李 偉，曹曉云

(天津市藥品檢驗(yàn)研究院，天津 300070)

氟氯西林鈉為半合成青霉素類抗生素，主要用于耐青霉素金黃色葡萄球菌的嚴(yán)重感染及敗血癥[1]，注射用氟氯西林鈉為其原料直接無菌分裝制劑。《中國(guó)藥典》自2015年版開始收載原料及其制劑，但并未對(duì)聚合物檢查項(xiàng)進(jìn)行控制[2]。本試驗(yàn)采用TSK-GEL色譜柱對(duì)注射用氟氯西林鈉中聚合物進(jìn)行控制，和葡聚糖凝膠(G-10)色譜柱檢測(cè)聚合物的方法相比具有靈敏度高、檢驗(yàn)時(shí)間短等優(yōu)勢(shì)，提高了檢驗(yàn)效率，完善了該品種的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)，為進(jìn)一步提高藥品質(zhì)量奠定了良好基礎(chǔ)[3]。

1 儀器與試藥

1.1儀器 Agilengt 1200 系列高效液相色譜系統(tǒng)(美國(guó)Agilent 公司)，METTLER TOLEDO XS 205型電子分析天平(瑞士梅特勒公司)，TSK-GEL G2000SWXL(300 mm×7.8 mm，5 μm)色譜柱(日本TOSOH株式會(huì)社)。

1.2試藥 氟氯西林對(duì)照品(中國(guó)藥品生物制品檢定所，批號(hào)130529-200301，純度92.6%)；注射用氟氯西林鈉(山西振東泰盛制藥有限公司，規(guī)格0.25 g，批號(hào)1209121、1209131、1209141、1508201、1508202、1508203)；磷酸二氫鈉、磷酸氫二鈉、氫氧化鈉均為分析純(天津市贏達(dá)稀貴化學(xué)試劑廠)，鹽酸為優(yōu)級(jí)純(天津市化學(xué)試劑五廠)，30%過氧化氫為分析純(天津市北方天醫(yī)化學(xué)試劑廠)，乙腈為色譜純(Merck公司)。

2 方法與結(jié)果

2.1色譜條件 色譜柱：TSK-GEL G2000SWXL (300 mm×7.8 mm，5μm)。 流動(dòng)相：磷酸鹽緩沖液(pH 7.0)[0.04 mol/L磷酸氫二鈉溶液-0.04 mol/L磷酸二氫鈉溶液(61∶39)]-乙腈(95∶5)，流速為0.8 ml/min，檢測(cè)波長(zhǎng)為215 nm，進(jìn)樣量為20 μl。

2.2溶液的制備

2.2.1對(duì)照品溶液制備 取氟氯西林對(duì)照品10.58 mg，置50 ml量瓶中，加流動(dòng)相溶解并稀釋至刻度，作為對(duì)照品儲(chǔ)備液。精密量取對(duì)照品儲(chǔ)備液5 ml置100 ml量瓶中，加流動(dòng)相溶解并稀釋至刻度，作為對(duì)照品溶液。

2.2.2供試品溶液制備 取供試品適量，精密稱定，加流動(dòng)相溶解并定量稀釋制成每1 ml中含氟氯西林1 mg的溶液，作為供試品溶液(臨用新制)。

2.2.3系統(tǒng)適用性溶液制備 取供試品溶液置沸水浴中加熱3 min，放至室溫，作為系統(tǒng)適用性溶液。

2.2.4靈敏度測(cè)試溶液制備 精密量取對(duì)照品溶液2 ml置100 ml量瓶中，用流動(dòng)相稀釋至刻度，作為靈敏度測(cè)試溶液。

2.3系統(tǒng)適用性試驗(yàn)及靈敏度測(cè)試 取“2.2.3”項(xiàng)下系統(tǒng)適用性溶液，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件測(cè)定，氟氯西林峰與相對(duì)保留時(shí)間約為0.84的最大熱降解產(chǎn)物(取供試品溶液10 ml，置水浴加熱3 min，放置至室溫)峰之間的分離度為5.96。取“2.2.4”項(xiàng)下靈敏度測(cè)試溶液，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件測(cè)定，主成分峰高的信噪比為16.4。系統(tǒng)適用性試驗(yàn)及靈敏度測(cè)試試驗(yàn)可有效控制色譜系統(tǒng)。見圖1。

1、3、4.聚合物 2.最大熱降解產(chǎn)物 5.氟氯西林

2.4專屬性試驗(yàn)

2.4.1酸破壞 取供試品溶液10 ml，加0.1 mol/L的鹽酸溶液1 ml，水浴加熱1 min后，放置至室溫，加0.1 mol/L的氫氧化鈉溶液1 ml，搖勻，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件測(cè)定。

2.4.2堿破壞 取供試品溶液10 ml，加0.1 mol/L的氫氧化鈉溶液1 ml，水浴加熱1 min后，放置至室溫，加0.1 mol/L鹽酸溶液1 ml，搖勻，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件測(cè)定。

2.4.3氧化破壞 取供試品溶液10 ml，加1%的過氧化氫溶液1 ml，室溫放置4 min后，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件測(cè)定。

2.4.4光照破壞 取供試品溶液10 ml，置254 nm紫外燈下光照30 min后，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件測(cè)定。

2.4.5加熱破壞 取供試品溶液10 ml，置水浴加熱3 min后，放置至室溫，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件測(cè)定。

專屬性試驗(yàn)表明，注射用氟氯西林鈉在酸、堿、氧化、光照、加熱條件下均不穩(wěn)定，主峰前雜質(zhì)個(gè)數(shù)和雜質(zhì)峰面積均明顯增加，專屬性好，結(jié)果見表1和圖2。

表1 專屬性試驗(yàn)結(jié)果

1.氟氯西林 2～8.破壞產(chǎn)生的雜質(zhì)

2.5線性關(guān)系與范圍 分別精密量取“2.2.1”項(xiàng)下對(duì)照品儲(chǔ)備液0.05、0.25、0.5、1.0、2.5、5、10和25 ml，置50 ml量瓶中，加流動(dòng)相稀釋至刻度，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件測(cè)定。溶液濃度與聚合物峰面積的線性回歸方程為Y=71.091X-6.156 2(r=1.000 0)。結(jié)果表明：對(duì)照品溶液在0.195 9～97.970 8 μg/ml濃度范圍內(nèi)，溶液濃度與聚合物峰的峰面積之間線性關(guān)系良好。

2.6精密度試驗(yàn) 取“2.2.1”項(xiàng)下的氟氯西林對(duì)照品溶液，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件重復(fù)測(cè)定6次，峰面積的RSD為0.12%(n=6)，該方法精密度良好。

2.7重復(fù)性試驗(yàn) 取1508201批樣品按“2.2.2”項(xiàng)下方法制備6份供試品溶液(臨用新制)，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件測(cè)定，6份樣品的聚合物含量分別為0.77%、0.76%、0.78%、0.79%、0.77%和0.78%，RSD為1.35%(n=6)，表明重復(fù)性良好。

2.8供試品取樣量與聚合物測(cè)定結(jié)果的相關(guān)性考查 取1209121批樣品約12.5、25和50 mg，分別置3個(gè)25 ml量瓶中，按“2.2.2”項(xiàng)下方法制備成供試品溶液，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件測(cè)定，結(jié)果表明，供試品取樣量在12.63～50.46 mg范圍內(nèi)，供試品取樣量與聚合物峰的峰面積之間線性關(guān)系良好，二者之間有明確的相關(guān)性。供試品取樣量與聚合物峰的峰面積的線性回歸方程為Y=25.323X+3.306 9(r=1.000 0)。

2.9最低檢測(cè)限 取對(duì)照品溶液1 ml置200 ml量瓶中，加水稀釋至刻度，搖勻，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件試驗(yàn)，最低檢測(cè)濃度為0.049 μg/ml，其峰高為噪音的4.4倍，計(jì)算最低檢測(cè)限為0.004 9%。

2.10供試品溶液的穩(wěn)定性 取1508201批樣品制成供試品溶液，分別于4 ℃條件下放置1、2、3、4、5、6、7和8 h后，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件測(cè)定，計(jì)算保留時(shí)間小于氟氯西林峰的各雜質(zhì)峰面積的和，結(jié)果表明，雜質(zhì)總和隨放置時(shí)間的延長(zhǎng)略有增加。見表2。因此，供試品溶液配制好后應(yīng)于低溫保存并盡快進(jìn)樣分析。

表2 穩(wěn)定性試驗(yàn)結(jié)果

2.11樣品的測(cè)定 取6批注射用氟氯西林鈉樣品(批號(hào)1209121、1209131、1209141、1508201、1508202、1508203)，按“2.2.2”項(xiàng)下方法配制成供試品溶液，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件測(cè)定，色譜圖見圖3，檢驗(yàn)結(jié)果見表3。

1.氟氯西林 2～4.聚合物

表3 6批供試品聚合物檢驗(yàn)結(jié)果

3 討論

3.1流動(dòng)相的選擇 取對(duì)照品溶液和供試品溶液，分別選用以下5種流動(dòng)相進(jìn)行測(cè)定：A、磷酸鹽緩沖液(pH 7.0) [0.01 mol/L磷酸氫二鈉-0.01 mol/L磷酸二氫鈉(61∶39)]-乙腈(95∶5)；B、磷酸鹽緩沖液(pH 7.0)[0.01 mol/L磷酸氫二鈉-0.01 mol/L磷酸二氫鈉(61∶39)]-乙腈(98∶2)；C、磷酸鹽緩沖液(pH 7.0) [0.01 mol/L磷酸氫二鈉-0.01 mol/L磷酸二氫鈉(61∶39)]；D、磷酸鹽緩沖液(pH 7.0) [0.02 mol/L磷酸氫二鈉-0.02 mol/L磷酸二氫鈉(61∶39)]-乙腈(95∶5)；E、磷酸鹽緩沖液(pH 7.0)[0.04 mol/L磷酸氫二鈉-0.04 mol/L磷酸二氫鈉(61∶39)] -乙腈(95∶5)。 以A為流動(dòng)相時(shí)，主峰前的雜質(zhì)峰不能完全分離；以B、C、D為流動(dòng)相時(shí)，雜質(zhì)雖然分離較好，但是對(duì)照品溶液色譜圖中主峰分叉；以E為流動(dòng)相時(shí)，雜質(zhì)分離效果好，對(duì)照品溶液色譜圖中主峰峰形也較好。故選用pH 7.0的磷酸鹽緩沖液[0.04 mol/L磷酸氫二鈉-0.04 mol/L磷酸二氫鈉(61∶39)]-乙腈(95∶5)作為流動(dòng)相。

3.2測(cè)定波長(zhǎng)的選擇 以磷酸鹽緩沖液(pH 7.0)[0.04 mol/L磷酸氫二鈉-0.04 mol/L磷酸二氫鈉(61∶39)]-乙腈(95∶5)作為流動(dòng)相，用DAD檢測(cè)器對(duì)供試品溶液進(jìn)行全波長(zhǎng)掃描，在215 nm波長(zhǎng)處有最大吸收，故確定以215 nm為檢測(cè)波長(zhǎng)。

3.3溶劑的選擇 以磷酸鹽緩沖液(pH 7.0)[0.04 mol/L磷酸氫二鈉溶液-0.04 mol/L磷酸二氫鈉溶液(61∶39)]-乙腈(95∶5)為流動(dòng)相，檢測(cè)波長(zhǎng)為215 nm，分別取水和流動(dòng)相依法檢測(cè)。以水作溶劑時(shí)，在13.799 min處有倒峰，干擾檢測(cè)；而用流動(dòng)相作溶劑時(shí)，對(duì)檢測(cè)沒有干擾，故確定以流動(dòng)相為溶劑。

《中國(guó)藥典》2015年版二部收載的青霉素類抗生素如阿莫西林、青霉素V鉀、青霉素鈉、苯唑西林鈉、氯唑西林鈉等品種都采用葡聚糖凝膠(G-10)色譜柱對(duì)高聚物進(jìn)行測(cè)定[4]，該方法分析時(shí)間較長(zhǎng)(約50 min)，而且檢測(cè)到的聚合物以混合物的形式存在，靈敏度不高。而本試驗(yàn)建立的方法首先將檢驗(yàn)時(shí)間縮短至20 min以內(nèi)，其次將聚合物有效分離，大大提高了檢驗(yàn)效率和靈敏度。專屬性試驗(yàn)表明，本品在氧化、光照和加熱條件下不穩(wěn)定，考慮本品為無菌分裝制劑，在玻璃瓶和膠塞的密封條件下，不易接觸氧化劑；而在運(yùn)輸和貯存過程中，光照和高溫條件容易產(chǎn)生，所以提示生產(chǎn)、運(yùn)輸和銷售環(huán)節(jié)，本品應(yīng)避光和避免高溫。