劉子璐，胡渤洋，王文平，陳青君，孫 悅，張 嬌，張國慶*

(北京農(nóng)學院a.生物與資源環(huán)境學院/農(nóng)業(yè)農(nóng)村部華北都市農(nóng)業(yè)重點實驗室；b.植物科學技術學院/北京林木分子設計育種高精尖創(chuàng)新中心，農(nóng)業(yè)應用新技術北京市重點實驗室，北京 102206)

白腐真菌(White rot fungi)是一類能夠降解木材并造成白色腐朽的真菌，它們能夠分泌多種降解木質纖維素的胞外酶，且降解木質素能力強于降解纖維素的能力[1]。白腐真菌作為木質纖維素分解者，在自然界碳循環(huán)中扮演著極其重要的作用，它們的木質素降解酶系統(tǒng)(Ligninolytic enzyme system)主要包括3種酶：錳過氧化物酶(Manganese peroxidase,MnP)、木質素過氧化物酶(Lignin peroxidase, LiP)和漆酶(Laccase, Lac)，它們共同作用將木質素最終降解為二氧化碳和水。由于它們能夠降解芳香、雜環(huán)類化合物，目前已在造紙、堆肥、環(huán)保等領域廣泛應用[2-4]。

白黃小脆柄菇(Psathyrellacandolleana)，又稱黃蓋小脆柄菇、垂幕菇、薄花邊傘等，是小脆柄菇屬常見種之一，常見于林中地上、草地、路旁或腐木等，群生或近叢生，可食用，分布于亞洲、歐洲、北美等地區(qū)[5]。傅愷等利用白黃小脆柄菇進行液體深層發(fā)酵獲得胞外漆酶，產(chǎn)量達到9 100 IU/L[6]。李學梅等從白黃小脆柄菇發(fā)酵液提取物中分離到一種新的血莧烷型倍半萜[7]。該研究前期從北京農(nóng)學院校園內采集并分離的一株小脆柄菇屬真菌，菌絲體未測得漆酶活性，與前人文獻報道不同，可能具有不同的木質素降解酶系。因此，擬開展菌株分類鑒定、菌絲體培養(yǎng)條件以及木質素降解酶活性測定研究，明確其木質素降解酶系，為其開發(fā)利用奠定理論和試驗基礎。

1 材料與方法

1.1 材 料

小脆柄菇子實體采集自北京農(nóng)學院，由生物與資源環(huán)境學院食藥用菌課題組分離與保藏。

菌株分離與保藏利用馬鈴薯葡萄糖瓊脂(PDA)培養(yǎng)基。液體發(fā)酵利用馬鈴薯葡萄糖(PD)培養(yǎng)基，液體發(fā)酵使用250 mL錐形瓶，每瓶裝50 mL培養(yǎng)基。菌絲最適培養(yǎng)條件基礎培養(yǎng)基參考王壽南等的報道[8]。

1.2 方 法

1.2.1 菌株的分離、培養(yǎng)與保存 菌株分離采用組織分離法[8]。菌株編號為F1734，于25 ℃避光培養(yǎng)7 d，于4 ℃保藏。

1.2.2 形態(tài)與分子鑒定 觀察子實體形態(tài)并記錄。菌絲顯微觀察采用插片培養(yǎng)法。分子鑒定采用內轉錄間隔區(qū)(ITS)鑒定法，引物為通用引物ITS1和ITS4。目的序列比對采用BLAST在線比對分析(http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)，利用MEGA 7.0軟件、采用鄰接法(Neighbor-Joining, NJ)構建系統(tǒng)發(fā)育樹，確定目標菌株的分類學地位[8]。

1.2.4 液體發(fā)酵產(chǎn)木質素降解酶活性 以新鮮的F1734菌餅接種于PDA平皿(9 cm)上，25 ℃避光培養(yǎng)至剛剛長滿平皿，無菌條件下將其轉移至無菌組織勻漿器中，加入50 mL 無菌液體發(fā)酵培養(yǎng)基，充分勻漿，制成種子液，以5%(V/V)的接種量將種子液添加到液體發(fā)酵培養(yǎng)基中，28 ℃，150 r/min振蕩培養(yǎng)。在接種第3至第9天隨機取3瓶，4 ℃、8 000 r/min、30 min離心，將菌絲體和上清液分離。菌絲體于35 ℃烘2 h、55 ℃烘至恒重，測量干重。取上清液分別測定胞外Lac、MnP和LiP酶活。Lac活性測定采用2,2’-連氮-雙-3-乙基苯并噻唑-6-磺酸(ABTS)法[9]。酶活單位(Unit, U)定義為：在420 nm處，每1 min催化1 μmol ABTS生成產(chǎn)物所需的酶量[10]。MnP活性測定采用MnSO4作為底物。酶活單位定義為：在240 nm處，每1 min催化1 μmol Mn2+轉化為Mn3+所需的酶量[11]。LiP酶活性測定采用藜蘆醇作為底物。酶活單位定義為：在310 nm處，每1 min催化1 μmol藜蘆醇轉化為藜蘆醛所需的酶量[12]。

1.2.5 統(tǒng)計學分析 所有數(shù)據(jù)采用SPSS 23.0統(tǒng)計軟件進行處理和分析。結果用平均值±標準差(mean ±SD)表示，對不同處理進行單因素方差分析，P<0.05代表數(shù)據(jù)存在顯著性差異。

2 結果與分析

2.1 形態(tài)特征鑒定結果

F1734菌株子實體形態(tài)如圖1-A所示。其子實體發(fā)生于道路旁腐木落葉層、群生，子實體小至中型，菌蓋幼嫩時圓錐形、成熟后平展，初期邊緣附有白色菌幕殘片、后漸脫落，菌蓋邊緣污白至米黃色、中央黃褐色，菌褶直生、密、不等長、污白、灰白至深紫褐色，菌柄細長、中生、中空、質地極脆、表面具白色纖毛，白色至污白色。其子實體形態(tài)特征與前人報道白黃小脆柄菇一致[13]。純培養(yǎng)菌落形態(tài)如圖1-B所示，菌落白色、不產(chǎn)色素，菌絲致密濃白。菌絲顯微形態(tài)如圖1-C所示，營養(yǎng)菌絲無色透明，薄壁，有隔，多核，偶見鎖狀聯(lián)合。

A.子實體；B.菌落；C.菌絲體圖1 F1734菌株形態(tài)特征A. Fruiting body; B. Colony;C. MyceliaFig.1 Morphological characteristics of F1734 strain

2.2 分子鑒定結果

經(jīng)PCR擴增獲得F1734菌株ITS序列片段，經(jīng)測序獲得長度為695 bp的目的序列片段。利用Blast在線比對確定其為小脆柄菇屬。以小脆柄菇屬相近種、利用MEGA 7.0軟件構建系統(tǒng)發(fā)育樹(圖2)。聚類分析結果表明，F(xiàn)1734菌株與白黃小脆柄菇(P.candolleana)(EU622272.1)的相似性最高，為99%，遺傳距離為0.008。結合形態(tài)和分子鑒定，確定F1734菌株為白黃小脆柄菇。

圖2 基于ITS序列的F1734菌株與相近屬真菌的系統(tǒng)發(fā)育分析Fig.2 Polymeric analysis of strain F1734 and other strains from closegenera based on ITS sequences

2.3 最適培養(yǎng)條件

F1734菌株在蔗糖、淀粉等7種碳源及無碳源基礎培養(yǎng)基(CK)上均能生長(表1)，菌落均為白色，無色素產(chǎn)生。菌絲在蔗糖培養(yǎng)基上生長速率最快(1.52 ± 0.03)mm/d，但長勢較濃密，菌落產(chǎn)生絮狀氣生菌絲及同心圓結構。菌絲在麥芽糖培養(yǎng)基上生長速率為(1.34 ± 0.03) mm/d，長勢最佳，菌落致密、濃白、均一，無同心圓結構。菌絲在羧甲基纖維素鈉培養(yǎng)基上長勢最弱，表明F1734菌株纖維素酶活性較低。綜合菌絲生長速率和菌絲長勢，F(xiàn)1734菌絲體最適碳源為麥芽糖。

表1 不同碳源、氮源和C/N比對F1734菌株菌絲體生長的影響

Tab.1 Effect of carbon, nitrogen, and C/N ratioon mycelial growth of strain F1734

生長因子GrowthFactor菌絲生長速率v/(mm/d)Mycelial growth rate菌絲長勢Mycelial growthC源Carbon source蔗糖Sucrose1.52 ± 0.03 a+ +淀粉Starch1.41 ± 0.00 b+ +山梨醇Sorbitol1.39 ± 0.04 bc+ +對照CTL1.39 ± 0.02 bc+ +麥芽糖Maltose1.34 ± 0.03 cd+ + +羧甲基纖維素鈉Carboxymethylcellulose sodium1.29 ± 0.06 de+葡萄糖Glucose1.28 ± 0.05 e+ +乳糖Lactose1.12 ± 0.01 f+ +N源Nitrogen sourse尿素Urea4.67 ± 0.24 a+ +胰蛋白胨Casein tryptone4.09 ± 0.20 b+ + +酵母浸粉Yeast extract3.66 ± 0.17 c+ +黃豆粉Soybean meal3.38 ± 0.23 c+對照CTL3.31 ± 0.23 c—牛肉膏Beef extract2.49 ± 0.05 d+ +硫酸銨Ammonium sulfate0.98 ± 0.20 f+C/N比C/N ratio10/14.35 ± 0.06 a+ + +40/14.09 ± 0.08 b+ + +20/14.08 ± 0.10 b+ + +30/14.03 ± 0.08 bc+ + +60/13.92 ± 0.03 c+ + +50/13.26 ± 0.03 d+ + +10/14.35 ± 0.06 a+ + +

—：不生長；+：生長稀疏；+ +：生長較致密；+ + +：生長旺盛。不同小寫字母表示差異顯著(P< 0.05)

—:No mycelia growth; +: mycelial growth weak; + +: mycelial growth ordinary; + + +: mycelial growth strong. Different small letters indicate significant differences (P< 0.05)

圖3 溫度和pH對F1734菌株菌絲生長的影響Fig.3 Effect of temperatureandpHon mycelial growth of strain F1734

F1734菌株在尿素、胰蛋白胨等6種氮源培養(yǎng)基上均能生長(表1)。而在無氮源基礎培養(yǎng)基(CK)上幾乎不生長，除硫酸銨培養(yǎng)基外，菌落均為白色，無色素產(chǎn)生。菌絲在以尿素為氮源的培養(yǎng)基上生長速率最快(4.67 ± 0.24) mm/d，其次是胰蛋白胨(4.09 ± 0.20) mm/d，但后者菌絲長勢最佳，菌絲濃白。在硫酸銨的培養(yǎng)基上生長速率最慢(0.98 ± 0.20) mm/d，長勢最弱，菌落邊際不均一，且分泌黃色色素。綜合菌絲生長速率及菌絲長勢，F(xiàn)1734菌絲生長最適氮源為胰蛋白胨。

F1734菌株在C/N比10/1至60/1范圍均能生長良好(表1)，菌絲致密濃白。菌絲在C/N比為10/1培養(yǎng)基上生長速率最快(4.35 ± 0.06) mm/d，其次為40/1培養(yǎng)基(4.09 ± 0.08) mm/d，在50/1培養(yǎng)基上生長速率最慢(3.26 ± 0.03) mm/d。綜合菌絲生長速率及菌絲長勢，F(xiàn)1734菌絲生長的最適C/N比為10/1。

F1734菌株在20～32 ℃下均能生長，在37 ℃時無法生長(圖3-A)，菌落白色。20 ℃培養(yǎng)時菌絲生長速率較快，但菌絲長勢較25～30 ℃培養(yǎng)時稍弱；菌株在25～30 ℃培養(yǎng)時生長速率最快(3.75 ± 0.07)～(3.98 ± 0.06) mm/d，菌絲濃白致密。當溫度高于30 ℃時，菌絲生長速率下降、長勢變弱，32 ℃培養(yǎng)時生長速率僅為(1.09 ± 0.11) mm/d。而當溫度達到37 ℃時，菌株無法生長。綜合菌絲生長速率及菌絲長勢，F(xiàn)1734菌絲體生長最適溫度范圍為25～30 ℃。

F1734菌株在pH 6.0～11.0時均能生長，在pH 7.0～9.0時生長速率最快、長勢最佳，而當pH低于7.0或高于9.0時菌絲生長速率迅速下降(圖3-B)。pH 7.0～9.0時生長速率最快(3.99 ± 0.06)～(4.10 ± 0.05) mm/d，菌絲致密濃白；而pH 5.0時生長速率最慢(0.80 ± 0.02) mm/d，長勢最弱，且菌落形狀不規(guī)則。綜合菌絲生長速率和菌絲長勢，F(xiàn)1734菌絲體生長最適pH值在7.0～9.0之間。

2.4 液體發(fā)酵產(chǎn)木質素降解酶活性

F1734菌株液體發(fā)酵時，在第3～7天呈線性生長，在第7天菌絲干重達到最大，50 mL發(fā)酵液中菌絲干重達到(25.63 ± 5.12) mg，在7～9 d菌絲生物量保持相對穩(wěn)定(圖4-A、圖4-B～D)。F1734菌株液體發(fā)酵產(chǎn)Lac、MnP和LiP結果如圖4-B～D所示。在發(fā)酵培養(yǎng)的第3～9天，發(fā)酵液中均未檢測出Lac活性，表明該條件下F1734菌株無胞外漆酶活性(圖4-B)。MnP酶活在第4天開始出現(xiàn)，隨后逐漸增加，在第7天時達到峰值，為(186.32±7.29) U/mL，隨后迅速下降(圖4-C)。LiP在第3天時表現(xiàn)出較高的活性，達到(3 787.90±283.43) U/mL，后緩慢上升，在第5天時酶活達到最高，為(4 890.20±979.37) U/mL，隨后在第5～7天時逐漸下降，在7～9 d酶活達到相對穩(wěn)定，為(2 823.18 ～3 106.33) U/mL(圖4-D)。

A.生物量；B.漆酶；C.錳過氧化物酶；D.木質素過氧化物酶圖4 F1734菌株液體發(fā)酵生物量與木質素降解酶活性A. Biomass; B. Lac; C. MnP; D. LiPFig.4 Biomass and ligninolytic enzyme activities of during the liquid fermentation of strain F1734

3 討論與結論

白腐真菌對木質素的降解主要依賴于一些胞外酶，這些酶共同構成被稱之為木質素降解酶系統(tǒng)，主要包括Lac、MnP和LiP等，它們各有分工又協(xié)同合作，為白腐真菌的生物降解能力提供基礎[2]。根據(jù)這些木質素降解酶在木質素降解過程中扮演作用的不同，前人將白腐真菌分為三大類，即LiP-MnP類(LiP-MnP group)、MnP-Lac類(MnP-Lac group)和LiP-Lac類(LiP-Lac group)[14]。木質素降解酶系統(tǒng)研究最早也最為系統(tǒng)的是黃孢原毛平革菌(Phanerochaetechrysosporium)，它能夠分泌MnP和LiP，但不分泌Lac，屬于LiP-MnP類；而紅平菇(Pleurotusdjamor)可同時產(chǎn)生MnP和Lac，但不產(chǎn)生LiP，則屬于MnP-Lac類[14, 15]。該研究前期以小脆柄菇F1734菌株開展產(chǎn)酶實驗時發(fā)現(xiàn)，該菌株能夠使愈創(chuàng)木酚平板變色，但不具有產(chǎn)漆酶活性，因而進一步開展了菌株鑒定、培養(yǎng)條件與液體發(fā)酵產(chǎn)木質素降解酶研究，分析其木質素降解酶系，為進一步開展該菌株木質素降解酶系統(tǒng)研究奠定基礎。

小脆柄菇屬(Psathyrella)真菌隸屬于擔子菌門(Basidomycota)傘菌綱(Agaricomycetes)傘菌目(Agaricales)脆柄菇科(Psathyrellaceae)，最初由Fries于1874年定義，模式種為褐白小脆柄菇(Psathyrellagracilis)[5]。小脆柄菇屬廣泛分布于世界各地，在中國各地區(qū)均有報道，世界范圍內至少存在400～600種[13]。小脆柄菇屬真菌多發(fā)生于夏秋季節(jié)道旁、林緣、林中的腐木周圍及草地、牧場等，可以食用，能用于木質素降解、制備香料等，具有一定的經(jīng)濟價值[16-18]。小脆柄菇通常具有濕潤的菌蓋，菌蓋多呈圓錐形或鐘型或扁半球形、薄，顏色多為淺黃色或褐色。菌柄較長，中空，彎曲狀。孢子印跡呈褐色甚至黑色和較為脆弱的擔子果等特點[5, 19]。由于小脆柄菇屬的菌株具有較脆弱的擔子和容易變色的濕潤菌蓋，所以利用形態(tài)學特征對其進行分類學鑒定具有較大的難度并且準確度不高。

近些年來，分子技術已廣泛應用于對其的物種鑒定和系統(tǒng)發(fā)育學研究[20]。王月等報道，該屬在中國26個省均有分布，包括51個種[5]。Yan等對中國東北的27個小脆柄菇屬菌株進行研究發(fā)現(xiàn)了4個新種，分別是P.conica、P.jilinensis、P.mycenoides和P.subsingeri[21]。該研究通過形態(tài)學比較，發(fā)現(xiàn)F1734菌株子實體形態(tài)符合前人對白黃小脆柄菇(P.candolleana)形態(tài)描述[5, 13]。另外，基于ITS的系統(tǒng)發(fā)育樹表明，F(xiàn)1734菌株與白黃小脆柄菇(EU622272.1)的相似性達到99%。因此，結合形態(tài)和分子鑒定，確定F1734菌株為白黃小脆柄菇。

對F1734菌株菌絲最適培養(yǎng)條件研究表明，該菌株最適碳源為麥芽糖，最適氮源為胰蛋白胨，最適C/N比為10/1，最適溫度范圍為25～30 ℃，最適pH值范圍為7.0～9.0。盡管白黃小脆柄菇屬于可食野生菌，其菌絲培養(yǎng)條件研究暫無相關報道，而前人對其相近屬鬼傘屬(Coprinus)培養(yǎng)條件研究較多。郝冊等報道，分離自北京市懷柔區(qū)寶山鎮(zhèn)的墨汁鬼傘(C.atramentarius)菌絲體生長的最適碳源為葡萄糖+玉米淀粉、最適氮源為蛋白胨、最適pH值為9[22]。朱玉蘭等報道，分離自祁連山的毛頭鬼傘菌(C.comatus)菌絲生長的最適碳源為蔗糖、最適氮源為酵母粉、最適溫度為24～26 ℃、最適pH為7.0[23]。F1734菌株最適碳、氮源常見，最適溫度、最適pH溫和，有利于減少工業(yè)發(fā)酵條件下的菌絲培養(yǎng)的開發(fā)成本。

在利用馬鈴薯浸提物、蔗糖的液體發(fā)酵培養(yǎng)時，F(xiàn)1734菌株具有胞外MnP和LiP活性，而缺乏Lac活性，表明該菌株屬于LiP-MnP類白腐真菌。傅愷等報道，白黃小脆柄菇進行液體深層發(fā)酵獲得胞外漆酶，產(chǎn)量達到9100 IU/L[6]。張麗等報道，分離自廣州地區(qū)亞熱帶闊葉林的白黃小脆柄菇發(fā)酵液中具有漆酶活性，在第3天達到高峰為31525 IU/L[24]。這表明，F(xiàn)1734菌株具有不同于這2個菌株的木質素降解酶特性。前人報道中，白腐真菌產(chǎn)Lac和MnP類型較多，而產(chǎn)LiP類型較少[15]。本研究中，菌株表現(xiàn)出較高的LiP和MnP活性，其中MnP活性是絨毛栓孔菌(Trametespubescens)的20倍左右[11]、是紅平菇(P.djamor)的100倍[25]，LiP活性是紅平菇的20倍[26]，顯著高于前人研究結果。

綜上，該研究通過對采集得到的菌種進行分離鑒定，獲得一株白黃小脆柄，并確定了菌絲培養(yǎng)條件，明確該菌株屬于LiP-MnP類白腐真菌。同時也是首次對白黃小脆柄菇中的木質素過氧化物酶和錳過氧化物酶進行了報道，為其進一步開發(fā)利用奠定基礎。