王麟，鄭敏,胡鵬，胡雪竹，潘躍承，劉翔

(1.成都市郫都區(qū)中醫(yī)醫(yī)院,四川 成都,611730；2.成都彭州市天恩醫(yī)院門診部，四川 成都,611930)

目前全球約有20億人曾感染過(guò)乙型肝炎病毒(hepatitis B virus，HBV)，其中有超過(guò)3.5億人最終成為慢性感染者，每年約有60萬(wàn)人死于慢性或急性乙型肝炎[1]。HBV屬嗜肝DNA病毒科(hepadnaviridae)，為部分閉合雙鏈環(huán)狀DNA，基因組全長(zhǎng)約3.2 kb。HBV的基因分型主要根據(jù)全基因組核苷酸序列的差異性進(jìn)行，即HBV全基因核苷酸序列異源性≥8%或者S基因區(qū)核苷酸序列異源性≥4%可定為不同的基因型，目前已定義出了A～J 10種基因型，分布在不同地區(qū)，存在地域差異[2]。據(jù)報(bào)道，HBV在復(fù)制過(guò)程中會(huì)產(chǎn)生錯(cuò)誤的堿基配對(duì)致使核苷酸排列混亂，出現(xiàn)不同的基因型[3]。在長(zhǎng)期和不規(guī)范用藥時(shí)由于HBV在Pol/RT區(qū)缺乏逆轉(zhuǎn)錄酶校正功能，使HBV極易發(fā)生基因突變從而產(chǎn)生耐藥情況。不同的流行病學(xué)特點(diǎn)與病毒的表達(dá)方式、致病性與藥物的敏感性都有一定的相關(guān)性[4]。因此，HBV基因分型和耐藥突變位點(diǎn)檢測(cè)對(duì)乙型肝炎抗病毒治療具有重要的指導(dǎo)意義。但四川西部地區(qū)有關(guān)這方面的研究資料不多，故本研究對(duì)四川成都郫都地區(qū)HBV感染者的HBV基因分型和耐藥突變位點(diǎn)進(jìn)行檢測(cè)、分析，旨在為臨床抗病毒治療HBV感染提供科學(xué)依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取2018年1月至2019年3月來(lái)自四川省成都市郫都區(qū)中醫(yī)醫(yī)院門診及住院收治的169例慢性HBV感染者，診斷標(biāo)準(zhǔn)采用2010年《慢性乙型肝炎防治指南》。本研究已獲得患者知情同意并經(jīng)本院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。

1.2 HBV基因分型及耐藥基因檢測(cè)

對(duì)每份樣本吸取5 μL血清+5 μL DNA裂解液，室溫10 min，在CFX Connect Real-Time System儀器上進(jìn)行DNA擴(kuò)增，然后再將擴(kuò)增產(chǎn)物在Pol/RT區(qū)進(jìn)行測(cè)序。首先，取產(chǎn)物3 μL+2 μL Exo-SAP酶混合物37 ℃ 60 min、80 ℃ 15 min進(jìn)行產(chǎn)物裂解，再把聚合酶鏈反應(yīng)(polymerase chain reaction,PCR)酶解產(chǎn)物1 μL+1 μL測(cè)序液通過(guò)25個(gè)循環(huán)96 ℃ 1 min、96 ℃ 10 s、50 ℃ 5 s、60 ℃ 4 min進(jìn)行PCR測(cè)序，最后純化測(cè)序產(chǎn)物(采用醋酸鈉-乙醇法)。將擴(kuò)增后的HBV DNA P基因片段通過(guò)堿基序列分析法直接測(cè)序后，再利用Chromas軟件進(jìn)行DNA峰形圖的查看與編輯，將結(jié)果與美國(guó)國(guó)立生物技術(shù)信息中心(National Center of Biotechnology Information，NCBI)提供的基因庫(kù)網(wǎng)頁(yè)分型工具Genotyping進(jìn)行比對(duì)，該工具可將測(cè)序結(jié)果與HBV各型參考序列進(jìn)行比對(duì)，并通過(guò)比對(duì)Pol/RT區(qū)變異位點(diǎn)的檢測(cè)可判斷HBV有無(wú)耐藥性。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

所有數(shù)據(jù)均采用SPSS 21.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)處理。HBV不同基因型在性別、年齡、不同突變位點(diǎn)和不同藥物間的分布差異采用列聯(lián)表資料的χ2檢驗(yàn)、率和構(gòu)成比的比較采用χ2檢驗(yàn)，以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 HBV基因型分布特征

2.1.1 169例慢性HBV感染者HBV基因分型

檢測(cè)結(jié)果顯示，以B型和C型為主，其二者百分比均高于D型和BC型，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.001)，詳見(jiàn)表1。

表1 169例慢性HBV感染者HBV基因分型情況Table 1 HBV genotyping in 169 patients with chronic HBV infection

注：基因型B與BC和D組(χ2=112.000，P<0.001),基因型C與BC和D組(χ2=60.000，P<0.001)

2.1.2 HBV基因型在不同性別間及不同年齡間的分布特征

研究結(jié)果表明，HBV基因型在不同性別間及不同年齡間的分布差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=1.103，P=0.776；χ2=12.521，P=0.185)。在不同年齡間的分布以B型為主，構(gòu)成比>50%；年齡小于20歲的人群中以B型為主，大于20歲的人群中則以B、C型為主，詳見(jiàn)表2。

表2 HBV基因型在不同性別間及不同年齡間的分布特征Table 2 Distribution characteristics of HBV genotype among different genders and ages [例(%)]

2.2 HBV基因突變位點(diǎn)分布特征

研究數(shù)據(jù)顯示，四川成都郫都地區(qū)HBV患者人群中Pol/RT區(qū)耐藥位點(diǎn)無(wú)突變的例數(shù)有86例，占50.9%；發(fā)生位點(diǎn)突變的例數(shù)有83例，其中單位點(diǎn)突變?yōu)?0例，占23.7%，雙位點(diǎn)突變?yōu)?9例，占17.1%，三位點(diǎn)突變?yōu)?2例，占7.1%，四位點(diǎn)突變?yōu)?例，占1.2%。研究結(jié)果表明，HBV基因型在多重位點(diǎn)突變率比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=55.055，P<0.001)，其中1～2個(gè)位點(diǎn)突變者以B型感染為主，構(gòu)成比>60%，3～4個(gè)位點(diǎn)突變者以C型感染為主，構(gòu)成比分別為58.4%和50.0%,詳見(jiàn)表3。

表3 HBV基因突變位點(diǎn)分布特征Table 3 Distribution characteristics of HBV gene mutation sites [例(%)]

2.3 HBV基因突變Pol/RT區(qū)耐藥突變模式

對(duì)169例研究對(duì)象中檢測(cè)出在Pol/RT區(qū)發(fā)生位點(diǎn)突變的83例突變者進(jìn)行分析，共檢出142個(gè)突變位點(diǎn)，其中以在M204I/V、L180M位點(diǎn)的突變?yōu)橹?，分別檢出57個(gè)突變和30個(gè)突變，分別占總突變數(shù)的40.1%和21.1%。在15種不同耐藥突變模式的檢出率上比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=395.568，P<0.001)。其中，Pol/RT區(qū)204、180、236、213、207、250、202、215、194位點(diǎn)突變以B型感染為主，構(gòu)成比≥50%，Pol/RT區(qū)181、238、184、173、214、237位點(diǎn)突變以C型感染為主，構(gòu)成比>53%。其中在B型中檢出A194S/T的突變位點(diǎn)1例。詳見(jiàn)表4。

表4 HBV基因突變Pol/RT區(qū)耐藥突變模式Table 4 Drug resistame mutation patterns of HBV gene Pol/RT locus [例(%)]

2.4 HBV基因耐藥情況分析

169例HBV感染者中有141例出現(xiàn)耐藥(占83.4%)，對(duì)這141例患者進(jìn)行了4種臨床常規(guī)核苷酸類似物(nuoleotide analogue,NAs)藥物檢測(cè)。研究結(jié)果表明，拉米夫定(lamivudine，LAM)耐藥為63例，占44.7%；替比夫定(telbivudine，LDT)耐藥為53例，占37.6%；阿德福韋(adefovir，ADV)耐藥為20例，占14.2%；恩替卡韋(entecavir，ETV)耐藥為5例，占3.5%。HBV基因型在這4種抗HBV藥物的耐藥性差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=17.250，P=0.045)，其中，LAM耐藥比例最高，LDT其次，且均以B型患者為主，占基因型的構(gòu)成比分別為58.7%和62.3%。詳見(jiàn)表5。

表5 HBV基因耐藥情況 Table 5 Analysis of HBV genotype resistance [例(%)]

3 討論

目前，已有很多的研究表明不同基因型HBV感染者的臨床表現(xiàn)受病毒多態(tài)性、宿主個(gè)體差異和環(huán)境的共同作用，不同地域、種族、遺傳背景下的人群HBV基因型分布不一致，HBV感染者其病程、抗病毒藥物的治療效果及患者的預(yù)后都與其所感染的HBV基因型相關(guān)[5]。根據(jù)各地區(qū)的型別分布和流行特點(diǎn)，可推斷HBV的傳染源和傳播途徑。我國(guó)漢族人群HBV感染者以B型和C型為主，其中南方以B型為主，北方以C型為主，A型和D型在部分地區(qū)也存在[6]。本研究對(duì)HBV分型采用的堿基序列分析法直接測(cè)序，將基因分型的可靠度和可信度大大提高。結(jié)果顯示，169例四川成都郫都地區(qū)HBV感染者當(dāng)中B型109例，占64.5%；C型57例，占33.7%；D型2例，占1.2%；BC型1例，占0.6%。本地區(qū)基因型以B和C型為主，這與有關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道結(jié)果一致[7]。本研究中檢出2例D型，考慮可能為四川成都郫都地區(qū)人口流動(dòng)較大所致。

本研究分析了不同性別及不同年齡段基因分布情況，差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。但發(fā)現(xiàn)年齡小于20歲的人群中以B型為主，占75.0%；20歲以上的人群中則以B、C型為主。這與有些學(xué)者報(bào)道B型患者隨著年齡增高構(gòu)成比下降，年齡越大C型構(gòu)成比越高的結(jié)論相一致[8-9]。

本研究表明，Pol/RT區(qū)發(fā)生突變的HBV感染患者中的基因型在多重位點(diǎn)突變率比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=55.055，P<0.001)，HBV的RT區(qū)耐藥位點(diǎn)單一位點(diǎn)突變的發(fā)生率最高，為23.7%，雙位點(diǎn)突變其次，為17.1%，在多位點(diǎn)突變中1～2個(gè)位點(diǎn)突變者以B型感染為主，構(gòu)成比>60%，3～4個(gè)位點(diǎn)突變者以C型感染為主，構(gòu)成比分別為58.4%和50.0%，研究結(jié)果提示，B、C型較D和BC型易產(chǎn)生耐藥基因突變，這與基因型突變研究的有關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道結(jié)果一致[10]。

在對(duì)HBV基因突變Pol/RT區(qū)耐藥突變模式檢測(cè)分析中，共檢出142個(gè)突變位點(diǎn)，其中以M204I/V、L180M位點(diǎn)的突變?yōu)橹鳎謩e檢出57個(gè)、30個(gè)突變位點(diǎn)，分別占總突變數(shù)的40.1%和21.1%。HBV基因型在檢出的15種不同耐藥模式的突變率比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=395.568，P<0.001)。其中，Pol/RT區(qū)204、180、236、213、207、250、202、215、194位點(diǎn)突變以B型感染為主，構(gòu)成比均≥50%；Pol/RT區(qū)181、238、184、173、214、237位點(diǎn)突變以C型感染為主，構(gòu)成比均>53%。其中在B型中檢出A194S/T的突變位點(diǎn)1例，該位點(diǎn)被認(rèn)為與富馬酸替諾福韋酯(tenofovir disoproxil fumarate，TDF)的耐藥相關(guān)。

NAs是治療乙型病毒性肝炎的主要藥物，應(yīng)用最為普遍[11]。目前臨床常用的NAs藥物有LAM、ADV、ETV和LDT，它們作用的靶位均在HBV的逆轉(zhuǎn)錄酶(reverse transcriptase，RT)基因，但NAs藥物長(zhǎng)期使用易引起HBV產(chǎn)生耐藥突變，使藥物治療的敏感性降低[12]。本研究169例乙肝患者中對(duì)4種NAs產(chǎn)生耐藥情況分析發(fā)現(xiàn)，有83.4%的患者(141/169)會(huì)出現(xiàn)一種以上的耐藥突變，比國(guó)內(nèi)外HBV的耐藥數(shù)據(jù)(30%～40%)的耐藥現(xiàn)狀更為嚴(yán)峻[13]?？赡苁怯捎贖BV病毒Pol/RT區(qū)逆轉(zhuǎn)錄酶缺乏校正功能，在持久的藥物壓力下HBV突變率較高。對(duì)這141例患者進(jìn)行4種臨床常規(guī)NAs藥物檢測(cè)，結(jié)果顯示，LAM耐藥為63例，占44.7%；LDT耐藥為53例，占37.6%；ADV耐藥為20例，占14.2%；ETV耐藥為5例，占3.5%。HBV基因型在這4種抗HBV藥物的耐藥情況差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=17.250，P=0.045)，其中，LAM耐藥比例最高，LDT其次，且均以B型患者為主，占基因型的構(gòu)成比分別為58.7%和62.3%。說(shuō)明在四川成都郫都地區(qū)HBV感染者中NAs耐藥仍以單一和雙重耐藥為主，并且以LAM和LDT最為顯著。雖然LAM價(jià)格低廉、上市早且使用率高，但耐藥最高，不宜作為抗病毒治療的首選藥物。

通過(guò)對(duì)四川郫都地區(qū)乙肝病毒HBV感染者的基因分型、耐藥突變位點(diǎn)分布和基因耐藥情況的分析，為臨床對(duì)評(píng)估乙肝患者是否需要抗病毒治療和合理用藥提供了科學(xué)依據(jù)。