李曉凡，曹 申，馬 坤，寧 佳，郝偉亮，宋丹妮，徐 亮，張彥文*

(1.天津醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院，天津 300070； 2.天津市口腔醫(yī)院，天津 300041； 3.天津醫(yī)科大學(xué)口腔醫(yī)院，天津 300070； 4.天津市南開(kāi)醫(yī)院,天津 300100； 5.天津醫(yī)學(xué)高等專(zhuān)科學(xué)校，天津 300222)

大黃是廖科植物大黃的干燥根及根莖，味苦而澀，具有瀉熱通腸，涼血解毒的功效。現(xiàn)已確定，大黃的主要成分為蒽醌類(lèi)化合物，主要包括：大黃酸、大黃素、大黃素甲醚、蘆薈大黃素和大黃酚。目前認(rèn)為，蒽醌類(lèi)化合物有很好的殺菌作用，但是由于5種成分在大黃中的含量不一，其中大黃素和蘆薈大黃素含量最多，并且提取物的味道更溫和，因此選擇提取大黃素和蘆薈大黃素作為大黃中有效成分代表。

五倍子又稱(chēng)文蛤、百蟲(chóng)倉(cāng)，是一種常用中藥，含有鞣質(zhì)、沒(méi)食子酸等，主要成分為沒(méi)食子酸。沒(méi)食子酸是一種多酚類(lèi)化合物，具有抑菌、抗突變、抗腫瘤的作用[1]，有低毒[2]，中國(guó)產(chǎn)五倍子中含有大量可水解的五倍子單寧，沒(méi)食子酸可通過(guò)水解五倍子單寧獲得[3]。

國(guó)內(nèi)對(duì)大黃的抑菌作用做了一些研究，梁勤等[4]用肉湯稀釋法研究了甘肅道地藥材大黃對(duì)產(chǎn)超廣譜β-內(nèi)酰胺酶(ESBLs)大腸埃希菌和耐甲氧西林金黃色葡萄球菌(MRSA)的最小抑菌濃度；侯媛媛等[5]利用UPLC-MS-MS研究了大黃對(duì)食源性致病菌大腸桿菌、沙門(mén)氏菌和金黃色葡萄球菌的抑菌效果；宋麗琴[6]用濾紙片法研究了不同炮制條件下的大黃對(duì)金黃色葡萄球菌、綠膿桿菌、鏈球菌等6種菌的抑制作用；李成林等[7]直接研究了大黃中有效成分大黃素和蘆薈大黃素對(duì)金黃色葡萄球菌的抑制作用。這表明，大黃中抑菌成分較多，大黃中的單一成分可以作為研究的重點(diǎn)。

現(xiàn)已表明五倍子的主要成分為沒(méi)食子酸，學(xué)者對(duì)五倍子抑菌作用的研究主要集中在沒(méi)食子酸的抑菌作用上。張雅麗[1]、盧曉[8]、王廣娟[9]單獨(dú)研究了沒(méi)食子酸對(duì)常見(jiàn)菌金黃色葡萄球菌等的抑制作用；除此之外，劉玉梅等[10]以及席清平等[11]研究了沒(méi)食子酸對(duì)幾種口腔常見(jiàn)菌變異鏈球菌、血鏈球菌、變形鏈球菌、粘性放線菌、牙齦卟啉單胞菌的抑制作用。表明沒(méi)食子酸抗菌效果好，應(yīng)用范圍廣，可以應(yīng)用于不同用途。

查閱現(xiàn)有資料，有關(guān)大黃和五倍子組合使用的文獻(xiàn)較少，蔣玲玲等[12-14]使用煎煮法將大黃和五倍子配伍使用，但是煎煮法存在很多問(wèn)題：①產(chǎn)品因處于水環(huán)境下易腐敗變質(zhì)；②產(chǎn)品質(zhì)量受道地藥材的限制；③有效抑菌成分不明確，產(chǎn)品質(zhì)量均一性差。為此，本試驗(yàn)提取了大黃中的有效成分，并根據(jù)有效成分的含量和氣味、色澤等物理性質(zhì)選擇了大黃素和蘆薈大黃素與五倍子的主要成分沒(méi)食子酸進(jìn)行配伍，制成了一種抑菌水溶液，并且從文獻(xiàn)中選擇了具有代表性的幾種菌：金黃色葡萄球菌、變形鏈球菌、血鏈球菌、粘性放線菌、牙齦卟啉單胞菌、表兄鏈球菌[15]、內(nèi)氏放線菌作為此制劑的測(cè)試菌種，經(jīng)試驗(yàn)，該制劑成分明確，抑菌作用較好，可應(yīng)用范圍廣泛。

1 儀器與試劑

1.1儀器 SIL-20A高效液相色譜儀(日本島津)；XP205電子天平(梅特勒-托利多儀器(上海)有限公司)；比濁儀(美國(guó)BBLTM CrystalSpecTM Nephelometer公司)。

1.2試劑 甲醇(分析純，天津光復(fù)精細(xì)化工研究所)；鹽酸(分析純，天津光復(fù)精細(xì)化工研究所)；三氯甲烷(分析純，天津光復(fù)精細(xì)化工研究所)；冰醋酸(分析純，天津光復(fù)精細(xì)化工研究所)；硫酸(分析純，天津光復(fù)精細(xì)化工研究所)；石油醚(分析純，天津光復(fù)精細(xì)化工研究所)；山梨酸鉀(寧波王龍科技股份有限公司)；超純水(Milli-Q A10超純水機(jī)自制)；羧甲基纖維素鈉(上海申光食用化學(xué)品有限公司)；薄荷味食用香精(寧波威龍香精香料有限公司)；食用甘油(瑞鑫糖藝工具廠)；食用維生素C(鄭州指南針生物科技有限公司)；大黃(購(gòu)于北京同仁堂天津南開(kāi)大藥房，批號(hào)20180606，經(jīng)天津醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院唐鋮教授鑒定)；蘆薈大黃素對(duì)照品(西安開(kāi)來(lái)生物工程有限公司，純度為98%，批號(hào)20180825)；大黃素對(duì)照品(西安開(kāi)來(lái)生物工程有限公司，純度為98%，批號(hào)20180813)； 沒(méi)食子酸對(duì)照品(西安開(kāi)來(lái)生物工程有限公司，純度為98%，批號(hào)20180719)。

1.3菌種信息 內(nèi)氏放線菌 (Actinomycesnaeslundii，菌落編號(hào)BNCC106505)購(gòu)自北納生物，-80 ℃凍存，37 ℃、CM0006培養(yǎng)基上培養(yǎng)；血鏈球菌(Streptococcussanguinis，菌落編號(hào)BNCC134927)購(gòu)自北納生物，2～8 ℃冷藏保存，37 ℃、5% CO2條件下，在哥倫比亞血平板上培養(yǎng)；牙齦卟啉單胞菌(Porphyromonasgingivalis，菌落編號(hào)BNCC 337441)購(gòu)自北納生物，2～8 ℃冷藏保存，37 ℃、嚴(yán)格厭氧條件下，在即用型哥倫比亞血平板上培養(yǎng)；粘性放線菌(Actinomycesviscosus，菌落編號(hào)BNCC336944)購(gòu)自北納生物，2～8 ℃冷藏保存，37 ℃、5% CO2條件下，在即用型哥倫比亞血平板上培養(yǎng)；金黃色葡萄球菌(Actinomycesviscosus，菌落編號(hào)BNCC186335)購(gòu)自北納生物，2～8 ℃冷藏保存，37 ℃條件下，在營(yíng)養(yǎng)瓊脂/肉汁培養(yǎng)基上培養(yǎng)；變形鏈球菌(Streptococcusmutans，菌落編號(hào)ATCC700610)購(gòu)自ATCC，-20 ℃保存，37 ℃、5% CO2條件下，在腦心注射瓊脂/肉湯培養(yǎng)基上培養(yǎng)；表兄鏈球菌(Streptococcussobrinus，菌落編號(hào)ATCC700610)購(gòu)自ATCC，-20 ℃保存，37 ℃、5% CO2條件下，在腦心注射瓊脂/肉湯培養(yǎng)基上培養(yǎng)。

2 試驗(yàn)方法

2.1大黃素及蘆薈大黃素的提取 取大黃粉50 g，置于500 ml圓底燒瓶中，加20%H2SO4溶液100 ml，氯仿50 ml，水浴回流2 h，傾出上清液，燒瓶殘?jiān)?0%H2SO4溶液50 ml、氯仿100 ml，水浴繼續(xù)回流1 h，合并提取液，分離氯仿層，水洗兩次。將氯仿提取液置于1 000 ml分液漏斗中，以2.5%NaHCO3水液200 ml分兩次萃取，棄去水層合并氯仿層，以2.5% Na2CO3水液300 ml分兩次萃取，合并Na2CO3萃取液，加HCl酸化至pH=3，析出沉淀后靜置抽濾得大黃素，低溫干燥，以10 ml冰醋酸重結(jié)晶；合并氯仿液，以0.5% NaOH水液300 ml分兩次萃取，合并水層，用加HCl酸化至pH=3～4，析出沉淀后靜置抽濾得蘆薈大黃素，低溫干燥，以10 ml冰醋酸重結(jié)晶。

2.2高效液相色譜條件 Kromasil C18柱，(250 mm×4.6 mm，5 μm)，流動(dòng)相：甲醇-水=(80∶20)，檢測(cè)波長(zhǎng)為254 nm[16]，流速為1.0 ml/min，柱溫為25 ℃，進(jìn)樣量為20 μl。

2.3抑菌試驗(yàn)

2.3.13種有效成分的濃度選擇 據(jù)文獻(xiàn)記載，大黃素有效抑菌濃度為2～16 mg/100 ml，蘆薈大黃素的有效抑菌濃度為1～8 mg/100 ml[7]，沒(méi)食子酸的有效抑菌濃度為12.5～1 000 mg/100 ml[1,8-10]，因此本試驗(yàn)對(duì)3種提取物設(shè)計(jì)了不同濃度來(lái)考查對(duì)幾種細(xì)菌的抑制作用。

2.3.2抑菌試驗(yàn)步驟 將各種菌株復(fù)蘇48 h后，分別接種于腦心浸液瓊脂(BHI)液體培養(yǎng)基中，在80%氮?dú)狻?0%二氧化碳、37 ℃下厭氧培養(yǎng)24 h，涂片檢查為純培養(yǎng)后，應(yīng)用比濁儀測(cè)定各菌懸液的濃度，用BHI培養(yǎng)基將所有菌懸液濃度調(diào)至3×108cfu/ml備用。用打孔器將中性濾紙打成直徑為6 mm的圓片，于120 ℃干熱30 min后，無(wú)菌保存?zhèn)溆?。制備含藥濾紙片時(shí)，將濾紙片置于無(wú)菌的空培養(yǎng)皿內(nèi)，在超凈工作臺(tái)上，打開(kāi)培養(yǎng)皿蓋，將待測(cè)藥液1 ml緩慢滴加到濾紙片上。隨后，蓋上培養(yǎng)皿蓋，并置于4 ℃冰箱內(nèi)浸泡過(guò)夜，然后經(jīng)冷凍干燥器凍干，4 ℃密閉保存。將各菌種接種于5 ml BHI液中，95%氮?dú)狻?%二氧化碳、37 ℃厭氧培養(yǎng)18 h，應(yīng)用麥?zhǔn)媳葷針?biāo)準(zhǔn)，調(diào)節(jié)其濃度為108cfu/ml，取50 μl接種于100 mm平皿中，涂勻，小心夾取含藥濾紙片放在瓊脂培養(yǎng)基表面，輕壓紙片，使其與瓊脂恰當(dāng)接觸。在95%氮?dú)狻?%二氧化碳、37 ℃下培養(yǎng)48 h后，用游標(biāo)卡尺測(cè)各紙片的抑菌圈大小。

2.4液體抑菌制劑的制備 制劑中沒(méi)食子酸使用購(gòu)買(mǎi)的沒(méi)食子酸標(biāo)準(zhǔn)物，大黃素和蘆薈大黃素使用實(shí)驗(yàn)室提取物。量取純化水100 ml，向其中緩慢加入羧甲基纖維素鈉0.15 g，邊加邊攪拌，至羧甲基纖維素鈉完全溶解， 然后將沒(méi)食子酸800 mg溶解在上述溶液中，隨后加入大黃素8 mg、蘆薈大黃素8 mg攪拌至溶解。最后根據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道[17-20]加入下列佐劑：甘油2.5 g，山梨酸鉀0.02 g，薄荷味食用香精1 ml，維生素C 3 g。

3 結(jié)果與討論

3.1大黃素和蘆薈大黃素提取試驗(yàn)結(jié)果 取大黃素對(duì)照品、大黃素提取物、蘆薈大黃素對(duì)照品與蘆薈大黃素提取物分別制備成溶液，按“2.2”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣分析，結(jié)果大黃素和蘆薈大黃素提取物與大黃素和蘆薈大黃素標(biāo)準(zhǔn)品的出峰時(shí)間相同，故說(shuō)明本項(xiàng)目的提取方法實(shí)現(xiàn)了藥材中大黃素和蘆薈大黃素的富集分離。見(jiàn)圖1和圖2。

3.2抑菌試驗(yàn)結(jié)果 為了驗(yàn)證大黃素、蘆薈大黃素和沒(méi)食子酸的抑菌效果，本文選擇了7種常見(jiàn)菌(金黃色葡萄球菌、變形鏈球菌、血鏈球菌、粘性放線菌、牙齦卟啉單胞菌、表兄鏈球菌、內(nèi)氏放線菌)作為測(cè)試菌種，根據(jù)文獻(xiàn)設(shè)置了不同濃度梯度，試驗(yàn)結(jié)果如圖3-6所示。

1.大黃素

1.蘆薈大黃素

為了探究大黃素對(duì)7種菌的抑制作用，作者查閱文獻(xiàn)后設(shè)計(jì)了4個(gè)濃度梯度的大黃素溶液，用濾紙片法測(cè)定了各抑菌圈的直徑，得到不同菌種抑菌圈的平均值和標(biāo)準(zhǔn)偏差后繪制了圖3的柱狀圖。由圖3可以看出，在濃度為2～8 mg/100 ml范圍內(nèi)，隨著大黃素濃度的增加，大黃素對(duì)各測(cè)試菌種的抑制作用基本呈現(xiàn)上升趨勢(shì)，因此在本文所選的濃度梯度內(nèi)，大黃素濃度為8 mg/100 ml時(shí)，大黃素對(duì)各測(cè)試菌種的抑制作用最大。

圖3 不同濃度的大黃素對(duì)測(cè)試菌種的抑制作用

圖4 不同濃度的蘆薈大黃素對(duì)測(cè)試菌種的抑制作用

為了探究蘆薈大黃素對(duì)7種菌的抑制作用，作者查閱文獻(xiàn)后設(shè)計(jì)了4個(gè)濃度梯度的蘆薈大黃素溶液，用濾紙片法測(cè)定了各抑菌圈的直徑，得到不同菌種抑菌圈的平均值和標(biāo)準(zhǔn)偏差后繪制了圖4的柱狀圖。由圖4可以看出，隨著蘆薈大黃素濃度的增加，蘆薈大黃素對(duì)7種菌的抑制作用基本都呈現(xiàn)上升的趨勢(shì)，因此在本文所選的濃度梯度內(nèi)，蘆薈大黃素濃度為8 mg/100 ml對(duì)所有的測(cè)試菌種都有最大的抑制作用，各個(gè)菌種抑菌圈直徑最大。

為了探究沒(méi)食子酸對(duì)7種菌的抑制作用，經(jīng)文獻(xiàn)調(diào)研后，作者設(shè)計(jì)了8個(gè)濃度梯度的沒(méi)食子酸溶液，用濾紙片法測(cè)定了各抑菌圈的直徑，得到不同菌種抑菌圈的平均值和標(biāo)準(zhǔn)偏差后繪制了圖5的柱狀圖。由圖5可知，在濃度為12.5～400 mg/100 ml時(shí)，隨著沒(méi)食子酸濃度的增加，沒(méi)食子酸對(duì)各測(cè)試菌種的抑制作用均增加，當(dāng)沒(méi)食子酸濃度增加到800 mg/100 ml時(shí)，沒(méi)食子酸對(duì)各個(gè)菌種的抑制作用產(chǎn)生了差異。因此在本文所選的濃度梯度內(nèi)，沒(méi)食子酸濃度為800 mg/100 ml對(duì)所有的測(cè)試菌種都有最大的抑制作用，各個(gè)菌種抑菌圈直徑最大。

綜上可知，大黃素濃度為8 mg/100 ml、蘆薈大黃素濃度為8 mg/100 ml、沒(méi)食子酸濃度為800 mg/100 ml時(shí)，對(duì)7種菌的抑制作用最強(qiáng)，因此以3種有效成分的最大抑菌濃度配伍制成抑菌制劑，考查其對(duì)7種菌的抑制作用，試驗(yàn)結(jié)果如圖6和表1所示。由圖可知，3種化合物組合使用對(duì)測(cè)試菌種均有較強(qiáng)的抑菌作用，抑菌圈直徑均大于各組分單獨(dú)使用時(shí)的抑菌圈直徑(參見(jiàn)表1)。經(jīng)SPSS軟件分析，組合后的抑菌效果與單獨(dú)使用三者相比，抑菌作用有明顯的提高。圖6和表1的結(jié)果表明3種化合物組合使用顯著增強(qiáng)了抑菌效果，進(jìn)一步揭示3種化合物的抑菌機(jī)制可能不同，有關(guān)工作有待進(jìn)一步研究。

圖5 不同濃度的沒(méi)食子酸對(duì)測(cè)試菌種的抑制作用

圖6 抑菌制劑對(duì)測(cè)試菌種的抑制作用

表1 3種提取物最大抑菌濃度抑菌圈大小及三者組合后的抑菌圈大小

4 結(jié)論及展望

本試驗(yàn)從大黃中提取了大黃素和蘆薈大黃素，并將兩者分別與標(biāo)準(zhǔn)品對(duì)照后確認(rèn)了提取物的成分。

查閱文獻(xiàn)后分別對(duì)大黃素設(shè)計(jì)了4個(gè)濃度梯度，對(duì)蘆薈大黃素設(shè)計(jì)了4個(gè)濃度梯度，對(duì)沒(méi)食子酸設(shè)計(jì)了8個(gè)濃度梯度，考查了三者對(duì)7種常見(jiàn)菌的抑制作用，發(fā)現(xiàn)當(dāng)大黃素濃度為大黃素濃度為8 mg/100 ml、蘆薈大黃素濃度為8 mg/100 ml、沒(méi)食子酸濃度為800 mg/100 ml時(shí)，對(duì)各菌種的抑制作用較強(qiáng)；對(duì)三者按最佳抑菌效果配伍制成制劑后繼續(xù)考查其抑菌效果，發(fā)現(xiàn)抑菌作用比單獨(dú)使用各提取物的抑菌效果增強(qiáng)。因此該配伍方式合理，對(duì)所選菌種有很好的抑制效果。

所選菌種中除常見(jiàn)菌如金黃色葡萄球菌、變形鏈球菌等還有部分口腔常見(jiàn)菌，如牙齦卟啉單胞菌、表兄鏈球菌。研究發(fā)現(xiàn)，3種提取物以及所制備的配伍制劑對(duì)口腔常見(jiàn)菌也有抑制作用，表明大黃和五倍子提取物可以用于口腔輔助治療，進(jìn)一步可以考慮將三者配伍組合制成抑菌水劑用于臨床上的口腔輔助治療。