付宇辰，吳 琦，閆子飛，胡增輝，冷平生

(北京農(nóng)學(xué)院 園林學(xué)院//北京林果業(yè)生態(tài)環(huán)境功能提升協(xié)同創(chuàng)新中心，北京 102206)

茉莉酸類物質(zhì)(Jasmonates，JAs)在植物體內(nèi)發(fā)揮著各項生理和信號分子的作用[1]。茉莉酸(JA)在植物體內(nèi)是由亞麻酸氧化合成的[2]。亞麻酸被細(xì)胞膜釋放起始，茉莉酸的形成還需要經(jīng)過脂氧合酶(Lipoxygenase，LOX)、丙二烯氧化合酶(Allen oxide synthase，AOS)、丙二烯氧化物環(huán)化酶(Allene oxide cyclase，AOC)、12-氧代植二烯酸還原酶(12-oxophytodienoate reductase，OPR)等關(guān)鍵酶催化與一系列的β氧化過程。AOC基因是茉莉酸合成途徑中的關(guān)鍵基因，其表達(dá)量直接影響植物體內(nèi)合成JA的含量。AOC可以將AOS的產(chǎn)物丙二烯氧化物(12,13(s)-epoxy-(9Z,11E,15Z)-octadecatrienoic acid, 12,13-EOT)特異性催化并生成1,2-氧-植物二烯酸(cis-(+)-12-oxo-phytodienoic acid,OPDA)產(chǎn)物，在α-亞麻酸代謝通路中起到了關(guān)鍵作用[3]。同時AOC基因也能參與脫落酸(Abscisic acid，ABA)信號途徑，通過增加其活性使植物的耐鹽性增強(qiáng)[4]。

百合(Liliumspp.)是著名的五大切花之一，‘西伯利亞’百合是市面上最常見的百合品種，也東方百合種系中的經(jīng)典代表。‘西伯利亞’百合花朵全為白色，花被片碩大，花香濃郁，有很高的觀賞價值，是日常生活中常見的百合切花品種之一[5]。本研究擬通過分子生物學(xué)手段，使用RACE技術(shù)在 ‘西伯利亞’百合中克隆得到LsAOC基因，并進(jìn)行生物信息學(xué)分析與時空表達(dá)分析，初步探究在花香的形成及釋放過程中茉莉酸信號途徑所起的作用，也為百合花香育種及應(yīng)用提供理論基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 材料與采樣方法

東方百合‘西伯利亞’種球，用等比例草炭與蛭石為基質(zhì)種植在北京農(nóng)學(xué)院園林植物實踐基地日光溫室內(nèi)。溫室溫度25～28 ℃，相對濕度55%～65%，通風(fēng)良好，肥料充足。采集花蕾期、半開期、盛開期、衰敗期4個不同時期的花被片，內(nèi)瓣、外瓣各取1片為1組用鋁箔紙包裹，暫存于液氮中。此外以相同方法另取盛開期百合的根、莖、葉、內(nèi)花被片、外花被片、子房、花柱、花絲、花藥共9組不同組織樣品，液氮暫存后在-80 ℃冰箱內(nèi)儲存。

1.2 試驗方法

1.2.1 總RNA提取與反轉(zhuǎn)錄 使用北京全式金生物技術(shù)有限公司的RNA提取試劑盒提取‘西伯利亞’百合總RNA，通過瓊脂糖電泳檢測及估算樣品RNA濃度，再使用TARAKA公司的反轉(zhuǎn)錄試劑盒將樣品總RNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA備用。方法參照2試劑盒說明書。

1.2.2LsAOC基因全長克隆 通過查找轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)庫中的資料得到基因序列片段，根據(jù)此片段在Primer3網(wǎng)頁(http://primer3.ut.ee)設(shè)計引物L(fēng)sAOC-ZJF和LsAOC-ZJR。以反轉(zhuǎn)錄得到的cDNA為模板將此引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，產(chǎn)物經(jīng)過純化回收、連接轉(zhuǎn)化、鑒定測序和比對分析得到了LsAOC基因中間片段，長度約為350 bp。后根據(jù)中間片段測序結(jié)果使用Primer3網(wǎng)頁設(shè)計5’端引物L(fēng)sAOC-5和3’端引物L(fēng)sAOC-3-1和LsAOC-3-2，分別進(jìn)行5’端與3’端RACE克隆，得到約700 bp的5’端片段和約350bp的3’端片段，測序并使用DNAMAN軟件將測序結(jié)果拼接，即得到LsAOC基因全長序列。根據(jù)LsAOC基因全長序列設(shè)計全長引物L(fēng)sAOC-QCF和LsAOC-QCR，PCR擴(kuò)增后產(chǎn)物長度與拼接結(jié)果相符，測序驗證為全長序列。

1.2.3LsAOC基因相對表達(dá)量分析 提取‘西伯利亞’百合4個開花時期和9個不同組織RNA，根據(jù)LsAOC基因全長序列設(shè)計熒光定量引物L(fēng)sAOC-YGF和LsAOC-YGR，選取β-Actin-F和β-Actin-R為內(nèi)參引物。反轉(zhuǎn)錄得到各組cDNA并以其為模板進(jìn)行熒光定量PCR，測定和記錄Ct值。使用WPS表格統(tǒng)計并分析LsAOC基因相對表達(dá)量。

表1 引物序列Tab.1 Primer sequences

2 結(jié)果與分析

2.1 LsAOC基因生物信息學(xué)分析

2.1.1LsAOC基因序列及蛋白同源性分析LsAOC基因CDS全長741bp，用DNAMAN軟件將其翻譯成氨基酸序列，該序列編碼246個氨基酸殘基(圖1)，輸入至NCBI網(wǎng)站(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/)發(fā)現(xiàn)此序列屬于Allene_ox_cyc 超基因家族，其中第22～246號氨基酸為PLN02343特異性位點。

使用NCBI網(wǎng)站的BLAST功能對LsAOC基因編碼的蛋白序列進(jìn)行在線比對，下載比對結(jié)果中與此序列相似性較高的10種其他植物的AOC氨基酸序列。用DNAMAN軟件的多序列比對功能比對后發(fā)現(xiàn)，‘西伯利亞’百合AOC蛋白序列與麝香百合(Liliumlongiflorum, AET50928.1)和岷江百合(Liliumregale, ART33463.1)相似性很高，可達(dá)93%；與赤豆(Vignaangularis, XP_017427281.1)的相似性稍次之，為77%；大多數(shù)植物如：木豆(Cajanuscajan, XP_020226154.1)、蔓花生(Arachisduranensis, XP_015967605.1)、牽牛花(Ipomoeanil, XP_019173088.1)和胡楊(Populuseuphratica, XP_011004427.1)等與‘西伯利亞’百合的相似性均為76%。與鳳梨(Ananascomosus, XP_020106214.1)、豌豆(Pisumsativum, BAE45342.1)和大豆(Glycinemax, NP_001304386.1)的相似度在74%以上(圖2)。

圖1 LsAOC基因序列及其編碼的蛋白序列Fig.1 The gene sequence and deduced amino acid sequence of LsAOC

2.1.2 ‘西伯利亞’百合LsAOC編碼蛋白的理化性質(zhì)分析及結(jié)構(gòu)預(yù)測 通過ExPASy網(wǎng)站ProtParam和Compute pI/Mw工具預(yù)測得到，LsAOC蛋白呈堿性，共有21個負(fù)電荷氨基酸殘基和23個正電荷氨基酸殘基，以亮氨酸、脯氨酸、絲氨酸、苯丙氨酸為氨基酸主要組成成分。其理論等電點為8.44，脂肪系數(shù)為82.80，相對分子質(zhì)量27.52 kD。LsAOC蛋白屬于不穩(wěn)定蛋白，不穩(wěn)定系數(shù)為59.57；其亦為親水性蛋白，平均親水指數(shù)為-0.217。通過 ExPASy 網(wǎng)站的GOR4工具預(yù)測得到，LsAOC蛋白二級結(jié)構(gòu)，其中Cc包含178個氨基酸殘基，占氨基酸殘基總數(shù)的72.36%；Ee包含46個氨基酸殘基，占18.70%；Hh包含22個氨基酸殘基，占總氨基酸殘基8.94%。利用Swiss-model 程序構(gòu)建了LsAOC蛋白的三維立體結(jié)構(gòu)模型。以ALLENE OXIDE CYCLASE 2(4cq6.1.A)為模板，相似性達(dá)68.79%(圖3)。

2.2 LsAOC基因表達(dá)分析結(jié)果

在‘西伯利亞’百合4個不同花期中，LsAOC基因的相對表達(dá)量變化呈現(xiàn)出一定的規(guī)律。LsAOC基因在花蕾期、半開期和衰敗期表達(dá)量基本一致，而在盛開期有明顯的下降，約為其他3個時期表達(dá)量的3/5(圖4)。在‘西伯利亞’百合的9個不同組織器官中，表達(dá)情況也存在較大差異。內(nèi)瓣和葉片中LsAOC基因的表達(dá)量均高于其他組織，子房和外瓣中的表達(dá)量基本一致，約為內(nèi)瓣的2/3?；ㄖ⒒ńz和花藥的表達(dá)處于同一水平上，根中的表達(dá)量最低，約為內(nèi)瓣的17%(圖4)。

圖2 ‘西伯利亞’百合LsAOC基因編碼的氨基酸序列與其他植物AOC氨基酸序列的同源性比對Fig.2 The homology of LsAOC coding protein between Lilium ‘Siberia’ and other plants

圖3 LsAOC基因編碼蛋白三級結(jié)構(gòu)預(yù)測Fig.3 Prediction of tertiary structure of LsAOC coding protein

3 討 論

丙二烯氧化物環(huán)化酶可以將經(jīng)丙二烯氧化合酶催化得到的不穩(wěn)定12，13-EOT重新排列，形成外消旋的12-OPDA。因為只有順式異構(gòu)體cis-(+)-12-O-OPDA才能進(jìn)一步轉(zhuǎn)化形成天然的茉莉酸，所以AOC基因的作用至關(guān)作用。目前AOC基因已在擬南芥 (Arabidopsisthaliana,AtAOC)、白木香(Aquilariasinensis,AsAOC)、蕙蘭(CymbidiumfaberiRolfe,CfAOC)、大豆(Glycinemax,GmAOC)、金魚草(Antirrhinummajus,AmAOC)等多種植物中克隆獲得。

圖4 不同花期和不同組織中的LsAOC基因的表達(dá)水平Fig.4 The LsAOC expression levelsat different flowering stages，in different tissues

本研究使用RACE法在‘西伯利亞’百合中克隆得到了LsAOC基因全長，得知LsAOC基因CDS全長741 bp，編碼246個氨基酸殘基，相對分子質(zhì)量Mw=27.52 kD，呈堿性且不穩(wěn)定，親水性好，從屬Allene_ox_cyc超基因家族。其蛋白序列與其他百合品種麝香百合和岷江百合極為相似。

‘西伯利亞’百合LsAOC基因在不同花期和不同組織部位中的表達(dá)呈現(xiàn)出一定的規(guī)律。首先，LsAOC基因在花蕾期、半開期和衰敗期表達(dá)量基本一致，高于盛開期。在金魚草中，AmAOC基因與本研究結(jié)果相似，相對表達(dá)量亦在盛花期最低，敗花期又升高[6]。由此分析，AOC基因可能在花朵發(fā)育前期發(fā)揮作用，通過調(diào)節(jié)JA合成調(diào)控植物生長。而AOC基因作為JA合成途徑關(guān)鍵基因，衰敗期LsAOC基因相對表達(dá)量的升高可能是與衰敗期植物生長類激素的累積有關(guān)，因為JAs信號參與了植物的發(fā)育與代謝過程。在九個不同組織器官中，表達(dá)情況也存在較大差異。內(nèi)瓣和葉片相對表達(dá)量最高，其次是子房和外瓣，根的相對表達(dá)量則最低。內(nèi)瓣和葉片的相對表達(dá)量顯著高于其他組織，與周銀在蕙蘭不同組織中測定CfAOC基因相對表達(dá)量結(jié)果一致[7]。此外AOC基因在不同的物種、不同的AOC基因間存在一定的表達(dá)差異。枸杞AOC基因在花和莖中相對表達(dá)量較高，在葉和根中相對低[8]。在白香木中，AOC基因在莖中表達(dá)量最高, 根與莖尖次之, 葉中表達(dá)量最低[9]。在大麥中AOC表達(dá)在葉基，盾片節(jié)點和根尖相對較高[10]。吳倩在大豆AOC家族中對6個基因進(jìn)行了組織特異性檢測，發(fā)現(xiàn)GmAOC2和GmAOC5分別在根和莖中表達(dá)量較高，而GmAOC3則在葉片中表現(xiàn)突出，還有兩個基因在所有組織中表達(dá)均很微弱[11]。不同植物AOC基因在不同組織中相對表達(dá)量的高低存在差異，可能是由于JAs的合成調(diào)控方式在不同物種中各不相同，尤其在單子葉植物和雙子葉植物之間，這種差異存在著明顯的不同[10]。

丙二烯氧化物環(huán)化酶是JA合成代謝途徑中的重要限速酶，調(diào)控著植物的生命活動進(jìn)程，具有研究價值和應(yīng)用前景，但AOC基因有關(guān)花香釋放的研究成果并不充分，缺少更多試驗數(shù)據(jù)支撐，因此還有需要進(jìn)一步深入探究。本研究結(jié)果對LsAOC基因在‘西伯利亞’百合中的表達(dá)提供了數(shù)據(jù)及理論基礎(chǔ)，具體應(yīng)用方向還需要進(jìn)一步探索。