閻雅寧,郭福慶,曹曉云

(天津市藥品檢驗鑒定研究院，天津 300070)

牛磺酸顆粒作為一種內(nèi)源性氨基酸，是中樞抑制性遞質(zhì)，能調(diào)節(jié)神經(jīng)組織興奮性，亦能調(diào)節(jié)體溫，故有解熱、鎮(zhèn)靜、鎮(zhèn)痛、抗炎、抗風(fēng)濕、抗驚厥等作用。并有提高肌體非特異性免疫的功能，其主要成分為牛磺酸，收載于《中國藥典》2015年版二部[1]。按照《中國藥典》2015年版四部通則1105和1106進行計數(shù)方法和控制菌檢查法的適用性試驗和檢查[2]，需氧菌總數(shù)、霉菌和酵母菌總數(shù)采用平皿法、大腸埃希菌采用常規(guī)法進行了檢查。本文對來自全國的17個生產(chǎn)企業(yè)的47批次樣品進行檢驗，對檢驗結(jié)果進行統(tǒng)計分析并對該藥品的微生物污染情況進行評價。

1 儀器與試藥

1.1儀器 SG-403生物安全柜(美國Baker公司)，ADS161SMU超凈工作臺(日本Yamato株式會社)，MLS-378IL壓力蒸汽滅菌器(松下健康醫(yī)療器械株式會社)，SANYO MIR-254恒溫培養(yǎng)箱(日本三洋株式會社)，SANYO MIR-554恒溫培養(yǎng)箱(日本三洋株式會社)，BINDER KB720恒溫培養(yǎng)箱(德國賓得)。

1.2標(biāo)準(zhǔn)菌種 金黃色葡萄球菌[CMCC(B)26003]、枯草芽孢桿菌[CMCC(B)63501]、銅綠假單胞菌[CMCC(B) 10104]、白色念珠菌[CMCC(F)98001]、黑曲霉[CMCC(F)98003]、大腸埃希菌[CMCC(B)44102]均購自中國食品藥品檢定研究院，由本院傳代保存。

1.3培養(yǎng)基和稀釋劑 胰酪大豆胨瓊脂培養(yǎng)基(TSA)、沙氏葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基(SDA)、胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基(TSB)、麥康凱液體培養(yǎng)基、麥康凱瓊脂培養(yǎng)基均購自北京陸橋技術(shù)有限責(zé)任公司；pH 7.0無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液購自北京三藥有限責(zé)任公司。以上培養(yǎng)基均通過了適用性和靈敏度的檢查。

1.4樣品 微生物限度檢查樣品來自17個生產(chǎn)企業(yè)47批次。選取其中A、F、J三個廠家樣品進行方法學(xué)適用性試驗。

2 方法和結(jié)果

2.1微生物限度檢查方法學(xué)適用性試驗

2.1.1菌液制備 參照《中國藥典》2015版四部通則1105和1106有關(guān)規(guī)定制備菌懸液[3]。

2.1.2供試液制備 取供試品10 g，加pH 7.0無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液稀釋至100 ml，震蕩混勻，制成1∶10供試液。

2.1.3需氧菌總數(shù)、霉菌和酵母菌總數(shù) 菌液組：取適量濃度的0.1 ml金黃色葡萄球菌菌液加pH 7.0無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液稀釋至10 ml，混勻，制成菌含量<100 cfu/ml的菌懸液，吸取1 ml至平皿中，立即傾注TSA培養(yǎng)基，測定菌落數(shù)結(jié)果為A。同法制備銅綠假單胞菌、枯草芽孢桿菌、白色念珠菌、黑曲霉的菌懸液。樣品對照組：取“2.1.2”項下1∶10供試液1 ml，注入平皿中，立即傾注TSA培養(yǎng)基。測定樣品中的菌落數(shù)，結(jié)果為B。驗證組：平皿法，取“2.1.2”項下的1∶10供試液9.9 ml，加入已配制的0.1 ml金黃色葡萄球菌液，制成菌含量<100 cfu/ml的供試液，取1 ml至平皿中，立即傾注TSA培養(yǎng)基，結(jié)果為C。同法制備含銅綠假單胞菌、枯草芽孢桿菌、白色念珠菌和黑曲霉的供試液，測定菌落數(shù)。驗證組回收率R=(C-B)/A。根據(jù)《中國藥典》2015年版四部通則1105規(guī)定[3]，R值應(yīng)在0.5～2范圍內(nèi)。若各試驗菌的回收試驗均符合要求，所用的供試液制備方法及計數(shù)方法適用于該樣品的需氧菌總數(shù)、霉菌和酵母菌總數(shù)計數(shù)。

2.1.4控制菌檢查方法適用性試驗 試驗組：取1∶10供試液10 ml和規(guī)定量大腸埃希菌(不大于100 cfu)加入100 ml的TSB中。陽性菌對照組：取規(guī)定量大腸埃希菌(不大于100 cfu)，加入100 ml的TSB中。陰性對照組：取稀釋液10 ml加入100 ml的TSB中。上述培養(yǎng)物分別置于32.5 ℃培養(yǎng)18 h。取培養(yǎng)物1 ml接種至100 ml麥康凱液體培養(yǎng)基中，43 ℃培養(yǎng)24 h。然后將上述培養(yǎng)物劃線接種于麥康凱瓊脂培養(yǎng)基平板上，32.5 ℃培養(yǎng)18 h。觀察是否有菌落生長，以及菌落大小、形態(tài)特征，判斷是否檢出大腸埃希菌。

2.2 結(jié)果

2.2.1需氧菌總數(shù)、霉菌和酵母菌總數(shù)、大腸埃希菌檢查方法學(xué)適用性試驗結(jié)果 在47批次樣品的17個生產(chǎn)廠家中選取A、F、J三個廠家的樣品(批號6717005、161103、20161101)，按照“2.1.3”項下平皿法進行需氧菌總數(shù)適用性試驗，5種菌的回收率均在0.5～2范圍內(nèi)，符合《中國藥典》要求；按照“2.1.3”項下常規(guī)法進行霉菌和酵母菌總數(shù)適用性試驗，白色念珠菌和黑曲霉的回收率均在0.5～2范圍內(nèi)，符合《中國藥典》要求。試驗結(jié)果見表1。

表1 需氧菌總數(shù)、霉菌和酵母菌總數(shù)方法學(xué)適用性試驗結(jié)果

2.2.2控制菌(大腸埃希菌)的方法學(xué)適用性試驗結(jié)果 如表2所示。3個批次的試驗結(jié)果表明：試驗組與陽性菌對照組結(jié)果一致，說明加入的陽性菌生長良好。所采用的試驗方法適用于該控制菌的檢查。

表2 大腸埃希菌方法學(xué)適用性試驗結(jié)果

注：+表示平板表面有菌生長或液體培養(yǎng)基變渾濁；-表示平板表面無菌生長或液體培養(yǎng)基澄清。

2.2.347批次樣品微生物限度檢查結(jié)果及分析 ?；撬犷w粒的微生物限度按照《中國藥典》2015年版四部通則1107要求，即“1 g供試品中，需氧菌總數(shù)不得過103cfu，霉菌和酵母菌總數(shù)不得過102cfu。1 g供試品中不得檢出大腸埃希菌”。 按照“2.1”項下的方法學(xué)適用性試驗方法對47批樣品進行微生物限度檢查，結(jié)果見表3。

47批次樣品的檢驗結(jié)果顯示，廠家E生產(chǎn)的批號為160901的樣品需氧菌總數(shù)為3.6×103cfu/g，霉菌和酵母菌總數(shù)為2.6×102cfu/g，均超過《中國藥典》2015版規(guī)定的限度值，不符合規(guī)定；廠家A生產(chǎn)的批號為6717004、廠家B生產(chǎn)的批號為20160501、廠家C生產(chǎn)的批號為17022341和廠家D生產(chǎn)的批號為151108的4批樣品需氧菌總數(shù)均在10～100 cfu/g，但小于103cfu/g，符合《中國藥典》規(guī)定；剩余42批次樣品的需氧菌總數(shù)均<10 cfu/g，符合《中國藥典》規(guī)定。

對47批次的需氧菌總數(shù)結(jié)果進行統(tǒng)計分析，其中需氧菌總數(shù)X>103的有1批次，約占2%；101≤X<102的有4批次，約占9%；X<101的有42批次，約占89%。

表3 47批次樣品的檢驗結(jié)果

續(xù)表3

3 討論

3.1《中國藥典》2015年版未將微生物限度分列于各品種項下，附錄中的試驗較為籠統(tǒng)寬泛，由于受不同藥品的成分、處方、制劑工藝等因素的影響，因此《中國藥典》2015年版規(guī)定各品種的微生物限度檢驗方法依然要進行適用性試驗，以確保所采用的方法適合于該藥品的需氧菌總數(shù)、霉菌和酵母菌總數(shù)及控制菌的測定。本試驗對3個不同生產(chǎn)廠家的3 批樣品進行了微生物限度的適用性試驗，確保試驗方法準(zhǔn)確可行，并用確立的方法對?；撬犷w粒進行微生物限度檢查。

3.2《中國藥典》未對化學(xué)藥口服固體制劑的微生物限度檢查做強制規(guī)定，企業(yè)應(yīng)建立自己的內(nèi)控標(biāo)準(zhǔn)。雖然不是法檢項目，但微生物限度檢查結(jié)果不符合規(guī)定，產(chǎn)品也是不合格的。為了對?；撬犷w粒質(zhì)量全面考查，此次評價性抽驗進行了微生物限度檢查，共抽樣47批樣品，涉及17家生產(chǎn)企業(yè)，占全國批準(zhǔn)生產(chǎn)企業(yè)的34.7%；其中4批次來自生產(chǎn)單位，1批次來自使用單位，42批次來自經(jīng)營單位；涉及17個批準(zhǔn)文號，占全國批準(zhǔn)文號的28.8%。

3.3此次檢查結(jié)果顯示，抽自赤峰某經(jīng)銷公司廠家E生產(chǎn)的批號為160901的樣品中需氧菌總數(shù)、霉菌和酵母菌總數(shù)均超過《中國藥典》2015年版給出的限度范圍，不符合規(guī)定。由于僅抽取了廠家E一個批次即不合格，此次抽驗該廠家的不合格率為100%，其他批次的結(jié)果如何需要廠家進一步篩查，并應(yīng)加大市場監(jiān)督頻次。此次檢查結(jié)果還顯示，廠家C共抽取兩批次樣品，批號相同均為17022341，一個抽自國藥某公司，一個抽自安徽某公司，抽驗結(jié)果顯示：抽自國藥某公司的需氧菌總數(shù)為60cfu/g，抽自安徽某公司的需氧菌總數(shù)為<10cfu/g。雖然生產(chǎn)批號相同，但是來自不同的經(jīng)營單位，檢驗結(jié)果不相同，那么微生物的污染來源還需要進行進一步的分析。微生物污染是藥品質(zhì)量評估的重要指標(biāo)，也是藥品質(zhì)量控制的重要組成成分[4]，非無菌制劑允許微生物的量在一定的限度內(nèi)，原材料、包裝、加工、設(shè)備儀器、生產(chǎn)環(huán)境、人員操作、流通、儲存等各個環(huán)節(jié)都可能是藥品中微生物存在的來源。該生產(chǎn)企業(yè)應(yīng)仔細(xì)尋找并分析可能存在的污染環(huán)節(jié)。

4.4其他16個生產(chǎn)廠家的檢驗結(jié)果顯示樣品的需氧菌總數(shù)、霉菌和酵母菌總數(shù)、大腸埃希菌均符合《中國藥典》規(guī)定，表明此次國家評價性抽驗的生產(chǎn)企業(yè)的?；撬犷w粒在制備、工藝、生產(chǎn)及流通的各個環(huán)節(jié)質(zhì)量相對穩(wěn)定，其結(jié)果在一定程度上反映出目前國產(chǎn)?；撬犷w粒微生物污染情況，結(jié)果較滿意。