馬伯寧,韋航濤，劉 佳，項 晨，楊明峰

(北京農(nóng)學院 生物與資源環(huán)境學院/農(nóng)業(yè)部華北都市農(nóng)業(yè)重點實驗室，北京 102206)

白藜蘆醇(Resveratrol)是一種廣泛存在于葡萄、虎杖等植物或果實當中的二苯乙烯類多酚化合物，難溶于水，易溶于乙醇等極性溶劑[1]。自1940年日本學者從毛葉黎蘆根部分離得到白藜蘆醇開始[2]，發(fā)現(xiàn)它不但是一種植保素，而且有保護心血管、抗腫瘤、抗氧化等作用[3-4]。

目前生產(chǎn)白藜蘆醇的主要途徑是通過生物系統(tǒng)表達、化學合成或從天然植物材料中提取[5]。生物系統(tǒng)表達法和天然植物材料提取法產(chǎn)量相對較低，主要是受到生物量和提取工藝的限制?；瘜W方法合成此類天然產(chǎn)物雖產(chǎn)量高，但是合成過程中會引入有害化學物質(zhì)[5]。

天然植物材料中的白藜蘆醇常用輔助溶劑提取法獲得。張煥麗等采用超聲波輔助溶劑提取法，從巨峰葡萄皮中提取白藜蘆醇，但是溶劑提取和超聲輔助條件因植物種類不同而異[6]。陶志杰等利用酶解輔助和乙醇提取花生芽莖白藜蘆醇，分析了酶用量、酶解時間、酶解溫度、酶解pH值等因素對提取效率的影響，發(fā)現(xiàn)酶解輔助提高了1.8倍白藜蘆醇提取量，但酶解時間過久反而導致提取量下降[7]。

萊茵衣藻(Chlamydomonasreinhardtii)是一種單細胞藻類，具有培養(yǎng)條件簡單、生長迅速、光合效率高等特點，常在植物代謝研究時作為模式材料使用[8-9]。本研究旨在探索一種從萊茵衣藻中提取白藜蘆醇的有效方法。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

植物材料為能夠積累白藜蘆醇的轉(zhuǎn)基因萊茵衣藻[10]。

1.2 試驗方法

1.2.1 萊茵衣藻的培養(yǎng) 使用TAP培養(yǎng)基對萊茵衣藻進行培養(yǎng)。TAP培養(yǎng)基：25 mL/L TAP鹽、2.42 g/L Tris、1 mL/L磷酸緩沖液(pH=5.0)、1 mL/L精氨酸、1 mL/L微量元素，加去離子水定容后，用冰醋酸將pH調(diào)至6.0左右。萊茵衣藻在溫度為25 ℃、光照強度為30 μmol/m2·s、光周期 16 h/8 h(光/暗)的條件下在TAP培養(yǎng)基中培養(yǎng)，每7 d繼代1次。

1.2.2 白藜蘆醇的提取 衣藻藻液4 ℃下8 000r/min離心5 min，收集1 g藻體備用。在pH=6.0左右的條件下，進行5組試驗。每組中加入相同量的纖維素酶，并分別進行3、6、9、12 h的酶解。酶解后用200 mL體積分數(shù)為60 %的甲醇作為提取劑在60 ℃條件下提取6 h。接著進行減壓抽濾并在4 ℃、800 r/min條件下離心5 min。吸取適量上清到2 mL離心管中并稀釋，用0.22 μm的濾膜過濾、超聲除氣泡后，使用高效液相色譜法分析白藜蘆醇含量。第二組對照試驗用以上試驗方法測定體積分數(shù)為40%、50%、70%的甲醇對白藜蘆醇提取量的影響。第三組試驗在其他條件為預(yù)設(shè)值時，測定提取溫度為40、50、70 ℃白藜蘆醇提取量。第四組按照同樣的方法測定提取時間3、9、12 h時的白藜蘆醇提取濃度。最后按照以上分析得到的最佳方案進行兩組試驗：對照組不添加底物，試驗組加入一定量的底物肉桂酸，以測定底物對萊茵衣藻中白藜蘆醇提取率的影響。

1.2.3 高效液相色譜法測定白藜蘆醇產(chǎn)量 使用Waters 1525高效液相色譜儀，并使用Angilent ZORBAX SB-C18 250 mm反相色譜柱進行檢測，柱溫設(shè)定25.0 ℃。高效液相色譜方法：流速0.8 mL/min，流動相為甲醇(A)和水(B)。使用濃度為10%～70%的甲醇梯度洗脫30 min，接著保持甲醇濃度70 %洗脫10 min。白藜蘆醇檢測波長為305.6 nm。 白藜蘆醇標品配制成100 μg/mL的母液，然后稀釋成5個濃度梯度：2.5、5、12.5、25、50 μg/mL，過濾分裝后進行超聲除氣泡并各取10 μL依次進樣，繪制標準曲線。根據(jù)孫同天的N+(N-1)規(guī)則進行試驗設(shè)計[11]。共有4個因素，分別是：酶解時間、甲醇體積分數(shù)、提取溫度和提取時間。每個因素分別進行了4個水平的檢測。試驗指標定為白藜蘆醇提取濃度。通過查閱文獻[12]，暫定本試驗最佳的提取方案為：取一定量的萊茵衣藻進行9 h酶解后超聲萃取30 min，接著用60%的甲醇溶液在60 ℃條件下提取6 h(表1)。

表1 試驗結(jié)果表Tab.1 Experimental results

注: ±表示暫定的最佳試驗方案；DW 表示干重

Note：± indicates the provisional best protocol；DW indicates dry weight

2 結(jié)果與分析

2.1 白藜蘆醇標準曲線的繪制

通過高效液相色譜法檢測配制的白藜蘆醇標品，其質(zhì)量濃度為2.5～100 μg/mL，記錄白藜蘆醇質(zhì)量濃度與檢測峰面積的數(shù)據(jù)，并繪制標準曲線，得到相關(guān)性方程：y=666 50x-439 16,R2=0.999 5。公式中y為峰面積，x為白藜蘆醇質(zhì)量濃度(μg/mL)，由此公式可以將液相色譜中的峰面積數(shù)據(jù)轉(zhuǎn)化為白藜蘆醇質(zhì)量濃度。白藜蘆醇的出峰時間約為12 min(圖1)。

圖1 白藜蘆醇標品(100 μg/mL)高效液相色譜結(jié)果Fig.1 High performance liquid chromatography results of standard resveratrol samples (100 μg/mL)

2.2 酶解時間對萊茵衣藻中白藜蘆醇提取率的影響

在其他提取條件一定的情況下，考察提取反應(yīng)中酶解時間對白藜蘆醇產(chǎn)量的影響，在第12 min時出現(xiàn)產(chǎn)物峰(圖2-A,B,C,D)。

A.酶解時間3 h；B.酶解時間6 h；C.酶解時間9 h；D.酶解時間12 h；E不同酶解時間時的白藜蘆醇提取濃度圖2 酶解時間高效液相色譜結(jié)果A,time of enzymatic hydrolysis for 3 hours; B,time of enzymatic hydrolysis for 6 hours; C,time of enzymatic hydrolysis for 9 hours; D,time of enzymatic hydrolysis for 12 hours；E,concentrations of resveratrol at different enzymatic hydrolysis timeFig.2 High performance liquid chromatography results of various enzymatic hydrolysis time

在其他條件一定的情況下，酶解時間9 h時，提取的產(chǎn)物濃度最高，白藜蘆醇濃度為8.57 μg/g DW (圖2-E)。提取時間在3～9 h時，產(chǎn)物濃度隨提取時間增加而增加，并且在9 h左右，產(chǎn)物濃度達到最大值，之后隨時間增長而下降。由此可以看出在酶解時間為9 h左右時，萊茵衣藻細胞壁完全被酶解，細胞內(nèi)的產(chǎn)物完全釋放，白藜蘆醇的提取量達到最大值。有研究表明，白藜蘆醇在日光照射一定時間后，306 nm處吸光值下降[13]。本試驗中萊茵衣藻的酶解反應(yīng)在室內(nèi)無日光直射的條件下進行。隨著酶解時間的增長，萊茵衣藻細胞壁被酶解，白藜蘆醇從細胞內(nèi)釋放出來所以檢測到白藜蘆醇提取量逐漸增加。但是9 h后細胞內(nèi)白藜蘆醇全部酶解到反應(yīng)液中，在室內(nèi)光照條件下白藜蘆醇也會發(fā)生變化，所以導致306 nm處吸光度值下降，提取濃度降低。由以上分析最終選擇9 h作為酶解時間的條件。

2.3 甲醇體積分數(shù)對萊茵衣藻中白藜蘆醇提取率的影響

在其他提取條件一定的情況下，考察提取介質(zhì)中甲醇體積分數(shù)對白藜蘆醇產(chǎn)量的影響。經(jīng)過高效液相色譜檢測發(fā)現(xiàn)，甲醇體積分數(shù)60%時提取的產(chǎn)物濃度達到最大值，306 nm處峰面積最大，白藜蘆醇濃度為8.57 μg/g (圖3-A)。因此選擇使用甲醇體積分數(shù)為60%作為該項因素的最佳濃度。

A.甲醇體積分數(shù)；B.提取溫度；C.提取時間；D.是否添加底物，試驗組別中1、3、5、7為對照組，不添加底物；2、4、6、8為試驗組，添加10 μg/mL肉桂酸作為底物圖3 不同條件下的白藜蘆醇提取濃度A, methanol concentrations; B,extraction temperatures; C, extraction time; D, with and without substrate; the control group 1,3,5,and 7 without substrate; the experimental groups 2,4,6,and 8 with 10 μg/mL cinnamic acid as a substrateFig.3 Concentration of resveratrol with different extraction conditions

2.4 提取溫度對萊茵衣藻中白藜蘆醇提取率的影響

在其他提取條件一定的情況下，考察提取溫度對白藜蘆醇產(chǎn)量的影響。結(jié)果發(fā)現(xiàn)在60 ℃溫度條件下，產(chǎn)物提取量最大，可達8.57 μg/g DW(圖3-B)。隨著提取溫度的提升，產(chǎn)物濃度降低。由此可知雖然溫度提升時，白藜蘆醇溶解度增加，但是溫度過高白藜蘆醇會因為自身的熱不穩(wěn)定性導致提取濃度降低[13]，所以提取溫度60 ℃為宜。

2.5 提取時間對萊茵衣藻中白藜蘆醇提取率的影響

在其他提取條件一定的情況下，考察提取時間對白藜蘆醇產(chǎn)量的影響。經(jīng)過HPLC檢測后發(fā)現(xiàn)提取時間為9 h時，得到的白藜蘆醇產(chǎn)量最高，最大值為8.95 μg/g DW (圖3-C)。此后增加提取時間卻發(fā)現(xiàn)白藜蘆醇產(chǎn)量并沒有太大變化。分析可能是由于提取時間為9 h時產(chǎn)物被完全提取出來，所以增加提取時間不會導致產(chǎn)物的量發(fā)生明顯變化。

2.6 肉桂酸對萊茵衣藻中白藜蘆醇產(chǎn)量的影響

對在其他條件一定的情況下進行兩組試驗，分別為對照組和加入底物試驗組。由圖中可以看出編號為2、4、6、8的添加底物試驗組中白藜蘆醇提取量高于其他的對照組，其提取濃度最大值為15.31 μg/g DW (圖3-D)。

白藜蘆醇在植物體內(nèi)由苯丙烷代謝途徑合成，其中肉桂酸是合成白藜蘆醇的重要底物。萊茵衣藻能通過自身代謝反應(yīng)得到的底物肉桂酸產(chǎn)量不多。當存在白藜蘆醇合酶的條件下，白藜蘆醇合酶要利用該底物，可能存在對底物的競爭從而導致底物不足的情況。因此為了增加白藜蘆醇產(chǎn)量，加入一定量的底物肉桂酸是一種有效的方法。

3 討 論

自從1940年首次從毛葉藜蘆的根部分離得到了白藜蘆醇開始，揭開了人們對這個植物次生代謝產(chǎn)物的探究。1963年Nonomura等認為某些草藥中治療炎癥和心血管相關(guān)疾病的有效成分可能是白藜蘆醇[14]。1976年又發(fā)現(xiàn)，白藜蘆醇在植物受到機械損傷或紫外線照射時表達量會大量增加，因此被稱為植保素[15]。

目前己經(jīng)在21科、31屬的72種植物中發(fā)現(xiàn)產(chǎn)生了白藜蘆醇，而這些植物多為常見的藥用植物[16]。由于白藜蘆醇是植物次生代謝產(chǎn)物，目前主要是從葡萄籽、葡萄皮、中藥虎杖中提取白藜蘆醇，通過不同的方法從植物中提取白藜蘆醇也成了當下生物合成白藜蘆醇關(guān)注的熱點。前人文獻報道了溶劑提取法、酶法提取、微波萃取、超臨界CO2萃取、超聲波提取等方法提取白藜蘆醇。生物合成法獲得白藜蘆醇的主要制約因素是生物量和提取方法。本試驗使用的轉(zhuǎn)基因萊茵衣藻能夠代謝產(chǎn)生白藜蘆醇，并且萊茵衣藻具有生長繁殖快、周期短、生物量大等優(yōu)點，所以通過轉(zhuǎn)基因衣藻可以大量并且快速產(chǎn)生白藜蘆醇。

在提取方法上，本研究參考已報道的試驗方法，考慮到試驗可行性、簡便程度、提取效率等因素，根據(jù)白藜蘆醇提取產(chǎn)量優(yōu)化提取方法 (表1)。編號為12的試驗組得到的白藜蘆醇濃度最高，其酶解時間、甲醇體積分數(shù)、提取溫度三個因素與預(yù)期最佳水平結(jié)果一致，因此這三個因素的水平確定為預(yù)設(shè)值。提取時間的最佳水平為9 h并非之前預(yù)設(shè)的6 h，但提取時間為9 h時得到的白藜蘆醇濃度為8.95 μg/g DW，與6 h提取得到的白藜蘆醇濃度8.57 μg/g DW并沒有明顯的增加。本著節(jié)約試驗時間的原則，選定6 h作為提取時間的條件。

綜合試驗結(jié)果，針對轉(zhuǎn)基因萊茵衣藻探索出了一套完整的白藜蘆醇提取方法：收集藻液進行9 h酶解處理后，超聲萃取30 min，使用60%甲醇溶液作為提取劑，在60 ℃條件下提取6 h，從萊茵衣藻中提取出的產(chǎn)物白藜蘆醇的量為8.57 μg/g DW。添加終濃度為10 μg/mL肉桂酸作為底物，則提取白藜蘆醇的產(chǎn)量可達15.31 μg/g DW?？傊?，本研究優(yōu)化得到了一種從藻類植物中提取白藜蘆醇相對高效的方法，為研究轉(zhuǎn)基因萊茵衣藻的白藜蘆醇相關(guān)代謝提供了基礎(chǔ)，也為轉(zhuǎn)基因萊茵衣藻中提取白藜蘆醇提供了一種有效的方法。