毛建輝，孫昭勝，郭 洪，魏建輝，司 娜，邱 雷，郭連峰，鄭 磊

垂體瘤是常見單克隆起源的腺瘤，約占顱內(nèi)腫瘤的10%，多為良性，但仍有部分具有侵襲性，表現(xiàn)出惡性腫瘤生長(zhǎng)特征的核分裂現(xiàn)象，并易侵犯鄰近腦組織，被稱之為侵襲性垂體腺瘤[1，2]。手術(shù)是侵襲性垂體瘤的首選治療方式，目前臨床廣泛應(yīng)用經(jīng)鼻蝶竇顯微鏡和內(nèi)鏡手術(shù)，但由于垂體瘤所侵襲的結(jié)構(gòu)復(fù)雜，單一手術(shù)完全切除比例困難且復(fù)發(fā)率高，治療效果不佳[2]。因此，侵襲性垂體瘤的治療多主張手術(shù)、藥物及放射性治療聯(lián)合應(yīng)用，以實(shí)現(xiàn)患者個(gè)體化治療目標(biāo)[3，4]。近年來，藥物治療在侵襲性垂體瘤治療中廣泛開展，其中靶向藥物因治療特異性強(qiáng)、不良反應(yīng)少、藥效顯著等優(yōu)點(diǎn)，在治療中具有廣闊的前景[4]。本研究通過探討VEGF、PTEN及其下游P-Akt、p-MAPK信號(hào)通路在侵襲性垂體瘤的表達(dá)變化，以期為侵襲性垂體瘤藥物治療靶點(diǎn)的選擇提供參考。

1 對(duì)象與方法

1.1 對(duì)象 選取我院神經(jīng)外科2007-08至2017-04行手術(shù)治療的62例垂體瘤患者(男29例，女33例)手術(shù)標(biāo)本，均于術(shù)后貯存于液氮中。所有患者術(shù)前均未接受放療、化療或激素治療，術(shù)前均行頭顱MRI檢查，并行蝶鞍區(qū)薄層平掃，并根據(jù)Hardywilson和Knosp分級(jí)和分期標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行診斷。入選標(biāo)準(zhǔn)：(1)術(shù)前影像數(shù)據(jù)顯示為Knosp分Ⅳ級(jí)；術(shù)前影像數(shù)據(jù)顯示為Knosp分級(jí)Ⅲ/Ⅳ級(jí)；(2)術(shù)中可見腫瘤侵入海面竇內(nèi)、鞍底或斜坡骨質(zhì)破壞、術(shù)后病理結(jié)果證實(shí)為腫瘤細(xì)胞浸潤(rùn)硬膜。另選取60例正常垂體組織(對(duì)照組)，標(biāo)本來源于交通意外及其他死亡后尸體捐獻(xiàn)者，所有患者家屬均簽署知情同意書。本研究獲得醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。

1.2 方法

1.2.1 實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)VEGF和PTEN表達(dá)水平 提取組織標(biāo)本中的總RNA，后對(duì)其進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄。以GAPDH作為內(nèi)參，通過使用SYBR Green Premix Ex Taq-based assay試劑盒(Takara Bio Inc., Japan)進(jìn)行實(shí)時(shí)定量PCR擴(kuò)增。

VEGF的上游引物序列為5′-CTA CCT CCA CCA TGC CAA GT-3′,下游序列為5′-AGC TGC GCT GAT AGA CAT CC -3′；PTEN的上游引物序列為5′-AGC ATC ACC ATT CTT TGC TG-3′,下游序列為5′-ACC ACA GCC ATC GTT ATG AA-3′；GAPDH的上游引物序列為5′-CAG TCA ACG GAT TTG GTC GT-3′,下游序列為5′-TTG ATT TTG GAG GGA TCT CG-3′。每個(gè)反應(yīng)均包含15 ng相應(yīng)的cDNA，PCR擴(kuò)增條件為：95 ℃預(yù)熱1 min，95 ℃變性1 min，55 ℃(GAPDH)，58 ℃(VEGF)，60 ℃(PTEN)退火和延伸30 s，72 ℃ 1 min，共40個(gè)循環(huán)。所有檢測(cè)樣本重復(fù)3次，計(jì)算-ΔΔCt ，以平均相對(duì)含量2-ΔΔCt(ΔΔCt=ΔΔCt (目的基因)-ΔΔCt(內(nèi)參基因)計(jì)算標(biāo)本中VEGF和PTEN的相對(duì)含量。

1.2.2 Western blot檢測(cè) 采用蛋白提取試劑盒提取組織標(biāo)本中的總蛋白進(jìn)行Western blot實(shí)驗(yàn)，分別檢測(cè)樣本中磷酸化Akt、MAPK和總Akt、MAPK表達(dá)水平，相應(yīng)檢測(cè)抗體購(gòu)自Cell signal transduction，二抗分別為HRP標(biāo)記的鼠抗兔、兔抗鼠IgG抗體，用ECL化學(xué)發(fā)光試劑曝光顯示蛋白條帶，利用軟件分析條帶灰度值。

2 結(jié) 果

2.1 一般資料分析 根據(jù)入選標(biāo)準(zhǔn)，62例分為侵襲性垂體瘤32例(侵襲組)，其中男22例，女10例；非侵襲性垂體瘤30例(非侵襲組)，其中男18例，女12例。兩組患者一般資料差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，具有可比性(P>0.05，表1)。

表1 垂體瘤患者及對(duì)照組一般資料比較 (n;%)

2.2 VEGF和PTEN基因在垂體瘤中表達(dá)水平比較 實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)結(jié)果表明，垂體瘤標(biāo)本中VEGF的表達(dá)水平顯著高于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=9.40,P<0.05)，且在侵襲組的表達(dá)高于非侵襲組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=10.60,P<0.05，表2)；PTEN在侵襲性垂體瘤中的表達(dá)顯著低于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=6.31,P<0.05，表2)。

基因名稱侵襲組(n=32)非侵襲組(n=30)對(duì)照組(n=60)VEGF3.61±0.16①②2.06±0.13①0.96±0.11PTEN0.42±0.10①0.86±0.11①1.01±0.09

注:與對(duì)照組比較，①P<0.05；與非侵襲組比較，②P<0.05

2.3 p-Akt和p-MAPK在垂體瘤中表達(dá)變化比較 圖1可見Western blot檢測(cè)結(jié)果，侵襲組標(biāo)本中，p-Akt和p-MAPK水平明顯增強(qiáng)。垂體瘤標(biāo)本中p-Akt、p-MAPK水平均顯著高于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=12.95,t=7.29,P<0.05)，且侵襲組的p-MAPK表達(dá)高于非侵襲組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=10.60,P<0.05，表3)；與對(duì)照組和非侵襲組相比，侵襲組p-Akt的表達(dá)水平略有增高，但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05，表3)。

基因名稱侵襲組(n=32)非侵襲組(n=30)對(duì)照組(n=60)p-Akt3.90±0.14①2.27±0.11①0.98±0.08p-MAPK2.52±0.11①②1.89±0.05①0.97±0.06

注:與對(duì)照組比較，①P<0.05；與非侵襲組比較，②P<0.05

圖1 垂體瘤患者及正常人Western blot檢測(cè)比較各組p-Akt、p-MAPK變化情況

3 討 論

侵襲性垂體瘤是垂體腺瘤的一種特殊類型，可向鞍底、硬膜、海綿竇等周圍腦組織結(jié)構(gòu)侵犯，具有術(shù)后易復(fù)發(fā)的特點(diǎn)[1]。目前，侵襲性垂體瘤的治療首選手術(shù)治療，以期最大程度解除腫瘤的占位效應(yīng)，同時(shí)還可一定程度控制激素水平[1-3]。因此，確定手術(shù)入路和切除程度，需要依賴腫瘤的生長(zhǎng)方式、形狀及對(duì)周圍結(jié)構(gòu)的浸潤(rùn)進(jìn)行綜合判斷[4]。文獻(xiàn)[3]研究發(fā)現(xiàn)，采用經(jīng)蝶入路手術(shù)的全切率可提高為60%，且手術(shù)存在如腦脊液漏、顱神經(jīng)麻痹、尿崩及術(shù)中血管損傷等并發(fā)癥，存在一定局限性。近年來，針對(duì)侵襲性垂體瘤直接手術(shù)較困難的問題，藥物治療亦可作為首選治療或術(shù)前治療。此外，隨著垂體瘤發(fā)病機(jī)制、及基因治療等研究的深入，藥物靶點(diǎn)的選擇作為侵襲性垂體瘤的治療方向正逐漸受到重視[4]。

研究證實(shí)，PTEN作為重要的腫瘤抑制基因，其可參與包括腫瘤細(xì)胞的侵襲、增殖、凋亡，及通過多種信號(hào)通路影響血管生成[5]。PTEN基因編碼的雙特異性蛋白磷酸酶，可通過去磷酸化磷脂酰肌醇3磷酸(PIP3)將其轉(zhuǎn)化為磷脂酰肌醇2磷酸(PIP2)，提示PTEN可發(fā)揮蛋白激酶信號(hào)級(jí)聯(lián)負(fù)調(diào)節(jié)作用[6]。作為腫瘤的生物標(biāo)記物，PTEN失調(diào)已經(jīng)在多種腫瘤中被檢出[7]。本研究發(fā)現(xiàn)，PTEN基因在正常垂體組織中的表達(dá)水平顯著高于垂體瘤組織，且侵襲性垂體瘤中的表達(dá)水平顯著低于非侵襲組。此外已有研究表明，AKT是調(diào)節(jié)細(xì)胞功能的中樞調(diào)節(jié)因子，其參與腫瘤的發(fā)生和轉(zhuǎn)移[8]。PTEN是抑制PI3K/AKT信號(hào)通路磷酸化的主要調(diào)節(jié)子，其功能缺失可引發(fā)PIP3在細(xì)胞內(nèi)的積聚，從而過度激活下游Akt信號(hào)通路，導(dǎo)致細(xì)胞生長(zhǎng)過度、凋亡減少、以及血管生成[8]。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，垂體瘤患者中PTEN的表達(dá)水平顯著降低，且p-Akt水平明顯增高，而侵襲組表現(xiàn)更為顯著。此外，本研究也發(fā)現(xiàn)，侵襲組患者中，總AKT的表達(dá)水平較非侵襲組和對(duì)照組略有增高，但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。這些結(jié)果表明，PTEN基因的失調(diào)及PI3K/AKT的過度表達(dá)或磷酸化可能參與垂體瘤細(xì)胞的增殖和侵襲。

VEGF在促進(jìn)腫瘤血管生成過程、以及腫瘤細(xì)胞的發(fā)生、發(fā)展、浸潤(rùn)過程中發(fā)揮重要作用，阻斷VEGF被認(rèn)為是最為有效的抗腫瘤治療方法之一[9]。在正常的血管發(fā)展和腫瘤細(xì)胞形成中，PTEN功能缺失都可促進(jìn)VEGF介導(dǎo)的血管生成，提示PTEN和VEGF在血管生成機(jī)制中存在相關(guān)性。本研究發(fā)現(xiàn)，垂體瘤患者中，PTEN的表達(dá)水平顯著低于對(duì)照組，而VEGF的表達(dá)水平則顯著高于對(duì)照組，且侵襲組PTEN在的表達(dá)低于非侵襲組，而VEGF的表達(dá)則顯著增高，與文獻(xiàn)[10]報(bào)道基本一致，提示PTEN和VEGF在垂體瘤生長(zhǎng)和侵襲中發(fā)揮作用。然而，腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)和侵襲所依賴的新生血管的生長(zhǎng)和成熟需要復(fù)雜多因子和多信號(hào)傳達(dá)過程[9, 11-13]。已經(jīng)證實(shí)，VEGF可通過MAPK、PI3K/Akt等途徑誘發(fā)細(xì)胞內(nèi)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)，從而激活細(xì)胞增殖作用[20]。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，垂體瘤組織中MAPK和AKT信號(hào)通路激活程度顯著高于對(duì)照組，表現(xiàn)在p-MAPK和p-Akt水平顯著增高，且侵襲組激活程度更高。結(jié)果表明，PTEN/VEGF及其下游信號(hào)通路在垂體瘤生長(zhǎng)、侵襲過程中發(fā)揮重要作用。

綜上所述，本研究發(fā)現(xiàn)侵襲性垂體瘤中VEGF、p-Akt及p-MAPK水平明顯增高，而PTEN表達(dá)水平顯著降低，提示上述變化可能與垂體瘤的侵襲性相關(guān)，其可能為診斷并治療侵襲性垂體瘤靶點(diǎn)的選擇提供新方向。但本研究為單中心臨床研究模式，標(biāo)本量較少，下一步將擴(kuò)大樣本量，并收集多中心數(shù)據(jù)進(jìn)行比較。另外，PTEN/VEGF信號(hào)通路與其他信號(hào)通路如FLT1、MMP2在垂體瘤發(fā)生發(fā)展的相互關(guān)系亦需深入研究，以期為治療侵襲性垂體瘤靶點(diǎn)基因的選擇提供新思路。