謝俊杰，鄧波，易峰濤，邵志雄，徐振華

(1.中國人民解放軍中部戰(zhàn)區(qū)總醫(yī)院放射治療科，武漢 430070；2.湖北省咸寧市中心醫(yī)院腫瘤中心，咸寧 437000)

原發(fā)性肝癌(primary hepatocellular carcinoma，PLA)是我國第四常見的惡性腫瘤，在腫瘤相關(guān)致死病因中排名第三，嚴(yán)重威脅著人民的生命和健康[1-2]。PLA起病隱匿，早期診斷困難，侵襲性高，易發(fā)生遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移，在確診時大多已屬于腫瘤晚期，僅能采取姑息治療，預(yù)后較差。目前，有效且副作用相對較少的治療PLA的藥物幾乎沒有，因此尋找具有特異性殺傷肝癌細(xì)胞或抑制肝癌細(xì)胞的新藥，成為肝癌治療的目標(biāo)。

甲磺酸阿帕替尼(apatinib mesylate)是一種可以口服的新型小分子抗血管生成酪氨酸激酶抑制劑(TKI)，可高度選擇性結(jié)合并抑制血管內(nèi)皮細(xì)胞生長因子受體-2 (VEGFR-2)，從而抑制腫瘤血管生成，阻礙腫瘤生長[3-4]。其適應(yīng)證批準(zhǔn)用于晚期胃癌患者。有研究發(fā)現(xiàn)甲磺酸阿帕替尼治療晚期原發(fā)性肝癌可提高近期臨床療效，延長患者總生存期，建議推廣使用[5-6]；小檗堿(berberine，BBR)是中藥黃連、黃柏、三顆針等的主要成分，其抗腫瘤作用是目前研究的一個熱點(diǎn)。筆者在本研究擬進(jìn)一步觀察甲磺酸阿帕替尼、小檗堿及兩藥聯(lián)合對肝癌Hep-G2細(xì)胞增殖、細(xì)胞凋亡、細(xì)胞周期分布的影響，初步探討其在肝癌治療中的作用及可行性，為進(jìn)一步擴(kuò)展PLA治療手段提供可行方案。

1 材料與方法

1.1試藥 小檗堿(成都曼思特生物科技有限公司，批號：A0152，含量≥98%)；甲磺酸阿帕替尼(江蘇恒瑞醫(yī)藥股份有限公司，批號：171228KB，規(guī)格：0.25 g)；實(shí)驗(yàn)前均用二甲亞砜(DMSO)配置成一定濃度保存液保存于-20 ℃，實(shí)驗(yàn)時用小劑量伊格爾培養(yǎng)液(MEM)配置成不同濃度的藥液。CCK-8試劑盒(C0038)購于上海碧云天生物技術(shù)有限公司；PI染色試劑盒(PAB180014)及Annexin V-FITC/PI凋亡試劑盒(PAB180012)均購自bio-Swamp公司。

1.2細(xì)胞與細(xì)胞培養(yǎng) 人肝癌HepG2細(xì)胞購于中國典型培養(yǎng)物保藏中心(武漢大學(xué)保藏中心)，用MEM Hyclone培養(yǎng)基、10%胎牛血清、青霉素-鏈霉素溶液配置成的完全培養(yǎng)基培養(yǎng)于37 ℃、5%二氧化碳(CO2)飽和濕度的細(xì)胞培養(yǎng)箱中，實(shí)驗(yàn)時取對數(shù)生長期細(xì)胞備用。

1.3CCK-8檢測HepG2細(xì)胞的增殖抑制作用 取指數(shù)生長期細(xì)胞，配置成1×103·mL-1的單細(xì)胞懸液，保持每孔100 μL接種于96孔板中，置于37 ℃、5%CO2飽和濕度的細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，待細(xì)胞貼壁后再給予不同濃度小檗堿和甲磺酸阿帕替尼干預(yù)細(xì)胞，小檗堿濃度梯度設(shè)置為12.5，25，50，100，200 μmol·L-1；甲磺酸阿帕替尼濃度梯度設(shè)置為0.1，0.5，2.5，12.5，25.0 μmol·L-1；另設(shè)陰性對照組(只有細(xì)胞和培養(yǎng)基)和空白對照組(只有培養(yǎng)基，沒有細(xì)胞)。每個濃度設(shè)置5個復(fù)孔，每個96孔板邊緣均加入磷酸鹽緩沖液(PBS)100 μL，再分別繼續(xù)培養(yǎng)24，48，72 h。吸出原液，PBS洗滌1次，每孔中加入用DMEM稀釋的CCK-8 液100 μL，再置于培養(yǎng)箱中繼續(xù)孵育3 h。用酶聯(lián)免疫吸附測定(ELISA)儀在波長450 nm處測定每孔吸光度(A值)，然后根據(jù)公式計(jì)算細(xì)胞增殖抑制率。再分別計(jì)算24 h小檗堿和甲磺酸阿帕替尼25%抑制濃度(IC25值)，并作為聯(lián)合用藥組藥物濃度，繼續(xù)重復(fù)上述實(shí)驗(yàn)步驟，計(jì)算聯(lián)合用藥組干預(yù)細(xì)胞24，48，72 h后細(xì)胞抑制率，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

細(xì)胞增殖抑制率(%)=[1-(用藥組A值-空白組A值)/(陰性組A值-空白組A值) ]×100%。

1.4流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞周期及凋亡變化情況 取對數(shù)生長期細(xì)胞，清洗消化后制成3×105個·mL-1單細(xì)胞懸液，接種于6孔板中，再置于培養(yǎng)箱繼續(xù)培養(yǎng)24 h，待細(xì)胞貼壁后分別設(shè)甲磺酸阿帕替尼組、小檗堿組、兩藥聯(lián)合組及空白對照組。小檗堿組用30 μmol·L-1小檗堿干預(yù)細(xì)胞；甲磺酸阿帕替尼用0.5 μmol·L-1甲磺酸阿帕替尼干預(yù)細(xì)胞；兩藥聯(lián)合組加入30 μmol·L-1小檗堿和0.5 μmol·L-1甲磺酸阿帕替尼干預(yù)細(xì)胞，空白對照組給予完全培養(yǎng)液。繼續(xù)培養(yǎng)24 h后用PBS洗滌2次，胰酶消化，離心收集細(xì)胞，并重懸于Binging Buffer 200 μL中，再根據(jù)碘化丙啶(PI)染色試劑盒及Annexin V-FITC/PI凋亡檢測試劑盒的說明書進(jìn)行細(xì)胞染色，用流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞周期分布及凋亡情況。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

2 結(jié)果

2.1CCK-8 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.1.1甲磺酸阿帕替尼抑制細(xì)胞增殖 不同濃度甲磺酸阿帕替尼作用HepG-2細(xì)胞24，48，72 h后細(xì)胞增殖受到明顯抑制，且隨著藥物濃度增加、作用時間延長，增殖抑制作用也明顯增強(qiáng)(P<0.01)。見表1。經(jīng)加權(quán)直線回歸方程計(jì)算，甲磺酸阿帕替尼24 h IC25值為0.5 μmol·L-1。

2.1.2小檗堿抑制細(xì)胞增殖 不同濃度小檗堿作用于HepG-2細(xì)胞24，48，72 h后細(xì)胞生長增殖均受到明顯抑制，隨著藥物濃度的增加、作用時間的延長，抑制作用明顯增強(qiáng)(P<0.01)。結(jié)果見表1。經(jīng)加權(quán)直線回歸方程計(jì)算，小檗堿24 h IC25值為30 μmol·L-1。

表1 甲磺酸阿帕替尼和小檗堿對Hep-G2細(xì)胞增殖抑制的影響

組別藥物濃度/(μmol·L-1)生長抑制率/%24 h48 h72 h對照組0.00000甲磺酸阿帕替尼組0.102.54±0.144.07±0.1821.29±0.120.5025.79±0.0928.03±0.2347.25±0.042.5052.51±0.1255.53±0.1268.63±0.1112.565.44±0.1068.26±0.1476.20±0.1525.079.22±0.2181.29±0.1284.51±0.07小檗堿組12.517.40±0.1018.97±0.1425.03±0.2325.022.97±0.0426.82±0.9737.16±0.2150.052.49±0.0456.83±0.1662.27±0.13100.062.46±0.6966.18±0.1571.90±0.01200.070.25±0.2471.23±0.1474.32±0.05

2.1.3兩藥聯(lián)合抑制細(xì)胞增殖 分別用0.5 μmol·L-1甲磺酸阿帕替尼、30 μmol·L-1小檗堿作為兩藥聯(lián)合組用量作用于細(xì)胞24，48，72 h，聯(lián)合用藥對細(xì)胞增殖抑制作用隨著時間延長呈現(xiàn)上升趨勢(P<0.01)，24，48，72 h生長抑制率分別為(40.03±0.16)%，(54.91±0.11)%，(60.22±0.04)%。進(jìn)一步分析顯示，同一時間點(diǎn)聯(lián)合用藥對細(xì)胞抑制率明顯高于甲磺酸阿帕替尼組和小檗堿組(P<0.01)。

2.2細(xì)胞周期檢測結(jié)果 將0.5 μmol·L-1甲磺酸阿帕替尼作用于Hep-G2細(xì)胞24 h后，與空白對照組比較，G0/G1期細(xì)胞明顯增加(P<0.01)，S期及G2/M期細(xì)胞明顯減少(P<0.01)，表明甲磺酸阿帕替尼可將Hep-G2細(xì)胞周期阻滯于G0/G1期；將濃度為30 μmol·L-1小檗堿作用于Hep-G2細(xì)胞24 h后，G0/G1期及S期細(xì)胞明顯減少(P<0.01)，而G2/M期細(xì)胞明顯增加(P<0.01)，表明小檗堿可將Hep-G2細(xì)胞周期阻滯G2/M期；將0.5 μmol·L-1甲磺酸阿帕替尼和30 μmol·L-1小檗堿聯(lián)合用于Hep-G2細(xì)胞24 h后，G0/G1期細(xì)胞明顯增加(P<0.01)，S期及G2/M期明顯減少(P<0.01)，提示聯(lián)合用藥可將細(xì)胞周期阻滯于G0/G1期。見圖1，表2。

2.3細(xì)胞凋亡檢測結(jié)果 0.5 μmol·L-1甲磺酸阿帕替尼干預(yù)細(xì)胞24 h后，早期、中晚期細(xì)胞凋亡率均高于空白對照組(P<0.01)；將30 μmol·L-1小檗堿干預(yù)Hep-G2細(xì)胞24 h后，早期、中晚期細(xì)胞凋亡率均高于空白對照組(P<0.01)；而將0.5 μmol·L-1甲磺酸阿帕替尼和30 μmol·L-1小檗堿聯(lián)合用于Hep-G2細(xì)胞24 h后，細(xì)胞早期、中晚期凋亡率均高于甲磺酸阿帕替尼組和小檗堿組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見圖2，表3。

圖1 甲磺酸阿帕替尼、小檗堿及兩藥聯(lián)合對Hep-G2細(xì)胞周期的影響

Fig.1Effectsofapatinibmesylate,berberineandtheircombinationoncellcycleofHep-G2cells

表2 阿帕替尼、小檗堿及兩藥聯(lián)合對Hep-G2細(xì)胞周期的影響

組別G0/G1期S期G2/M期空白對照組55.42±2.9528.47±2.8716.11±1.08甲磺酸阿帕替尼組87.66±1.61?18.29±1.57?14.05±0.05?1小檗堿組48.99±2.45?121.13±5.86?129.88±4.06?1聯(lián)合用藥組86.04±0.92?18.58±0.94?15.37±0.94?1

與空白對照組比較，*1P<0.01

Compared with blank control group，*1P<0.01

3 討論

近年來，隨著分子靶向治療、基因治療、細(xì)胞免疫治療等快速發(fā)展，以腫瘤基因組改變?yōu)榛A(chǔ)的精準(zhǔn)治療加速腫瘤分子靶向治療及免疫治療的進(jìn)展。多種基因的突變、細(xì)胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路和新生血管增生的異常等是參與肝癌的發(fā)生、發(fā)展、轉(zhuǎn)移和播散的多個關(guān)鍵性環(huán)節(jié)，是分子靶向治療的理論基礎(chǔ)和潛在靶點(diǎn)[7]。索拉非尼是目前唯一用于治療晚期肝癌的分子靶向藥物，具有抑制腫瘤細(xì)胞增殖、抗血管生成的雙重作用，被臨床試驗(yàn)證明具有延緩?fù)砥诟伟┗颊吣[瘤進(jìn)展，延長生存期的作用[8-9]。但索拉菲尼總有效率低，不良反應(yīng)多、價格昂貴，臨床使用并不廣泛。

圖2 甲磺酸阿帕替尼、小檗堿及兩藥聯(lián)合對Hep-G2細(xì)胞凋亡的影響

表3 甲磺酸阿帕替尼、小檗堿及兩藥聯(lián)合對Hep-G2細(xì)胞早期、中晚期細(xì)胞凋亡率的影響

組別早期凋亡率中晚期凋亡率空白對照組0.05±0.090.00±0.00甲磺酸阿帕替尼組4.61±0.46?13.94±0.51?1小檗堿組3.72±0.17?13.13±0.24?1聯(lián)合用藥組12.64±1.70?1?2?35.37±0.31?1?2?3

與空白對照組比較，*1P<0.01；甲磺酸與阿帕替尼組比較，*2P<0.05；與小檗堿組比較，*3P<0.05

Compared with blank control group，*1P<0.01；compared with apatinib mesylate group，*2P<0.05；compared with berberine group，*3P<0.05

小檗堿具有療效明顯、毒副作用低等特點(diǎn)，在抗炎、解毒、抗菌和止瀉等方面作用突出[10]。近年來，小檗堿的抗腫瘤作用逐步受到重視，小檗堿在消化道系統(tǒng)腫瘤如結(jié)腸癌、食管癌，生殖系統(tǒng)腫瘤如前列腺癌、卵巢癌及其他腫瘤如肺癌、人皮膚鱗狀細(xì)胞癌等均發(fā)揮抗腫瘤作用[11-16]，但其在肝癌方面研究仍基本在基礎(chǔ)研究上，僅少部分研究發(fā)現(xiàn)其具有抑制肝癌細(xì)胞增殖、促進(jìn)細(xì)胞凋亡、引起細(xì)胞侵襲、抗肝癌血管生成等發(fā)揮抗腫瘤作用。林慶新[17]研究發(fā)現(xiàn)黃連素可通過上調(diào)p53蛋白表達(dá)、下調(diào)BCL-2蛋白表達(dá)來誘導(dǎo)HepG2細(xì)胞凋亡；張衛(wèi)東等[18]研究發(fā)現(xiàn)小檗堿可能通過增加HepG2細(xì)胞CDC2蛋白表達(dá)，降低CDK4、CyclinBl蛋白表達(dá)使其阻滯于S、G2/M期；可能通過增加Caspase-3蛋白表達(dá)增加HepG2細(xì)胞凋亡；汪玉芳等[19]發(fā)現(xiàn)小檗堿可抑制人肝癌HepG2細(xì)胞的增殖和VEGF的表達(dá)，所以抗血管生成可能是小檗堿抗肝腫瘤的作用機(jī)制之一；王如華[20]發(fā)現(xiàn)小檗堿可能通過抑制VEGF表達(dá)、改善腫瘤血管形成情況而增強(qiáng)腫瘤細(xì)胞的放射敏感性。

甲磺酸阿帕替尼主要應(yīng)用于胃腺癌患者，雖然在肝癌患者中也應(yīng)用廣泛，但屬于超說明書用藥。因此，本實(shí)驗(yàn)擬通過研究甲磺酸阿帕替尼、小檗堿及兩藥聯(lián)合對肝癌細(xì)胞增殖、細(xì)胞周期、細(xì)胞凋亡的影響，從而探討其抗肝癌作用，并進(jìn)一步探究中西醫(yī)結(jié)合治療肝癌的臨床療效[21]。

通過實(shí)驗(yàn)結(jié)果可知兩藥均能抑制Hep-G2細(xì)胞增殖，且均具有時間-濃度依賴性；而兩藥聯(lián)合對細(xì)胞增殖的抑制作用更加明顯，呈現(xiàn)疊加效應(yīng)；甲磺酸阿帕替尼及兩藥聯(lián)合均可將細(xì)胞周期阻滯于G0/G1期、小檗堿可將細(xì)胞周期阻滯于G2/M期，且兩藥聯(lián)合作用時，甲磺酸阿帕替尼起主導(dǎo)作用，這說明小檗堿可協(xié)同甲磺酸阿帕替尼起到阻滯Hep-G2細(xì)胞周期的作用；而甲磺酸阿帕替尼和小檗堿均能引起肝癌細(xì)胞凋亡，甲磺酸阿帕替尼主要引起早期凋亡，小檗堿主要引起中晚期凋亡，兩藥聯(lián)合時中晚期細(xì)胞凋亡比率更顯著，由此推測，在兩藥聯(lián)合相互作用誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡中，小檗堿可能起主導(dǎo)作用[21]。

綜上所述，甲磺酸阿帕替尼、小檗堿均能通過抑制肝癌細(xì)胞增殖，阻滯細(xì)胞周期，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡而發(fā)揮其抗肝癌作用，兩藥聯(lián)合應(yīng)用時，效果更加明顯。