李 晟，陳 宏，孫 巖，陳 丁，田紅霞，袁 鷹，肖王艷

人類胃腸道微生態(tài)系統(tǒng)非常復雜，健康人群的腸道內(nèi)寄居著一百億以上的細菌，這些腸道菌群構(gòu)成了腸道微生態(tài)系統(tǒng)。不同種類的腸道菌群保持一種動態(tài)的平衡狀態(tài)并且與機體相互作用，在代謝、營養(yǎng)、宿主消化、免疫等多方面發(fā)揮重要作用。慢性腎臟病(chronic kindney disease，CKD)是全球性的健康問題，中國成人CKD患病率已超過10%[1]。第6次全國人口普查顯示我國60歲以上老年人已占總?cè)丝诘?3.26%，增齡是CKD發(fā)病的主要危險因素之一[2]。Pahl等[3]于2015年提出了“腎臟病-結(jié)腸軸”學說，進一步闡明了CKD與腸道菌群的相互作用關(guān)系，其認為CKD患者在疾病進展過程中會出現(xiàn)腸道菌群失調(diào)，加重腎臟損害。終末期腎病(end stage renal disease，ESRD)患者進行血液透析時，血流動力學不穩(wěn)定，腸道低灌注缺血缺氧亦可造成腸道屏障破壞，促使腸道菌群移位及變化[4]。本研究旨在探討維持性血液透析ESRD患者腸道菌群的特點，研究腸道菌群分布情況及代謝通路變化，為尋找維持性血液透析ESRD患者可能的腸道治療靶點提供線索。

1 對象與方法

1.1 對象 選取2018-10至2019-01我院血液透析中心維持性血液透析的穩(wěn)定ESRD患者22例(A組)，其中男16例，女6例，平均年齡(63.73±14.67)歲，每周透析2～4次，每次4～5 h，透析時間>3個月。所有患者病情穩(wěn)定，無急慢性感染、活動的自身免疫性疾病，近3個月無輸血史，2周內(nèi)未使用過腎上腺皮質(zhì)激素、免疫抑制藥。健康對照組(B組)為本院健康體檢者，共計22例，其中男13例，女9例，平均年齡(57.59±14.71)歲。健康對照組未使用過抗菌藥物和免疫抑制藥，無明顯病毒、細菌或真菌病原體感染。

1.2 標本收集及保存 收集受試者新鮮糞便樣品，取中段內(nèi)部糞便樣品分裝至2 ml無菌EP管，每管糞便量0.5～2 g，放入液氮中保存。

1.3 糞便樣本微生物DNA提取及質(zhì)量檢測 使用DNA提取試劑盒(Qiagen，德國)，按說明書步驟，經(jīng)過微生物細胞破碎、DNA抽提、純化，提取糞便微生物DNA。

1.4 建庫測序 提取糞便微生物總DNA后，根據(jù)保守區(qū)設(shè)計得到引物，在引物末端加上測序接頭，進行PCR擴增并對其產(chǎn)物進行純化、定量和均一化形成測序文庫，建好的文庫先進行文庫質(zhì)檢，質(zhì)檢合格的文庫用Illumina HiSeq 2500進行測序。

1.5 統(tǒng)計學處理 受試者基本信息采用統(tǒng)計軟件SPSS 22.0來計算，并進行獨立樣本t檢驗。組間差異物種采用Krushal-Wallis秩和檢驗進行分析。通過與KEGG數(shù)據(jù)庫進行比對，進行功能基因在代謝途徑上的差異分析。

2 結(jié) 果

2.1 研究對象基本特征 兩組年齡、性別構(gòu)成比、年齡分組均無統(tǒng)計學差異(表1)。

2.2 糞便微生物群落多樣性比較

2.2.1 α多樣性 維持性血液透析ESRD組觀察到的各樣品微生物物種量、物種多樣性較健康對照組低，但無統(tǒng)計學差異。按年齡分層后維持性血液透析ESRD組僅18～44歲患者中觀察到的物種多樣性較對照組低，有統(tǒng)計學差異(P<0.05)。

表1 維持性血液透析(A)組與健康對照(B)組基本信息

2.2.2 β多樣性 主坐標分析法(Principal coordinates analysis，PCoA)可以看出兩組明顯分開，提示兩組樣品微生物群多樣性可能有差異(圖1)。

2.3 兩組菌群在各分類水平上的微生物組成及組間差異物種分析 兩組糞便菌群共有的優(yōu)勢菌門為厚壁菌門(Firmicutes)、擬桿菌門(Bacteroidetes)、變形菌門(Proteobacteria)、放線菌門(Actinobacteria)。在門水平兩組微生物菌群的相對豐度無統(tǒng)計學差異物種。在綱、目、科、屬、種分類水平上分別發(fā)現(xiàn)2、4、9、29、28個相對豐度有統(tǒng)計學差異的物種(P<0.05)； 其中Negatibicutes綱、糞球菌屬-3(Coprococcus-3)相對豐度維持性血液透析ESRD組低于對照組，而丹毒絲綱、目、科、屬、種水平相對豐度維持性血液透析ESRD組高于對照組(圖2 A-B)。

2.4 兩組糞便菌群差異代謝通路分析 通過KEGG代謝途徑的差異分析，推測兩組間有3個存在統(tǒng)計學差異(P<0.05)的代謝途徑，其中與碳水化合物代謝途徑相關(guān)基因在健康對照組糞便樣品中顯著富集，而與細胞運動性及藥物耐藥途徑相關(guān)基因在維持性血液透析ESRD組糞便樣品中顯著富集(圖3)。

圖1 維持性血液透析(A)組與健康對照(B)組PCoA分析圖

圖2 維持性血液透析(A)組與健康對照(B)組物種相對豐度比較

A.綱水平；B.屬水平

圖3 維持性血液透析(A)組與健康對照(B)組KEGG代謝途徑差異分析

3 討 論

人類胃腸道優(yōu)勢菌群是擬桿菌、厚壁菌和放線菌[5]。本研究與此一致，維持性血液透析ESRD組和健康對照組受試者糞便菌群共有的優(yōu)勢菌門亦為厚壁菌門、擬桿菌門、變形菌門和放線菌門。本研究對兩組糞便微生物群落相對豐度比較，發(fā)現(xiàn)2綱、4目、9種、29屬、28種有統(tǒng)計學差異的物種。Negatibicutes綱相對豐度在維持性血液透析ESRD組低于對照組，Negatibicutes綱屬厚壁菌門，為專性厭氧G-菌。文獻[6]報道γ變形菌綱(如G-兼性芽孢桿菌)相對豐富而嚴格厭氧菌(特別是Negativicutes)相對貧乏容易在極低體重嬰兒中形成壞死性小腸結(jié)腸炎，說明Negatibicutes綱減少對炎性反應(yīng)過程有促進作用。金曉倩[7]研究證實，維持性血液透析ESRD患者腸道優(yōu)勢菌群多樣性發(fā)生顯著變化，且與患者炎性反應(yīng)因子有密切相關(guān)性。丹毒絲綱、目、科、屬、種水平相對豐度在維持性血液透析ESRD組均高于對照組，丹毒絲綱亦屬于厚壁菌門，為革蘭陽性桿菌，無莢膜，不形成芽苞。特發(fā)性炎性反應(yīng)性腸病狗γ變形菌綱過表達，而丹毒絲綱、梭菌綱和擬桿菌綱低表達[8]。Pindjakova等[9]發(fā)現(xiàn)，高脂飲食喂養(yǎng)的C57/BL6小鼠(模擬代謝健康的肥胖模型)出現(xiàn)肥胖、體重增加、脂肪肝但無系統(tǒng)性炎性反應(yīng)且未激活適應(yīng)性免疫應(yīng)答，此小鼠糞便樣品中γ變形菌綱、δ變性菌綱、丹毒絲綱豐富。由此可見厚壁菌門的丹毒絲綱增多似乎對于炎性反應(yīng)控制有利。還有研究發(fā)現(xiàn)丹毒絲綱在高血壓動物中豐富[10]。ESRD中部分患者有透析相關(guān)性低血壓，是否可嘗試將腸道菌群作為治療靶點達到減輕炎性反應(yīng)、改善血壓的目的尚需進一步研究。

革蘭陽性梭菌特別是糞球菌屬可將膳食纖維和其他復合糖類發(fā)酵為丁酸鹽，而丁酸鹽可能是具有抑制結(jié)腸炎、抑癌作用的主要結(jié)腸代謝物[11]。高膳食纖維結(jié)構(gòu)飲食能夠減輕腸黏膜上皮細胞緊密連接損傷，并延緩腎功能不全的進展[12]。本研究發(fā)現(xiàn)，糞球菌屬在維持性血液透析ESRD組中的相對豐度降低，可能對膳食纖維和其他復合糖類的發(fā)酵不利，這與本研究中通過KEGG代謝途徑差異分析推測的糖類代謝途徑相關(guān)基因在維持性血液透析ESRD組富集程度低于健康對照組是一致的。細菌分解糖類后的主要產(chǎn)物是單糖，其發(fā)酵形成各種短鏈脂肪酸(SCFAs)，SCFAs可對免疫調(diào)節(jié)、降低系統(tǒng)性炎性反應(yīng)發(fā)揮有益作用[13]。說明高纖維飲食及調(diào)節(jié)腸道菌群可能通過促進糖類代謝及相關(guān)有益代謝產(chǎn)物生成進而減輕炎性反應(yīng)。

綜上所述，本研究發(fā)現(xiàn)，維持性血液透析ESRD組優(yōu)勢菌門種類與健康對照組相似，各樣品糞便微生物群落α多樣性分析顯示，僅18～44歲年齡段兩組物種多樣性有統(tǒng)計學差異?？赡芘c本研究中老年患者比例偏高有關(guān)，人在衰老的過程中，腸道微生物多樣性逐漸降低，先前罕見的致病菌株逐漸占據(jù)主導地位[11]。β多樣性分析顯示，兩組可能有組間差異。但由于本研究病例有限，這種多樣性的差異顯著性及年齡分層的意義有待進一步研究。各菌門在微生物不同分類水平上的相對豐度有存在統(tǒng)計學差異的物種。厚壁菌門的Negatibicutes、丹毒絲菌增加可能對炎性反應(yīng)控制、血壓調(diào)節(jié)起到有益作用，目前尚未見相關(guān)文獻報道上述菌群在維持性血液透析ESRD患者中作用，可否為下一步ESRD患者減輕炎性反應(yīng)、調(diào)節(jié)血壓提供一個可能的腸道治療靶點？值得進一步擴大樣本深入研究。