(yǎng)2 h。培養(yǎng)結束后，吸棄全部液體，保留貼壁腫瘤細胞，各實驗組都添加100 μL DMSO，搖床上振蕩10 min，使細胞內結晶充分溶解，在酶標儀上λ=520 nm處測定各孔OD值。

1.4.2 TUA對RAW264.7細胞分泌細胞因子的影響

1.4.2.1 TUA對RAW264.7細胞分泌NO的影響取正處在對數(shù)生長期的小鼠巨噬瘤細胞接種在6孔培養(yǎng)板上，細胞密度大概是4.8×105個/mL，每孔添加細胞混懸液2 mL，使用含100 mL·L-1FBS的DMEM 高糖培養(yǎng)基作為培養(yǎng)液，周邊保濕孔中添加200 μL 磷酸緩沖鹽溶液，37 ℃、5%CO2(V/V, 體積分數(shù))條件下培養(yǎng)12 h，直到腫瘤細胞貼壁同時恢復到靜息狀態(tài)。將上述所用培養(yǎng)液吸棄，后面實驗采用不含胎牛血清的DMEM(高糖)培養(yǎng)液。在DMEM(高糖)培養(yǎng)液中加入不同成分作為不同實驗組，2 μL/組，具體實驗分組如下： ①LPS組與對照組(CK):只添加DMEM(高糖)培養(yǎng)液； ②TUA給藥組:在DMEM(高糖)培養(yǎng)液中加入濃度為1 000 μg·mL-1的TUA母液，過0.22 μm濾膜，TUA組實驗濃度各自是20、10、5 μg·mL-1，每組3個復孔，培養(yǎng)6 h。

預處理后吸棄全部培養(yǎng)液，對照組添加DMEM(高糖)培養(yǎng)液；LPS組和TUA組均添加含LPS(終濃度為1 μg·mL-1)的DMEM(高糖)培養(yǎng)液，培養(yǎng)24 h。在此培養(yǎng)過程中，分別在6、12、18、24 h時，收集細胞培養(yǎng)上清液，采用Griess試劑盒檢測各組樣品中NO含量。

1.4.2.2 TUA對RAW264.7細胞分泌的TNF-α影響細胞處理同1.4.2.1。分別在細胞培養(yǎng)達6、12、18、24 h時，收集細胞培養(yǎng)上清液，使用非即用型ELISA檢測試劑盒檢測各組樣品中TNF-α含量。

1.4.2.3 TUA對RAW264.7細胞分泌的IL-6、IL-1β、IL-10影響細胞處理同1.4.2.1。分別在細胞培養(yǎng)達24 h時，收集細胞培養(yǎng)上清液，使用非即用型ELISA檢測試劑盒測定各組樣品中IL-6、IL-1β、IL-10含量。

2 結 果

2.1 TUA對RAW264.7細胞活性的影響實驗結果表明，當TUA濃度不高于20 μg·mL-1時，在24 h內對RAW 264.7細胞基本上無毒性作用，所測OD值與對照組(CK)、LPS組比較差異均無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，當TUA濃度在60～100 μg·mL-1時，與對照組(CK)、LPS組差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05)(圖1)。其余試驗中所用TUA劑量均在安全范圍內(≤20 μg·mL-1)選取。

與對照組CK比，*P<0.05,**P<0.01。

2.2 TUA對RAW264.7細胞分泌NO、TNF-α的影響表1所示，LPS組細胞通過致炎藥物干預12 h后，NO表達相比對照組升高(P<0.01)，并且NO表達在8～24 h內與干預時間呈正相關。TUA組細胞采用不同濃度的TUA干預4 h，再經LPS致炎12、16、24 h，各劑量TUA組的NO表達均顯著低于LPS組(P<0.01)，同時各時間-劑量點的NO表達均顯著高于對照組(P<0.01)。組間比較，LPS刺激8 h時，各組的NO表達差異均無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。

表1 TUA對RAW 264.7細胞分泌NO的影響

注：與對照組CK比較，**P<0.01; 與LPS組比較， ##P<0.01。

如表2所示，LPS組細胞通過致炎藥物干預8 h后，TNF-α表達高于對照組(P<0.01)，并且TNF-α表達在8～24 h內與干預時間呈正相關。TUA組細胞采用不同濃度的TUA干預4 h，再經LPS致炎12、16、24 h，各劑量組的TNF-α表達均顯著低于LPS組(P<0.01)，同時各時間-劑量點的TNF-α表達均顯著高于對照組(P<0.01)。從表2中還可以看出，TNF-α的表達在24 h內呈劑量依賴性，即在用藥安全范圍內，TUA的藥物濃度愈高，其抑制TNF-α表達的效果愈強。

表2 TUA對RAW 264.7細胞分泌TNF-α的影響

注：與對照組CK比較，**P<0.01; 與LPS組比較， ##P<0.01。

2.3 TUA對RAW264.7細胞分泌IL-1β、IL-6、IL-10的影響由圖2、圖3、圖4結果可知，LPS組細胞在致炎藥物干預24 h后，IL-1β、IL-6、IL-10的表達均顯著高于對照組(P<0.01)。TUA組細胞采用不同濃度的TUA干預4 h，再經LPS致炎24 h，TUA各劑量組的IL-1β、IL-6、IL-10表達均顯著低于LPS組(P<0.01)，且呈劑量依賴性，即在用藥安全范圍內，藥物濃度越高，IL-1β、IL-6、IL-10表達越低；但與對照組相比，TUA各劑量組的IL-1β、IL-6、IL-10表達依然顯著升高(P<0.01)。

與對照組CK比較，**P<0.01; 與LPS組比較， ## P<0.01。

與對照組CK比較，**P<0.01; 與LPS組比較， ## P<0.01。

與對照組CK比較，**P<0.01; 與LPS組比較， ##P<0.01。

圖4 TUA對RAW264.7細胞分泌IL-10的影響

3 討 論

炎癥的定義為具有血液循環(huán)的活體組織由損傷因子誘發(fā)的機體防御性反應，俗稱“發(fā)炎”。炎癥產生的關鍵環(huán)節(jié)是局部的血管反應，特征性地表現(xiàn)為炎癥部位的毛細血管充血擴張，組織通透性增加，繼而發(fā)生炎癥部位的水腫和炎性細胞的滲出[4]。RAW 264.7細胞是體內巨噬細胞系的一種，其在機體的免疫系統(tǒng)激活過程中發(fā)揮了重要作用。LPS是刺激機體發(fā)生免疫炎癥反應的一種很重要的激動劑，LPS能夠促使機體多種細胞尤其是巨噬細胞生成和表達大量的免疫致炎活性分子，并促使炎癥反應的發(fā)生[5]。NO是一種重要的炎癥介導因子，可在LPS的刺激下由巨噬細胞釋放，NO在炎癥產生的各個階段都發(fā)揮了非常重要的干預影響作用[6]。高濃度的NO可以刺激和促使致炎因子TNF-α和IL-1β的表達，TNF-α和IL-1β在炎癥反應初始階段的表達就會顯著增高，二者在炎癥反應過程中發(fā)揮了對細胞因子級聯(lián)反應的促進作用[7]。TNF-α可刺激IL-6、IL-10等大量致炎細胞因子的表達，并且各因子之間可以通過相互作用形成正反饋，最終導致炎癥反應的繼續(xù)加重[8]。

本研究通過LPS誘導RAW 264.7細胞作為體外炎癥模型來研究TUA的抗炎作用。實驗中LPS的藥物劑量參照Park C M等[9]的文獻數(shù)據(jù)，并經MTT試驗驗證，濃度為1 μg·mL-1的LPS在24 h內對RAW 264.7細胞不產生藥理毒性作用，并確定了TUA的安全體外干預濃度為≤20 μg·mL-1。實驗結果顯示，不同濃度的TUA均可極顯著地抑制LPS誘導RAW 264.7細胞后NO、TNF-α、IL-1β、IL-6及IL-10表達(P<0.01)，且呈劑量依賴性。因此，本研究通過初步的體外抗炎試驗證明，從獼猴桃根中分離得到的烏蘇烷化合物TUA具有較好的體外抗炎效果，但有關TUA更廣泛的抗炎效應及作用機制有待進一步深入研究。