羅 衛(wèi)，陳 杰，徐 勁，蔡瑞康

白癜風(fēng)是一種皮膚獲得性色素脫失性疾病，其基本病理變化為皮損部位的黑素細(xì)胞數(shù)目的減少或消失，自體黑素細(xì)胞移植是一種有效的治療方法。ReCell技術(shù)是一項(xiàng)源自澳洲的表皮細(xì)胞移植技術(shù)，其原理是通過酶解和物理等作用，將小面積的皮片直接處理成表皮細(xì)胞混懸液，從而開展各項(xiàng)用途的細(xì)胞移植療法。本研究應(yīng)用ReCell技術(shù)將發(fā)皰壁制成表皮細(xì)胞混懸液，將含有黑素細(xì)胞的表皮細(xì)胞混懸液直接種植于白斑皮損創(chuàng)面，觀察和研究移植治療后取得的臨床效果。

1 對(duì)象與方法

1.1 對(duì)象 選擇2015-07至2017-07我中心白癜風(fēng)專科門診確診的白癜風(fēng)患者21例，均為穩(wěn)定期白癜風(fēng)患者；其中男12例，女9例；年齡15～35歲，平均22.30歲；病程1～18年，平均6.58年；共選擇自體表皮移植皮損33塊，其中面部6塊，頸部2塊，上胸8塊，背部3塊，腹部3塊，上肢5塊，下肢6塊；白斑皮損最大面積38.67 cm2，最小為5.47 cm2。患者均簽署知情同意書，本研究經(jīng)醫(yī)院倫理委員會(huì)討論通過。

1.2 方法

1.2.1 選取供皮 按照供皮區(qū)與移植區(qū)1∶2原則，供皮區(qū)選擇皮膚色素正常的非暴露部位(腹部、大腿內(nèi)側(cè))，75%乙醇消毒后，使用加溫負(fù)壓表皮細(xì)胞分離機(jī)(工作負(fù)壓-50 kPa，溫度45 ℃，吸盤孔徑1 cm)，于供皮區(qū)采用負(fù)壓和加溫雙重機(jī)制吸皰30～50 min，使表皮分離產(chǎn)生水皰，沿水皰邊緣將表皮剪下備用。

1.2.2 含黑素細(xì)胞的表皮細(xì)胞混懸液的制備 將取下的皰壁置入ReCell試劑盒中的溫控容器內(nèi)，在37 ℃恒溫下酶解15～20 min，將皰壁放入緩沖液中和，應(yīng)用手術(shù)刀片在皰壁的表皮側(cè)刮取細(xì)胞，形成混懸液，將獲得的混懸液緩慢注入過濾器純化，獲得所需的表皮細(xì)胞混懸液,主要含角質(zhì)形成細(xì)胞和黑素細(xì)胞。

1.2.3 黑素細(xì)胞的鑒定 用倒置顯微鏡觀察培養(yǎng)細(xì)胞形態(tài)。多巴胺染色，將細(xì)胞接種于明膠處理的載玻片上，培養(yǎng)至70%融合，將細(xì)胞用冷甲醇固定，在0.1%左旋多巴磷酸鹽緩沖液(pH 7.4)中， 37 ℃溫育，觀察細(xì)胞顯色程度。

1.2.4 移植治療 白斑區(qū)采用1%利多卡因局部麻醉，用皮膚磨削機(jī)打磨白斑區(qū)表皮至出現(xiàn)針尖樣出血點(diǎn)，將制備好的表皮細(xì)胞混懸液分別噴灑接受種植皮損創(chuàng)面，油紗覆蓋于種植皮損創(chuàng)面，平紗輕加壓包扎，7 d后除去包扎紗布。

1.3 觀察指標(biāo) 觀察皮損移植后復(fù)色情況，根據(jù)中國(guó)中西醫(yī)結(jié)合學(xué)會(huì)皮膚性病專業(yè)委員會(huì)色素病學(xué)組制定的《白癜風(fēng)臨床分型及療效標(biāo)準(zhǔn)》(2003年修訂稿)[4]。皮損處復(fù)色率分為5級(jí)：0級(jí)為無色素再生或范圍擴(kuò)大，1級(jí)為色素恢復(fù)1%～25%，2級(jí)為色素恢復(fù)26%～50%，3級(jí)為色素恢復(fù)51%～75%，4級(jí)為色素恢復(fù)76%～100%。

1.4 隨訪周期 白癜風(fēng)靶皮損移植后1、3、6個(gè)月進(jìn)行連續(xù)性隨訪觀察，按照觀察指標(biāo)進(jìn)行移植治療前后的對(duì)比分析。

2 結(jié) 果

2.1 黑素細(xì)胞觀察結(jié)果 倒置顯微鏡下典型的黑素細(xì)胞形態(tài)，主要呈紡錘狀兩極型細(xì)胞(圖1A)，多巴胺染色顯示細(xì)胞質(zhì)呈棕色或黑灰色(圖1B) 。

2.2 移植效果 移植部位7～10 d皮膚創(chuàng)面愈合。術(shù)后1個(gè)月移植部位變紅，有輕微色素沉著。移植區(qū)邊緣與正常皮膚交界處有淺白色分界線。移植后3～5個(gè)月色素明顯加深，與周圍正常皮膚相比較深或稍淺，邊界消失。6個(gè)月色素恢復(fù)穩(wěn)定，且顏色與鄰近正常皮膚接近(圖2)，未見瘢痕和其他不良反應(yīng)。白癜風(fēng)皮損移植后1、3、6個(gè)月的復(fù)色情況統(tǒng)計(jì)見表1，移植后6個(gè)月的3、4級(jí)復(fù)色率達(dá)87.09%。從移植部位與效果看，下肢、軀干、面部著色均勻，效果較好。頸部、眼瞼、嘴唇等活動(dòng)區(qū)域部分出現(xiàn)著色不勻，但均有色素島形成。處于暴露部位的移植區(qū)著色較快。

2.3 不良反應(yīng) 隨訪期間， 2例在移植治療6個(gè)月后因出國(guó)等原因失訪?；颊咴谥委熍c隨訪期間均未發(fā)生不良反應(yīng)，也無皮膚感染、無瘢痕形成等。

圖2 白癜風(fēng)移植前后對(duì)比

時(shí)間1個(gè)月3個(gè)月6個(gè)月移植皮損/塊3333314級(jí)9(27.27)14(42.42)15(51.61)3級(jí)9(27.27)11(33.33)10(35.48)2級(jí)6(18.18)4(12.12)2(3.23)1級(jí)4(12.12)2(6.06)2(3.23)0級(jí)5(15.15)2(6.06)2(6.45)

注：1-3個(gè)月隨訪21例，6個(gè)月隨訪19例

3 討 論

由于皮損部位黑素細(xì)胞數(shù)目的減少或消失，導(dǎo)致的皮膚獲得性色素脫失性疾病為白癜風(fēng)，自體黑素細(xì)胞移植是一種有效的治療方法[1]。自體移植，包括自體表皮直接移植、自體表皮細(xì)胞混懸液和自體黑素細(xì)胞體外培養(yǎng)移植[2]。由于自體表皮直接移植受到皮膚來源的限制，導(dǎo)致移植的面積較小，并且移植后容易出現(xiàn)色素融合不均等現(xiàn)象，而自體黑素細(xì)胞體外培養(yǎng)移植由于黑素細(xì)胞培養(yǎng)液中含有一些潛在致癌因子，因此在臨床應(yīng)用過程中存在安全性問題有待進(jìn)一步研究和觀察。

ReCell技術(shù)是一項(xiàng)新的表皮細(xì)胞移植技術(shù)，其原理為通過酶解、物理等作用，將小面積的皮片處理形成表皮細(xì)胞混懸液，從而開展各項(xiàng)用途的細(xì)胞療法。這種原生態(tài)的自體表皮細(xì)胞混懸液早期被應(yīng)用于燒傷創(chuàng)面的治療，可以促進(jìn)創(chuàng)面的愈合，減少植皮的面積。由于應(yīng)用ReCell技術(shù)制成的表皮細(xì)胞懸液中含有正常的黑素細(xì)胞成分，為白癜風(fēng)移植治療提供黑素細(xì)胞來源，成為研究和探索移植治療白癜風(fēng)的新方向，為白癜風(fēng)的移植治療開辟了一種新的移植療法[3]。Wood等[4]發(fā)現(xiàn)：通過ReCell技術(shù)制成的含有黑素細(xì)胞的原生態(tài)的自體表皮細(xì)胞混懸液，主要含有表皮基底細(xì)胞、朗格罕斯細(xì)胞、黑色素細(xì)胞和成纖維細(xì)胞等，黑色素細(xì)胞移植存活后，逐步地發(fā)揮功能，達(dá)到白癜風(fēng)復(fù)色的作用。同時(shí)，表皮基底細(xì)胞有促進(jìn)愈合的作用。

由于細(xì)胞未經(jīng)過傳代培養(yǎng)或在細(xì)胞懸液中添加任何生物添制劑，不會(huì)發(fā)生移植后潛在癌變和傳染病的可能[5, 6]，因此，應(yīng)用ReCell技術(shù)移植治療白癜風(fēng)具有安全性的特點(diǎn)[7]。在自體表皮細(xì)胞混懸液的過程中，本研究采用皮膚發(fā)皰的皰壁作為黑素細(xì)胞的來源，避免了手術(shù)切除取皮留下皮膚瘢痕的缺點(diǎn)；該治療方法由于采用的是細(xì)胞移植療法，移植后色素恢復(fù)均勻，較以往進(jìn)行的負(fù)壓吸皰自體表皮移植相比較，擴(kuò)大了移植面積，特別是避免了移植區(qū)的拼接樣外觀。另外，該項(xiàng)技術(shù)不需要專門的實(shí)驗(yàn)室，可在臨床上直接操作，并且方法較為簡(jiǎn)便[4]。

總之，應(yīng)用ReCell技術(shù)將發(fā)皰壁制成表皮細(xì)胞混懸液，將含有黑素細(xì)胞的表皮細(xì)胞混懸液直接種植于白斑皮損創(chuàng)面，進(jìn)行白癜風(fēng)的移植治療具有安全性可靠、供皮區(qū)不留瘢痕、移植區(qū)復(fù)色效果好的特點(diǎn)，并且細(xì)胞懸液的制備相對(duì)簡(jiǎn)單[8]。因此，應(yīng)用ReCell技術(shù)移植治療穩(wěn)定期白癜風(fēng)值得在臨床上推廣應(yīng)用。