華曉東，侯 娟，徐 琳，稅鳳春

(天津市藥品檢驗研究院，天津 300070)

血小板功能檢測最經(jīng)典的方法是血小板聚集試驗，由于該方法需要制備富血小板血漿(PRP)和貧血小板血漿(PPP)，影響因素較多，試驗者的操作經(jīng)驗對結(jié)果的影響較大，因此試驗的可靠性較差。CD62p又名血小板活化依賴性顆粒表面膜蛋白，是血小板活化的特異性生物標志物。降低血小板的CD62p表達是臨床活血化瘀方劑抗血小板治療效果監(jiān)測的高特異性指標，與其臨床效應密切相關。采用流式細胞術(shù)檢測CD62p的表達，進而評價血小板的功能[1],方法快速穩(wěn)定，簡單可靠，影響因素少，靈敏度也高于血小板聚集試驗。本研究擬通過比較這兩種血小板功能的評價方法，為在臨床前研究中綜合評價血小板功能提供一種新途徑。

1 材料與方法

1.1藥品 注射用丹參多酚酸：淺棕色疏松塊狀物， 規(guī)格：100 mg/支，批號20180501，試驗時分別采用氯化鈉注射液按丹參多酚酸含量計算稀釋至試驗所需濃度備用。單抗 anti-mouse/rat CD62p-PE/Cy7(藻紅蛋白-青花素7標記的抗大/小鼠CD62p抗體，批號B223759)、anti-mouse/rat CD61-PE(藻紅蛋白標記的抗大/小鼠CD61抗體，批號B216420)，均由美國Biolegend公司生產(chǎn)；同型對照 Rat IgG2a-PE/Cy7(藻紅蛋白-青花素7標記的大鼠IgG2a，批號4290714)、Rat IgG-PE(藻紅蛋白標記的大鼠IgG，批號 4281135)，美國eBioscience公司生產(chǎn)。ADP(批號SLBP6247V，SIGMA公司生產(chǎn))。

1.2儀器 ACEA流式細胞儀，ACEA Bioscience,Inc；LBY-NJ4血小板聚集儀，北京生化儀器廠生產(chǎn)；XS-205DU電子天平，精度0.1 mg，試劑稱量用；XP2001S電子天平，精度1 g，動物稱量用。

1.3動物 SD大鼠，體重 220～250 g，雌雄各半，雌鼠應無孕，斯貝福(北京)生物技術(shù)有限公司，SCXK(京)2016-0002。

1.4方法

1.4.1注射用丹參多酚酸對大鼠體外血小板聚集功能的影響 取SD大鼠8只，雌雄各半，體重230～250 g，大鼠腹腔注射20%烏拉坦5 ml/kg麻醉。以注射器自大鼠腹主動脈采血，每只約5～6 ml，置硅化離心管中，以3.2%檸檬酸鈉溶液9∶1抗凝，1 000 r/min離心5 min，制成富血小板血漿(PRP)，以2 000 r/min離心10 min，制成貧血小板血漿(PPP)，按比濁法采用血小板聚集儀測定血小板的最大聚集率。注射用丹參多酚酸配制成不同濃度(4、1、0.4、0.1和0.04 mg/ml)，將對照管取0.18 ml PPP加入0.02 ml氯化鈉注射液校正100%透過率值，每個測定管取0.18 ml PRP加入0.02 ml氯化鈉注射液(基礎值)或不同濃度的藥液，預先將測定管在血小板聚集儀中溫育5 min，再加入 200 μmol ADP溶液10 μl(終濃度為10 μmol/ml)，隨即記錄5 min內(nèi)血小板最大聚集率，對照組與各給藥組平行檢測。以各組的血小板最大聚集率進行組間比較(t測驗)，并計算出血小板聚集抑制率。采用SPSS 21.0進行統(tǒng)計，受試物作用前后進行配對資料的t檢驗。血小板聚集抑制率(%)=(對照組聚集率-給藥組聚集率)/對照組聚集率。

1.4.2注射用丹參多酚酸對大鼠體外血小板活化的影響 上述大鼠麻醉后眼眶取血0.5 ml，以3.2%檸檬酸鈉溶液9∶1抗凝。每只動物取1份50 μl抗凝血加入氯化鈉注射液50 μl，37 ℃作用5 min，加入50 μl終濃度為10 μmol的ADP激活，用于測定經(jīng)ADP激活血小板活化率基礎值；另分別取50 μl抗凝血加入不同濃度(4、1、0.4、0.1和0.04 mg/ml)的丹參多酚酸溶液50 μl，37 ℃作用5 min，再用終濃度為10 μmol的ADP激活。上述2種抗凝血分別加入CD62p PE/Cy7和CD61 PE各1.0～1.5 μl雙標，以CD61標記所有血小板，CD62p標記活化血小板。以上各管4 ℃避光孵育20 min；再加入0.5 ml 4%多聚甲醛固定10 min。取固定后的血樣50 μl，加入1 ml稀釋液稀釋后上機分析。在CD61 PE/側(cè)向角光散射(SSC)雙參數(shù)散點圖中劃定血小板細胞群，計數(shù)5 000個血小板，進一步在CD61/CD62p散點圖中計數(shù)CD61及CD62p陽性表達的細胞數(shù)，并以CD62p陽性表達率占CD61表達率的百分比反映血小板的活化率(%)。處理后上機檢測與受試物作用后經(jīng)ADP激活的血小板活化率。并采用SPSS 21.0進行統(tǒng)計，受試物作用前后進行配對資料的t檢驗。

2 結(jié)果

2.1對大鼠體外血小板聚集功能的影響 在采用血小板聚集儀進行的血小板聚集檢測中，0.4 mg/ml以上的丹參多酚酸能夠明顯抑制血小板的聚集作用。而0.1 mg/ml劑量已無明顯的血小板聚集抑制作用。由于每只動物的采血量不足以支持全部的檢測樣本，因此未進行0.1 mg/ml以下劑量的檢測。見表1。

表1 注射用丹參多酚酸對大鼠體外血小板聚集作用的影響

2.2對大鼠體外血小板活化的影響 在采用流式細胞儀進行的血小板活化檢測中，0.04 mg/ml以上的丹參多酚酸均可明顯抑制CD62p的表達，對血小板表現(xiàn)出明顯的活化抑制作用。見表2。

2.3方法一致性的比較 不同濃度藥物對血小板聚集抑制率與血小板活化抑制率的相關分析，給藥后不同濃度藥物對血小板聚集抑制率與血小板膜糖蛋白CD62p活化抑制率均成正相關，按抑制率計算，兩種方法的相關性為0.982。表明兩種方法有較好的一致性，而血小板活化檢測的靈敏度明顯高于聚集率檢測。見圖 1 。

表2 注射用丹參多酚酸對大鼠體外血小板活化作用的影響

圖1 丹參多酚酸對血小板活化抑制率和聚集抑制率影響的比較

3 討論

心肌梗死、腦栓塞和肺栓塞等血栓性疾病在我國發(fā)病率很高，活血化瘀是主要的治療手段，活血化瘀藥物應用非常廣泛。而評價活血化瘀藥物功效的主要手段就是檢測藥物對血小板功能的影響。血小板活化、血小板聚集是血栓形成的病理基礎，也是評價血小板功能的最重要指標[2]。

血小板功能的傳統(tǒng)檢測方法為比濁法檢測血小板聚集，即采用血小板聚集儀測定血小板聚集情況的經(jīng)典方法，該方法應用廣泛，是目前較為經(jīng)典的血小板功能檢測方法，但該方法也存在一些固有的不足。例如去除紅細胞不能完全反映體內(nèi)血細胞之間的相互作用；如測定時間較長，可致血小板功能降低；需要制備的富血小板血漿(PRP)和貧血小板血漿(PPP)沒有嚴格規(guī)范化標準，影響因素較多，個人操作習慣對結(jié)果影響較大，結(jié)果的穩(wěn)定性和可重復性較差。需要較多的血液量，不適合用于高通量篩選。

CD62p(P-選擇素,GMP-140)又名血小板活化依賴性顆粒表面膜蛋白或P-選擇素,是一種膜糖蛋白顆粒，在靜息血小板中僅分布在血小板內(nèi)部, 當血小板被激活時, 隨著血小板脫顆粒與釋放反應, CD62p 重新分布至血小板膜表面, 且其只能在脫顆粒的血小板表面表達。由于只在已活化的血小板上有表達，其表達程度與血小板活化有很強的相關性，因而CD62p被認為是血小板活化檢測的高特異性指標，與藥物的臨床效應密切相關。臨床研究顯示在冠心病的不同類型患者(穩(wěn)定型心絞痛及急性冠脈綜合征)中均觀察到 CD62p 顯著升高的現(xiàn)象, 即血小板的異?；罨?；同時CD62p水平與冠心病血瘀證呈正相關，因此降低血小板的 CD62p 表達也成為臨床活血化瘀方劑抗血小板治療的重要監(jiān)測指標之一[3，4]。

采用流式細胞術(shù)檢測血小板活化時血小板表面糖蛋白CD62p的表達，只需取少量外周血，經(jīng)單克隆抗體標記后就可快速、穩(wěn)定地檢測。隨著流式細胞儀檢測手段的完善，其檢測的敏感性和特異性也大大提高。因此，完全可以通過建立一種相對簡單的流式細胞儀檢測外周血中CD62p含量或百分率的模型，達到檢測抗血小板活化類活血化瘀藥物生物活性的目的。即將一定量的受試物(注射用丹參多酚酸)與大鼠抗凝血混合，作用一定時間后，用流式細胞術(shù)檢測生物標志物(CD62p)的方法，測定并比較給藥前后經(jīng)ADP激活的血小板活化率，判定該受試物是否對ADP誘導的血小板活化具有抑制作用，從而評價藥物是否具有活血化瘀作用。與傳統(tǒng)血小板聚集測定法相比[5，6]，全血法流式細胞術(shù)(FCM)有許多明顯優(yōu)點，采用全血進行檢測，標本處理的簡化能避免血小板體外激活，并防止血小板影響因子的丟失，不干擾循環(huán)中的紅細胞、白細胞對血小板活化的影響，因此能在最接近真實體內(nèi)環(huán)境的條件下測定血小板功能；由于使用了血小板生物標志物(單抗)，檢測的僅是血小板，而不會受其他種類細胞或碎片的干擾，保證了檢測的特異性；檢測僅需極少量全血，一次取血可進行多批樣品檢測，可減少動物用量，符合動物倫理；檢測速度快，在接收樣品后24 h內(nèi)即可同時完成多批樣品的檢測；操作簡單，影響因素較少，同時靈敏度高，方法穩(wěn)定可靠，尤其適合進行大量樣品的篩選。

注射用丹參多酚酸是一種新型的中藥注射劑，具有明確的活血化瘀功效。在本研究中，不同劑量的丹參多酚酸可以明顯地抑制ADP誘導的血小板活化和血小板聚集，而且采用流式細胞儀進行的血小板活化檢測的靈敏度明顯高于采用比濁法進行的血小板聚集檢測。由于血小板活化是血小板聚集的必經(jīng)步驟，二者的檢測結(jié)果有很好的正相關性，而血小板活化檢測的諸多優(yōu)點提示該方法可以作為血小板聚集檢測的替代方法用于血小板的功能評價。

中藥成分復雜，單一地通過理化檢測控制少數(shù)指標性成分難以全面控制藥物的安全性和有效性，因此利用生物活性測定法對于中藥進行質(zhì)量控制已是一種必然的趨勢。相較于影響因素較多的整體試驗，通過選擇一種公認的、特異性良好的生物標記物作為檢測指標來反映藥物的生物活性，能夠從作用機制角度更好地體現(xiàn)其有效性，檢測指標更易量化，也更適合作為質(zhì)量標準引入具體品種項下。