邢晏,馮長煥,杜利君

(1.西華師范大學 數(shù)學與信息學院,四川 南充,637000；2.南充市中心醫(yī)院 醫(yī)學檢驗科,四川 南充,637000)

亞甲基四氫葉酸還原酶(methylenetetrahydrofolate reductase，MTHFR)是細胞內(nèi)調(diào)節(jié)葉酸和蛋氨酸代謝的一種重要酶，可催化體內(nèi)5，10-亞甲基四氫葉酸生成5-甲基四氫葉酸的還原反應，是同型半胱氨酸(Hcy)代謝反應的一種關鍵酶[1-3]。Hcy水平升高與神經(jīng)管缺陷、唇腭裂、先天性心臟病等出生缺陷及復發(fā)性流產(chǎn)、妊娠期高血壓疾病等孕期疾病密切相關，Hcy 水平升高主要是遺傳因素和營養(yǎng)因素相互作用的結(jié)果[4]。研究表明，母體內(nèi)發(fā)生如流產(chǎn)、早產(chǎn)、死胎、胎兒畸形以及先天性出生缺陷等不良妊娠，Hcy水平增高便是其中的一個高危因素[5-7]。MTHFR有15種點突變類型，其中既常見又重要的為677 C/T基因突變，677 C/T基因突變是第677位堿基C由堿基T取代，包括純合野生基因型CC、突變基因型TT及雜合基因型CT三大類型。它能使MTHFR酶活性降低及耐熱性下降，引起高同型半胱氨酸血癥、核酸合成和甲基化異常，使葉酸整體代謝受到影響，進而導致各種疾病發(fā)生。葉酸屬于B族維生素，人體是無法依靠自身合成的。它是體內(nèi)極為重要的甲基供體，參與DNA 合成與修復，從而維持人體細胞內(nèi)正常甲基化及基因組的穩(wěn)定性?；蚨鄳B(tài)性會影響體內(nèi)葉酸及 Hcy 水平，與神經(jīng)管畸形、復發(fā)性流產(chǎn)、妊娠期高血壓等疾病發(fā)生密切相關，嚴重影響母嬰的健康安全[8]。如果在孕前或懷孕早期開始補充適量葉酸，則神經(jīng)管缺陷(neural tube defects,NTD)發(fā)病率降低70%[9]?？梢姡梭w的葉酸水平與MTHFR多態(tài)性密切相關。因此，本文旨在通過對南充地區(qū)女性人群進行MTHFR基因多態(tài)性分析，為本地女性特別是孕婦人群降低新生兒出生缺陷等循證醫(yī)學提供一定的科學依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

選取 2014 年1月～ 2018年12月來自南充地區(qū)醫(yī)院檢測MTHFR基因多態(tài)性的女性患者。檢測樣本為EDTA抗凝全血，室溫放置不超過4 h及未反復凍融，采用泡沫箱加冰袋密封運輸。排除樣本收集、處理、運送等不符合要求外共收集到有效樣本3 980份。樣本患者主要來自閬中縣、南部縣、西充縣、蓬安縣、營山縣、儀隴縣及順慶、高坪、嘉陵市轄三區(qū)。年齡14～49歲，平均年齡(28.55±5.45)歲。本研究采取的方法及過程均經(jīng)本院倫理委員會批準及同意。

1.2 儀器與試劑

儀器：德國Roche(羅氏)公司出產(chǎn)的Roche Applied Science Light Cycler 480熒光PCR儀。

試劑：深圳泰樂德醫(yī)療有限公司提供的MTHFR基因 677 C/T 檢測試劑盒(PCR-熒光探針法)。其主要組成成分包括R1沉淀液、R2洗液、R3裂解液、R4穩(wěn)定液、R5 PCR混合液、R6探針及R7、R8陽陰性對照。

1.3 檢測方法

PCR-熒光探針法主要步驟：第一步，前準備區(qū)試劑預處理。使用時將R1～R4放置室溫充分融化，R5～R8置于4 ℃充分融化。第二步，樣本處理區(qū)樣本處理。樣本置于室溫充分融化。(1)取25 μL樣本于1.5 mL離心管內(nèi)，加入R1 150 μL振蕩、混勻，室溫放置5 min。再14 000 r/min離心2 min,棄上清，保留沉淀。(2)在上述離心管內(nèi)加入R2 150 μL振蕩至沉淀懸浮，再14 000 r/min離心1 min，棄上清，保留沉淀。(3)加入R3 50 μL振蕩至沉淀脫離管底，65 ℃水浴5 min。(4)加入R4 15 μL振蕩混勻，離心讓溶液集中管底。第三步，試劑配制及樣本處理區(qū)加樣。第四步，PCR擴增區(qū)擴增檢測。熒光信號的收集定為FAM及VIC，數(shù)據(jù)采集為60 ℃。

1.4 統(tǒng)計學處理

通過SPSS 19.0 軟件進行統(tǒng)計處理。計量資料采用t檢驗，計數(shù)資料采用χ2檢驗，以P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 MTHFR C677T 基因多態(tài)性分布

在3 980例女性樣本中，MTHFR C677T 基因分型中，含突變基因T的CT型與TT型為59.15%，明顯高于純合型CC 40.85%，具體見表1。

表1 南充地區(qū)女性MTHFR C677T 基因型分布Table 1 Distribution of MTHFR C677T genotype in female population in Nanchong

2.2 不同年齡組MTHFR基因多態(tài)性頻率

針對樣本研究人群，根據(jù)年齡極差分成6組，見表2。總體CT型、CC型百分比較高，TT相對偏低。CC型與年齡無明顯差異，而CT型在35歲以上有明顯偏低趨勢,TT型基本偏低，而且呈現(xiàn)“U”狀，降至31～35歲逐漸回升。見圖1。

表2 南充地區(qū)不同年齡段女性C677T基因分型比率Table 2 Proportion of C677T genotyping in women of different ages in Nanchong

圖1 各年齡段基因多態(tài)性分布Fig.1 Distribution of gene polymorphisms in all age groups

2.3 不同地區(qū)女性 MTHFR基因多態(tài)性分布

結(jié)合Hardy-Weinberg平衡分析，MTHFR 677 C/T 基因多態(tài)性檢驗結(jié)果符合 Hardy-Weinberg 遺傳平衡，樣本具有本區(qū)域群體代表性。南充地區(qū)女性677 C/T 基因多態(tài)性與其它幾個地區(qū)差異情況具體見表3、圖2。

表3 不同地區(qū)MTHFR基因分型分布情況Table 3 Distribution of MTHFR genotypes in different regions

注：參照童郁等[8]*研究相關內(nèi)容

圖2 各地區(qū)基因分型頻率Fig.2 genotyping frequency by region

3 討論

GOYETTE等在1994年將定位于染色體lp36.3的MTHFR基因克隆，隨后，引起人們對MTHFR基因多態(tài)性研究的廣泛興趣。MTHFR 基因的不同突變類型對其酶活性和熱穩(wěn)定性都會產(chǎn)生不同程度的影響，其中 677 C/T 基因位點突變是MTHFR 基因第5個外顯子上發(fā)生的一種錯義突變[10]。目前，國內(nèi)外研究最多的就是677 C/T 和 1 298 A/C，677 C/T位點多態(tài)性分為CC型、CT型和TT型，與葉酸、Hcy代謝及多種疾病的關系更是近年研究熱點。

在3 980例樣本女性MTHFR基因分型中，CT型與TT型占59.15%(CT型45.18%，TT型13.97%)，遠高于CC型40.85%，可見突變基因T具有明顯態(tài)勢。通過10個不同地區(qū)人群分析，發(fā)現(xiàn)C677T 基因多態(tài)性具有地區(qū)差異性。各地區(qū)CT型頻率基本居高，CC型次之，而TT型最低，其中瓊海CC型最高，為61.92%，TT型最低，為6.14%；南充地區(qū)女性 MTHFR C677T 基因分型頻率與溫州、煙臺、十堰、武漢、瓊海、鎮(zhèn)江等地區(qū)比較差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，而與德陽、昆明、吉林等地區(qū)比較差異無統(tǒng)計學意義(P<0.05)。就地理位置而言，677 C/T 等位基因頻率呈現(xiàn)北方高南方低基本趨勢，與童郁等[8]研究結(jié)果一致。從樣本不同年齡組分析，MTHFR基因分型無明顯差異，總體上CC型與CT型偏高，而TT型偏低。MTHFR 677 C/T基因多態(tài)性和突變頻率在不同國家、不同種族、同一國家的不同地區(qū)或不同民族，其分布存在顯著差異，這種差異會造成人群對疾病的易感性不同[11]。677 C/T基因多態(tài)性與多種類型腫瘤的風險相關[12-13]。因此，女性患者特別是孕婦要高度重視677 C/T 基因多態(tài)性檢測項目。

ZACHO等[14]分析指出MTHFR 677 C/T 基因多態(tài)性可能增加胃癌發(fā)病風險。在我國，MTHFR 677 C/T基因多態(tài)性與胃癌的發(fā)生密切相關[15]。本研究樣本中35歲以上女性CT型整體呈下降趨勢，但在此年齡段的131例被臨床確診為不同程度的胃病患者高達74例，結(jié)果發(fā)現(xiàn)CT型相對偏多，年齡越大，胃病越嚴重，而且TT型患者所占比重偏大。此外，16例TT型患者中有4例為冠心病，其中并伴有不同程度的心腦血管疾病。這與何喜偉等[16]研究結(jié)果一致。同時，TT型與患者心腦血管疾病關系也十分密切[17]。在精神內(nèi)科確診為認知功能障礙的13例患者中有9例檢測為TT型患者，這與FORD等[18]結(jié)論相同。

國內(nèi)外關于MTHFR 677 C/T 基因多態(tài)性與高血壓的關系報道結(jié)果不盡一致，本樣本中高血壓30歲以上19例(其中CT型6例，TT型2例)，30歲以下2例(CC型1例，CT型1例)，不能體現(xiàn)其強弱關聯(lián)性。在樣本當中，絕大多數(shù)來自婦產(chǎn)科孕婦或待孕患者，特別是21～25歲年輕女性人群CT型、TT型所占比例居高(分別為46.3%、14.5%)，結(jié)合臨床診斷反饋信息，很少有高血壓、冠心病、嚴重胃病及其他高風險相關疾病，主要存在葉酸代謝能力偏低。

MTHFR基因多態(tài)性同復發(fā)性流產(chǎn)緊密相關，其中基因位點C→T突變可造成孕婦的血Hcy水平上升，胎兒發(fā)育障礙，引起流產(chǎn)風險上升，根據(jù)臨床可通過給予孕婦口服葉酸從而降低流產(chǎn)風險[19]。本地女性在21～35歲年齡段均宜生育，在30～35歲最宜(CC型43.0%，TT型11.7%)，這與醫(yī)學育齡從20～30歲最佳有一定差異但并不矛盾，因為23～30歲期間女性卵子相對質(zhì)量較高，胎兒生長發(fā)育好，其早產(chǎn)、癡呆兒、畸形兒發(fā)生率較低。

由于樣本均來自南充地區(qū)漢族女性，故沒有進行C677T基因多態(tài)性的性別分布差異及民族差異分析，以后可進一步豐富資料結(jié)合臨床進行全面深入探究。

綜上所述，南充地區(qū)女性人群亞甲基四氫葉酸還原酶C677T基因多態(tài)性分布與年齡及地域具有一定的相關性，同樣與一些高危疾病也具有風險關聯(lián)。因此，對于不同地區(qū)人群的遺傳差異，臨床檢查與孕保措施要因地制宜、因人而異。進行 MTHFR基因多態(tài)性篩查，對突變基因型攜帶患者進行早期干預，為臨床提供一定的診療依據(jù)，特別是積極預防孕婦妊娠相關疾病具有重要意義。