蔡淑珍，李建良，陳圓，薩如拉，李志勇，圖雅

(1.內(nèi)蒙古民族大學(xué)蒙醫(yī)藥學(xué)院，通遼 028000；2.中國(guó)中醫(yī)科學(xué)院醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)中心，北京 100700；3.山西中醫(yī)藥大學(xué)中藥學(xué)院，晉中 030600；4.中央民族大學(xué)藥學(xué)院，北京 100081；5.中國(guó)中醫(yī)科學(xué)院中醫(yī)藥發(fā)展研究中心，北京 100700)

隨著生活水平的提高和飲食結(jié)構(gòu)、生活習(xí)慣變化，由高脂血癥引發(fā)的動(dòng)脈粥樣硬化、心肌梗死、冠心病等心腦血管疾病發(fā)生率迅速升高，且有年輕化的趨勢(shì)，因此人們不得不開始重視高脂血癥引起的健康問題[1]。蒙醫(yī)藥作為我國(guó)四大少數(shù)民族醫(yī)藥之一，是蒙古族人民長(zhǎng)期與疾病作斗爭(zhēng)的經(jīng)驗(yàn)總結(jié)。蒙藥因豐富的藥材資源，較少的不良反應(yīng)，在預(yù)防和治療高脂血癥及其引發(fā)的各類心血管疾病中有著明確療效[2]。

蓽茇為胡椒科植物蓽茇(PiperlongumL.)的未成熟或成熟果穗，蒙藥名為“蓽蓽靈”，味辛、性溫，效膩、銳、輕、燥，具有調(diào)理胃火，祛“巴達(dá)干”“赫依”，調(diào)元，滋補(bǔ)強(qiáng)壯，平喘，祛痰，止痛等功效[3]；蒙醫(yī)臨床常用于治療胃火衰敗、不思飲食、消化不良等寒性疾病。蓽茇作為蒙醫(yī)習(xí)用藥材，在蒙藥臨床方劑中應(yīng)用較廣泛，約有195個(gè)臨床常用方劑中含有蓽茇[4-5]?，F(xiàn)代研究表明，蓽茇具有調(diào)血脂、抗腫瘤、抗炎、抗菌、抗氧化、保護(hù)胃黏膜等藥理作用[6-8]。

近年來，網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)提出并用于從系統(tǒng)生物學(xué)角度研究并闡釋中藥藥效物質(zhì)基礎(chǔ)及作用機(jī)制，為民族藥的現(xiàn)代研究提供了示范和啟迪。對(duì)于民族藥的現(xiàn)代研究，應(yīng)著力于闡釋其物質(zhì)基礎(chǔ)，闡明其作用機(jī)制，并將承載于民族藥上的民族醫(yī)藥理論和經(jīng)驗(yàn)特征講清楚[9-12]。因此，從傳統(tǒng)蒙醫(yī)理論和臨床經(jīng)驗(yàn)出發(fā)，運(yùn)用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法闡明蓽茇祛“巴達(dá)干”“赫依”，及 “分清別濁”功能，進(jìn)一步揭示其降血脂、干預(yù)高脂血癥的藥效機(jī)制，可為后續(xù)研究提供一定的理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1材料 中藥系統(tǒng)藥理學(xué)數(shù)據(jù)庫(kù)和分析平臺(tái)(TCMSP，http：//ibts.hkbu.edu.hk/LSP/tcmsp.php)；PharmMapper Server數(shù)據(jù)庫(kù)(http：//lilab.ecust.edu.cn/pharmmapper/index.php)；Uniprot數(shù)據(jù)庫(kù)(http：//www.uniprot.org/)；人類孟德爾遺傳數(shù)據(jù)庫(kù)(OMIM)(http：//www.omim.org/)；DiGSeE(http：//210.107.182.61/geneSearch);Genecards(http：//www.genecards.org/);京都基因與基因組百科全書(KEGG，https：//www.kegg.jp/);Metascape(http：metascape.org/gp/index.html)。

1.2蓽茇候選成分的篩選 通過TCMSP數(shù)據(jù)庫(kù)查詢獲得了104種化學(xué)成分，按口服生物利用度(oral bioavailability，OB≥30%)和類藥性(drug-likeness ，DL≥0.18)篩選出15種符合條件的化合物，將其作為候選化合物，結(jié)果見表1。

1.3潛在靶點(diǎn)預(yù)測(cè)與查詢 根據(jù)所獲得的有效成分，從PharmMapper Server 數(shù)據(jù)庫(kù)獲取Fit Score ≥3.0的靶點(diǎn)，并從Uniprot數(shù)據(jù)庫(kù)獲得靶蛋白相關(guān)信息，該數(shù)據(jù)庫(kù)包含全面的蛋白質(zhì)信息，包括蛋白質(zhì)名稱以及對(duì)應(yīng)的標(biāo)準(zhǔn)基因名稱，可用于蛋白名(protein ID)和基因名(gene ID)的轉(zhuǎn)化。

1.4藥物對(duì)應(yīng)疾病信息查詢 采用OMIM數(shù)據(jù)庫(kù)、DiGSeE文本挖掘、Genecards以“Hyperlipidemia”為關(guān)鍵詞進(jìn)行檢索，獲取靶蛋白進(jìn)行篩選，得到候選藥物治療高脂血癥的相關(guān)靶蛋白，將藥物靶點(diǎn)與疾病靶點(diǎn)通過Tbtools取交集。

1.5基因本體(GO)富集分析與通路注釋 將預(yù)測(cè)得到的靶點(diǎn)利用Tbtools取交集，之后將得到的靶標(biāo)蛋白導(dǎo)入到WebGestalt數(shù)據(jù)庫(kù)，進(jìn)行GO功能注釋，再結(jié)合Metascape進(jìn)行KEGG通路分析，通過查閱文獻(xiàn)和KEGG數(shù)據(jù)庫(kù)得到與蓽茇治療高脂血癥相關(guān)的通路。

1.6藥物-靶點(diǎn)-作用通路的網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建 根據(jù)候選藥物、相關(guān)靶點(diǎn)及通路信息，采用Cystoscope 3.2.1進(jìn)行網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建、分析和可視化。運(yùn)用Cytoscape軟件的Merge插件建立蓽茇有效成分治療高脂血癥的“候選藥物-靶點(diǎn)-作用通路”網(wǎng)絡(luò)圖。

2 結(jié)果

2.1候選化合物預(yù)測(cè)潛在靶點(diǎn)相關(guān)信息 通過TCMSP數(shù)據(jù)庫(kù)結(jié)合文獻(xiàn)查詢，獲得104種化學(xué)成分，并通過OB≥30%和DL≥0.18兩個(gè)關(guān)鍵參數(shù)，篩選出蓽茇中15種具有良好OB和DL性的化合物，見表1。

利用OMIM數(shù)據(jù)庫(kù)、DiGSeE文本挖掘、Genecards查詢候選藥物治療高脂血癥的相關(guān)靶蛋白信息，將藥物靶點(diǎn)與疾病靶點(diǎn)通過Tbtools取交集，得到與高脂血癥相關(guān)的31個(gè)靶點(diǎn)，相關(guān)信息見表2。

結(jié)合表1和表2信息，蓽茇有效成分既可作用于相同靶點(diǎn)也可作用于不同的靶點(diǎn)，說明蒙藥多成分、多靶點(diǎn)、協(xié)同增效的作用機(jī)制。

2.2GO富集分析與通路注釋 運(yùn)用WebGestalt數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行GO功能注釋和Pathway通路分析。GO功能注釋是通過生物過程(biological processes，BP)、分子功能(molecular function，MF)和細(xì)胞組分(cell components，CC)對(duì)基因進(jìn)行注釋和分類。GO功能注釋見圖1，在分子功能中蛋白結(jié)合、分子作用、分子傳感器活性影響相對(duì)靠前，在生物過程中代謝過程、生物調(diào)節(jié)、多細(xì)胞生物所占比例高，在細(xì)胞組分中細(xì)胞膜、囊泡、細(xì)胞核相關(guān)性最大。為進(jìn)一步明確核心關(guān)鍵靶標(biāo)的生物學(xué)功能，通過Metascape數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)關(guān)鍵核心靶點(diǎn)進(jìn)行通路富集分析,選取差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05) 的所有通路,得到22條間接或直接與高脂血癥相關(guān)的通路，見表3。其中與脂質(zhì)代謝相關(guān)的通路：磷酸腺苷依賴的蛋白激酶(AMPK)、調(diào)節(jié)脂肪細(xì)胞中的脂肪分解(regulation of lipolysis in adipocytes)、過氧化物酶體增殖劑激活受體(PPAR signaling pathway,PPARs)；血小板相關(guān)的通路：血小板激活(platelet activation)；信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)相關(guān)的通路：鈣信號(hào)通路(calcium signaling pathway)、cGMP-PKG信號(hào)通路(cGMP-PKG signaling pathway)、cAMP信號(hào)通路(cAMP signaling pathway)、HIF-1信號(hào)通路(HIF-1 signaling pathway)、血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)；心血管病相關(guān)的通路：心肌細(xì)胞腎上腺素能信號(hào)傳導(dǎo) (adrenergic signaling in cardiomyocytes)；信號(hào)分子相互作用有關(guān)的通路：神經(jīng)活性配體-受體相互作用(neuroactive ligand-receptor interaction)、神經(jīng)遞質(zhì)相關(guān)5-羥色胺能突觸(werotonergic synapse)；內(nèi)分泌相關(guān)的通路：胰島素抵抗(insulin resistance)；炎癥相關(guān)的通路：白細(xì)胞介素17(interleukin 17，IL-17)、腫瘤壞死因子(tumor necrosis factor，TNF)、Toll樣受體(Toll-like receptors，TLR)、NOD樣受體(NOD-like receptor，NLR)、瞬時(shí)受體電位通道(transient receptor potential channel,TRP)的炎癥遞質(zhì)調(diào)節(jié)；糖尿病相關(guān)的通路：糖尿病并發(fā)癥中的AGE-RAGE信號(hào)通路(AGE-RAGE signaling pathway in diabetic complications)；自身免疫相關(guān)的通路：Th17細(xì)胞分化(th17 cell differentiation)；動(dòng)脈粥樣硬化相關(guān)的通路：流體剪切應(yīng)力和動(dòng)脈粥樣硬化(fluid shear stress and atherosclerosis)；肝病相關(guān)的通路：非酒精性脂肪性肝病(non-alcoholic fatty liver disease，NAFLD)。

表1 蓽茇候選成分

表2 蓽茇抗高脂血癥的相關(guān)靶點(diǎn)

A.分子功能分析；B.生物過程分析；C.細(xì)胞組分分析。

表3 蓽茇抗高脂血癥相關(guān)靶點(diǎn)的KEGG 通路富集分析

Tab.3EnrichmentanalysisforKEGGpathwaysofthetargetsofPiperlongumL.againsthyperlipidemia

通路通路ID靶點(diǎn)頻次AMPK信號(hào)通路has04152ACACA,CCNA2, PPARG3鈣信號(hào)通路has04020ADRB1,ADRB2,5 HTR2A,NOS2,NOS3脂肪細(xì)胞的脂解調(diào)節(jié)has04923ADRB1,ADRB2,4 PTGS1,PTGS2神經(jīng)活性配體-受體相互作has04080ADRB1,ADRB2,F2,5 用 HTR2A,PRSS1心肌細(xì)胞中的腎上腺素能信has04261ADRB1,ADRB2,4 號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo) MAPK14,SCN5AcGMP-PKG信號(hào)通路has04022ADRB1,ADRB2,NOS33cAMP信號(hào)通路has04024ACOX1,ADRB1,3 ADRB25-羥色胺能突觸has04726HTR2A,PTGS1,4 PTGS2,SLC6A4HIF-1信號(hào)通路has04066IL-6,NOS2,NOS33胰島素抵抗has04931IL-6,NOS3,PTPN13VEGF信號(hào)通路has04370MAPK14,NOS3,PTGS23IL-17信號(hào)通路has04657MAPK14,IL-1B,IL-6,4 PTGS2AGE-RAGE信號(hào)通路在糖has04933MAPK14,IL-1B,IL-6,4 尿病并發(fā)癥中的作用 NOS3Th17細(xì)胞分化has04659MAPK14,IL-1B,IL-6,4 RXRATNF信號(hào)通路has04668MAPK14,IL-1B,IL-6,4 PTGS2Toll樣受體信號(hào)通路has04620MAPK14,IL-1B,IL-63流體剪應(yīng)力與動(dòng)脈粥樣硬化has05418MAPK14,IL-1B,NOS33非酒精性脂肪性肝病has04932IL-1B,IL-6,RXRA3 (NAFLD)NOD樣受體信號(hào)通路has04621MAPK14,IL-1B,IL-63TRP通道的炎癥遞質(zhì)調(diào)節(jié)has04750MAPK14,HTR2A,IL-1B3PPAR信號(hào)通路has03320ACOX1,PPARG,RXRA3血小板活化has04611MAPK14,NOS3,PTGS13

2.3藥物-靶點(diǎn)-作用通路相互作用的網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建 采用Cytoscape軟件構(gòu)建蓽茇治療高脂血癥的“有效成分-靶點(diǎn)-作用通路”網(wǎng)絡(luò)，見圖2，以不同顏色節(jié)點(diǎn)(node)分別表示活性成分、潛在作用靶點(diǎn)及作用通路，邊(edge)代表活性成分、潛在靶點(diǎn)及作用通路之間的相互關(guān)系，圖2可見蓽茇15個(gè)有效成分直接或間接作用于31個(gè)靶點(diǎn)，由此可知蓽茇多成分、多靶點(diǎn)、多通路治療高脂血癥的特點(diǎn)。其中主要通過干預(yù)AMPK、PPAR等主要通路來達(dá)到降脂作用。

3 討論

蒙醫(yī)學(xué)以 “三根學(xué)說”為理論基礎(chǔ)，即“赫依”“希拉”“巴達(dá)干”三大元素在保持相對(duì)平衡時(shí)，機(jī)體處于健康穩(wěn)定狀態(tài)。若因節(jié)氣、起居、飲食、行為、情志和外傷等外緣使“三根”“七素”和“三種穢物”協(xié)調(diào)被打亂，就會(huì)產(chǎn)生疾病[13]。傳統(tǒng)蒙醫(yī)認(rèn)為，當(dāng)飲食及外界因素之油膩及濕重成分過甚，導(dǎo)致胃之分清食物精濁的功能失調(diào)，肝分清血之清濁功能亦隨之失調(diào)，清濁未分離，導(dǎo)致血中“清濁”失調(diào)[14]?，F(xiàn)代醫(yī)學(xué)指出，高脂血癥是由于外源性脂質(zhì)或其他物質(zhì)攝取增加，內(nèi)源性脂質(zhì)合成增加，以及脂質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)或分解代謝異常。蒙醫(yī)與西醫(yī)關(guān)于高脂血癥的成因觀點(diǎn)類似[15]。蒙醫(yī)認(rèn)為，蓽茇能夠調(diào)理胃火，祛“巴達(dá)干”“赫依”，促進(jìn) “分清別濁”功能，進(jìn)一步調(diào)理由其功能失常所致“血不能分清濁”。

圖2 藥物-靶點(diǎn)-作用通路相互作用網(wǎng)絡(luò)圖

Fig.2Networkofcompounds-targets-pathwaysforPiperlongumL.againsthyperlipidemia

采用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)，通過口服生物利用度和類藥性兩個(gè)關(guān)鍵參數(shù)篩選出15種有效成分，其中主要涉及酰胺類生物堿和揮發(fā)油類成分，其中胡椒堿(piperine)、蓽茇寧(piperlonguminine)等在文獻(xiàn)中明確記載能夠治療高脂血癥。包蘭蘭等[16]研究胡椒堿對(duì)大白鼠血脂水平的影響。結(jié)果表明，胡椒堿可顯著降低血清總膽固醇(TC)，對(duì)血清三酰甘油有一定的降低作用。BAO等[17]研究發(fā)現(xiàn)，蓽茇寧通過調(diào)節(jié)肝脂肪代謝過程，可顯著降低高脂血癥大鼠血清三酰甘油，升高高密度脂蛋白膽固醇。其機(jī)制可能與上調(diào)羥甲基戊二酰輔酶A (hydroxy methylglutaryl coenzyme A reductase inhibitor HMG -CoA)、膽固醇7α-羥化酶(cholesterol 7α-hydroxylase, CYP7A1)、卵磷脂膽固醇脂?；D(zhuǎn)移酶(lecithin-cholesterolacyltransferase，LCAT)、低密度脂蛋白受體(LDLR) 的mRNA及蛋白表達(dá)有關(guān)。

筆者通過有效成分得到蓽茇治療高脂血癥相關(guān)的31個(gè)靶點(diǎn)，采用WebGestalt數(shù)據(jù)庫(kù)和Metascape進(jìn)行GO功能注釋和Pathway通路富集分析，獲得22條間接或直接與治療高脂血癥相關(guān)的通路。通過構(gòu)建蓽茇治療高脂血癥的“有效成分-靶點(diǎn)-作用通路”網(wǎng)絡(luò)圖，分析其中包括與脂質(zhì)代謝相關(guān)、血小板聚集相關(guān)的通路為主要通路，從側(cè)面說明了蓽茇“分清別濁”功能可能通過主要成分與上述靶點(diǎn)相互作用，進(jìn)而調(diào)控與脂質(zhì)代謝和血小板聚集相關(guān)通路來實(shí)現(xiàn)，但進(jìn)一步作用機(jī)制有待后續(xù)研究進(jìn)一步說明。