黃梅會(huì)，吳 華，王旭明

(海南省人民醫(yī)院檢驗(yàn)科，海南 ?？?570311)

非結(jié)核分枝桿菌(nontuberculous mycobacteria，NTM)是指除結(jié)核分枝桿菌(Mycobacteriumtuberculosis，MTB)復(fù)合群和麻風(fēng)分枝桿菌外的分枝桿菌，分為快速生長(zhǎng)分枝桿菌(rapidly growing mycobacteria，RGM)和緩慢生長(zhǎng)分枝桿菌兩大類，RGM是指7 d內(nèi)在固體培養(yǎng)基上形成成熟菌落的一類分枝桿菌。RGM可存在于自來(lái)水、飲用水、醫(yī)療配水系統(tǒng)、淋浴噴頭或其他物體表面，醫(yī)療設(shè)備或材料被其污染的水污染可導(dǎo)致醫(yī)院感染[1]。隨著各種先進(jìn)醫(yī)學(xué)診療手段的出現(xiàn)，各種侵入性手術(shù)、人工材料植入人體以及各種抗菌藥物和免疫抑制劑使用頻率的增加，該菌引起的感染越來(lái)越多。RGM感染的主要臨床表現(xiàn)為肺炎、淋巴結(jié)炎、皮膚軟組織感染及播散性疾病，由該類細(xì)菌引起的血流感染較為少見(jiàn)。不同菌種的RGM其藥物敏感模式不同[2]，合理的經(jīng)驗(yàn)性用藥較不合適的經(jīng)驗(yàn)性用藥治愈率高(83.3% vs 42.98%)[3]。因此，快速、準(zhǔn)確的菌種鑒定對(duì)RGM敗血癥的診斷及治療有著重要的臨床意義。本研究利用基質(zhì)輔助激光解析電離飛行時(shí)間質(zhì)譜(MALDI-TOF MS)技術(shù)對(duì)2016—2017年海南省人民醫(yī)院血培養(yǎng)分離的5株RGM菌株進(jìn)行快速鑒定，并分析其臨床特征。

1 資料與方法

1.1 病歷資料

1.1.1 病例1 男性患者，69歲。患者2016年1月開(kāi)始出現(xiàn)畏寒、發(fā)熱，體溫峰值39 ℃，發(fā)熱無(wú)明顯規(guī)律，在外院經(jīng)治療后體溫可恢復(fù)正常，因仍反復(fù)發(fā)熱于2016年4月11日入院。入院查體：體溫37.8℃，雙下肺呼吸音低，未聞及干濕性啰音。心腹無(wú)異常，雙下肢中度水腫。既往于2012年行主動(dòng)脈瓣置換術(shù)。輔助檢查(2016年4月12日)：血常規(guī)白細(xì)胞4.80×109/L，C反應(yīng)蛋白(CRP)54.54 mg/L，血沉70 mm/h。

1.1.2 病例2 男性患者，74歲。患者在住院期間(2017年6月8日—7月21日)因咽癌食管癌化學(xué)治療(化療)后第7天(2017年7月2日)出現(xiàn)發(fā)熱，體溫峰值40.3 ℃，伴腹脹、腹瀉。查體：左頸部可觸及腫大淋巴結(jié)，大小約2.5 cm×2.5 cm，質(zhì)地硬，活動(dòng)較差，心肺腹未見(jiàn)異常。輔助檢查：2017年7月5日血常規(guī)白細(xì)胞17.71×109/L，中性粒細(xì)胞百分比82.8%，2017年7月11日CRP 191.37 mg/L。

1.1.3 病例3 男性患者，11個(gè)月23 d。入院前1周出現(xiàn)發(fā)熱，體溫峰值39.2 ℃，熱型不規(guī)則，偶有咳嗽，呈非痙攣性咳，痰不易咳出。先后給予頭孢克肟、頭孢硫脒抗感染，因仍反復(fù)發(fā)熱于2017年12月27日入院。查體：精神稍疲倦，雙肺呼吸音粗，可聞及少許痰鳴音。輔助檢查：2017年12月22日門(mén)診血常規(guī)白細(xì)胞25.4×109/L，中性粒細(xì)胞百分比60.9%。入院當(dāng)日血常規(guī)白細(xì)胞5.97×109/L，中性粒細(xì)胞百分比27.3%，血沉26.0 mm/h，2017年12月29日白介素6 221.0 pg/mL。

1.1.4 病例4 男性患者，3歲8個(gè)月。入院20天前出現(xiàn)發(fā)熱，體溫峰值39℃，伴有陣發(fā)性咳嗽、流涕。院外不規(guī)則給予美洛西林、阿奇霉素、哌拉西林/舒巴坦治療，因門(mén)診血培養(yǎng)分離出RGM于2017年12月12日入院。查體：雙肺呼吸音粗，可聞及少許水泡音。輔助檢查：外院血常規(guī)(2017年11月25日)白細(xì)胞13.59×109/L，中性粒細(xì)胞百分比65.3%，入院當(dāng)日復(fù)查血常規(guī)白細(xì)胞6.42×109/L，中性粒細(xì)胞百分比61.1%，2017年12月13日血沉21 mm/h，2017年12月17日復(fù)查血培養(yǎng)陰性。

1.1.5 病例5 男性患者，93歲?；颊咭蛘`吸引起吸入性肺炎于2015年4月3日入院，長(zhǎng)期臥床、胃造瘺術(shù)后狀態(tài)、中心靜脈置管，基礎(chǔ)疾病為腦梗死、血管性癡呆、冠心病。2016年2月13日開(kāi)始出現(xiàn)間斷低熱，最高體溫38.3℃，未予抗菌藥物治療。感染進(jìn)行性加重，2016年2月29日出現(xiàn)高熱，體溫峰值40℃，呼吸急促。查體：呼吸23次/分，心率137次/分，BP 113/56 mmHg，SPO298%。雙肺呼吸音粗，可聞及少許散在濕性啰音。2016年3月1日輔助檢查：血常規(guī)白細(xì)胞49.6×109/L，中性粒細(xì)胞百分比81.3%，CRP 147.57 mg/L，痰及尿培養(yǎng)：銅綠假單胞菌。

1.3 RGM實(shí)驗(yàn)室鑒定

1.3.1 血培養(yǎng) 5株RGM分離自上述患者血標(biāo)本，幼兒采集全血1～2 mL，成人8～10 mL直接注入血培養(yǎng)瓶，依照血培養(yǎng)儀操作手冊(cè)置血培養(yǎng)儀中培養(yǎng)。

1.3.2 VITEK MS質(zhì)譜鑒定 分枝桿菌預(yù)處理(梅里埃試劑盒)：用1 μL接種環(huán)取滿環(huán)菌加入含有0.5 mm的玻璃珠和500 μL 70%乙醇的1.5 mL微量離心管，置振蕩器渦旋震蕩15 min，室溫靜置10 min滅活，渦旋震蕩混勻并將全部液體轉(zhuǎn)移至圓底無(wú)色空離心管中。12 000 g離心2 min，吸出所有上清丟棄(用加樣器在沉淀物對(duì)側(cè)盡可能吸出所有乙醇丟棄，如有極少量殘余乙醇，可待其自然揮發(fā)，否則殘余乙醇會(huì)干擾蛋白提取并稀釋甲酸，影響檢測(cè)效果)。加入10 μL甲酸，渦旋震蕩充分混勻沉淀。加10 μL乙腈，渦旋震蕩充分混勻沉淀。12 000 g離心2 min。立即取1 μL上清涂靶板，待完全干燥后加1 μL CHCA基質(zhì)液形成結(jié)晶，待干燥后上機(jī)檢測(cè)。

1.3.3 16s rRNA測(cè)序 復(fù)蘇菌株送往華大基因有限公司進(jìn)行16s rRNA測(cè)序鑒定。

2 結(jié)果

2.1 治療及轉(zhuǎn)歸

2.1.1 病例1 患者入院后仍反復(fù)發(fā)熱，體溫峰值38.3℃。第5天出現(xiàn)咳嗽、咳白痰。第8天出現(xiàn)大小便失禁(1次)、頭痛、反應(yīng)遲鈍、心率快(124 次/分)，血培養(yǎng)分離出RGM，考慮顱內(nèi)高壓、敗血癥，給予甘露醇、呋塞米脫水，異煙肼、利福平、乙胺丁醇、吡嗪酰胺、阿奇霉素抗感染。第10天出現(xiàn)頭暈、乏力、胸悶、氣促，骨髓培養(yǎng)分離出RGM，停用阿奇霉素，加用利奈唑胺。第13天突發(fā)心跳、呼吸驟停，病情急劇惡化，自動(dòng)出院。共抗分枝桿菌治療5 d。隨訪患者死亡。

2.1.2 病例2 經(jīng)驗(yàn)性給予左氧氟沙星治療2 d，效果欠佳，改為頭孢哌酮/他唑巴坦治療4 d。化療后第10天，血培養(yǎng)分離出RGM，改為異煙肼、利福平、乙胺丁醇、吡嗪酰胺、亞胺培南抗感染8 d，好轉(zhuǎn)出院。出院后繼續(xù)口服抗分枝桿菌藥滿4個(gè)月，未再?gòu)?fù)發(fā)。

2.1.3 病例3 給予頭孢哌酮/他唑巴坦治療2 d，療效欠佳，入院第6天血培養(yǎng)分離出RGM，改為阿奇霉素抗感染治療5 d好轉(zhuǎn)出院。出院后繼續(xù)口服阿奇霉素滿4周，未再?gòu)?fù)發(fā)。

2.1.4 病例4 2017年12月12日門(mén)診血培養(yǎng)分離出RGM，入院后給予頭孢哌酮/他唑巴坦聯(lián)合阿奇霉素治療10 d好轉(zhuǎn)出院。出院后繼續(xù)口服阿奇霉素4周左右，未再?gòu)?fù)發(fā)。

2.1.5 病例5 2016年2月28日開(kāi)始給予頭孢哌酮/舒巴坦聯(lián)合利奈唑胺治療。2016年2月29日患者病情急劇惡化，從氣道吸出腸內(nèi)營(yíng)養(yǎng)物，血壓及血氧飽和度進(jìn)行性下降，尿量進(jìn)行性減少，雙肺可聞及大量哮鳴音，出現(xiàn)多器官功能衰竭，2016年3月2日，患者死亡。2016年3月1日送血培養(yǎng)，3月10日結(jié)果回報(bào)分離出RGM。

2.2 RGM鑒定

2.2.1 RGM生物學(xué)特征 5例患者血培養(yǎng)報(bào)警時(shí)間為2～5 d，血培養(yǎng)直接涂片革蘭染色可見(jiàn)紅色背景下菌體著色不均勻，形態(tài)不規(guī)則，部分菌體呈藍(lán)色，部分菌體為粉紅色，均可見(jiàn)鏈狀排列的異染顆粒。陽(yáng)性血培養(yǎng)轉(zhuǎn)種血平板，培養(yǎng)24～48 h血平板可見(jiàn)針尖大小菌落，3～5 d可見(jiàn)圓形、凸起、濕潤(rùn)或干燥的菌落。菌落革蘭染色后，菌體為革蘭陽(yáng)性，呈半透明，大小略長(zhǎng)于MTB，細(xì)長(zhǎng)直或微彎曲，有的呈梭形，粗細(xì)不一，有時(shí)有分支。菌體內(nèi)含有1個(gè)至多個(gè)異染顆粒，1個(gè)顆粒多在菌體一端或中部，培養(yǎng)一周后再染色，可見(jiàn)位于頂端的顆粒膨大至菌體兩倍，似火柴頭樣；多個(gè)異染顆?？砂创闃优帕兄琳麄€(gè)菌體。菌體抗酸染色大部分菌體呈藍(lán)色，少部分菌體為粉紅色或紅色。

2.2.2 VITEK MS質(zhì)譜鑒定 5株菌分別為馬德里分枝桿菌、膿腫分枝桿菌、產(chǎn)黏液分枝桿菌各1株，偶發(fā)分枝桿菌群2株。

2.2.3 16s rRNA鑒定 5株菌分別為馬德里分枝桿菌、膿腫分枝桿菌、產(chǎn)黏液分枝桿菌、偶發(fā)分枝桿菌、豬分枝桿菌各1株。

3 文獻(xiàn)綜述

應(yīng)用PubMed、中國(guó)知網(wǎng)(CNKI)、萬(wàn)方數(shù)據(jù)庫(kù)等檢索工具檢索近5年國(guó)內(nèi)外診斷明確、資料較完整的RGM菌血癥病例報(bào)道15例，其中國(guó)內(nèi)3例、國(guó)外12例，另加該院5例確診病例共20例。見(jiàn)表1。

表1 20例RGM菌血癥病例資料匯總

N：文獻(xiàn)未記載；ICD: 植入式心律轉(zhuǎn)復(fù)除顫儀；PCR-RFLP：PCR-限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性；16號(hào)患者失訪2個(gè)月后因院外未佩戴除顫儀引起心臟驟停致死

4 討論

RGM菌血癥的臨床癥狀缺乏特異性，診斷困難，且對(duì)常規(guī)一線抗結(jié)核藥高度耐藥導(dǎo)致治療困難，開(kāi)展快速而準(zhǔn)確的菌種鑒定對(duì)患者的診療非常重要。RGM鑒定的方法主要有傳統(tǒng)的細(xì)菌學(xué)技術(shù)、高效液相色譜法(HPLC)和分子生物學(xué)方法。傳統(tǒng)細(xì)菌學(xué)技術(shù)耗時(shí)長(zhǎng)、效率低，而高效液相色譜法雖然可以直接用于鑒定RGM，但是不能鑒別新的RGM菌種[19]。常用的分子生物學(xué)方法如16s rRNA操作要求相對(duì)較高，耗時(shí)長(zhǎng)，而且需要特殊的儀器，無(wú)法在普通實(shí)驗(yàn)室普及。隨著RGM在世界范圍分離率的提高，急需尋找迅速、準(zhǔn)確的鑒定方法進(jìn)行日常鑒定。MALDI-TOF MS對(duì)RGM的檢測(cè)簡(jiǎn)便、快速、通量高，操作相對(duì)不復(fù)雜，可用于普通實(shí)驗(yàn)室。本研究以16s rRNA為標(biāo)準(zhǔn)，利用MALDI-TOF MS技術(shù)對(duì)5株RGM菌株進(jìn)行菌種鑒定，結(jié)果顯示，MALDI-TOF MS技術(shù)對(duì)大部分菌株均能準(zhǔn)確鑒定到種，對(duì)偶發(fā)分枝菌僅能鑒定到群，而無(wú)法準(zhǔn)確鑒定到種。鑒于VITEK MS質(zhì)譜的特殊性，可將已經(jīng)準(zhǔn)確鑒定的偶發(fā)分枝桿菌和豬分枝桿菌加入到數(shù)據(jù)庫(kù)中，為今后更好的鑒定RGM提供數(shù)據(jù)資料。

大多數(shù)RGM血流感染為導(dǎo)管相關(guān)性，最常見(jiàn)于惡性腫瘤等免疫力低下人群，最多見(jiàn)的分枝桿菌為產(chǎn)黏液分枝桿菌和偶發(fā)分枝桿菌。表2匯總的20例病例中，5例檢出產(chǎn)黏液分枝桿菌[9-12]，6例檢出偶發(fā)分枝桿菌[13-17]，占總病例數(shù)的55%。20例病例中7例為導(dǎo)管相關(guān)感染[10-13, 15，18]，其致病菌分別為產(chǎn)黏液分枝桿菌(3例)、偶發(fā)分枝桿菌(3例，其中1例為偶發(fā)分枝桿菌群豬分枝桿菌種)、恥垢分枝桿菌(1例)；6例為惡性腫瘤化療后(30%)[8, 11, 14-15, 17]。大多數(shù)產(chǎn)黏液分枝桿菌對(duì)氨基糖苷類、喹諾酮類、磺胺類、頭孢西丁、克拉霉素、亞胺培南、阿奇霉素敏感，最常用的抗菌藥物為阿米卡星+克拉霉素[9-12]。偶發(fā)分枝桿菌大多對(duì)喹諾酮類及大環(huán)內(nèi)酯類藥物敏感，但其可能存在紅霉素核糖體甲基化酶基因(erm基因)可誘導(dǎo)大環(huán)內(nèi)酯類藥物產(chǎn)生耐藥[20]。《2012年非結(jié)核分枝桿菌診斷與治療專家共識(shí)》[2](以下簡(jiǎn)稱“共識(shí)”)推薦采用2種敏感抗菌藥物，喹諾酮類、利福平或利福噴丁和克拉霉素或阿米卡星。該院產(chǎn)黏液分枝桿菌及偶發(fā)分枝桿菌病例均為幼兒患者，癥狀較輕，可能與這兩種菌的毒力較低有關(guān)。“共識(shí)”提出新大環(huán)內(nèi)酯類中克拉霉素和阿奇霉素是近20年來(lái)治療NTM最重要的新藥[2]，兩例患者均使用阿奇霉素抗分枝桿菌治療，治療效果較好。

豬分枝桿菌引起的血流感染國(guó)內(nèi)外均未見(jiàn)相關(guān)報(bào)道，但該菌為偶發(fā)分枝桿菌群的一員，可遵循偶發(fā)分枝桿菌治療原則進(jìn)行治療。該院病例5為長(zhǎng)期中心靜脈置管的臥床患者，高齡，基礎(chǔ)疾病多，免疫力低，在呼吸道及泌尿道感染的基礎(chǔ)上并發(fā)豬分枝桿菌敗血癥導(dǎo)致患者在短期內(nèi)病情急劇惡化，最終因嚴(yán)重的感染性休克并發(fā)多器官功能衰竭死亡。

膿腫分枝桿菌通常發(fā)生于注射受污染品、使用受污染的設(shè)備或材料進(jìn)行侵入性操作、惡性腫瘤化療等免疫力低下患者。本研究3例膿腫分枝桿菌感染患者中，1例疑為通過(guò)醫(yī)療設(shè)備感染[7]，2例為惡性腫瘤化療后的免疫力低下患者[8]。該菌通常對(duì)克拉霉素、阿米卡星、頭孢西丁、亞胺培南和利奈唑胺敏感，“共識(shí)”推薦將上述藥物作為治療該菌的關(guān)鍵藥物[2]。雖然體外藥敏試驗(yàn)顯示，大多NTM對(duì)一線抗結(jié)核藥高度耐藥，該院膿腫分枝桿菌患者使用抗結(jié)核藥聯(lián)合亞胺培南治療后病情明顯好轉(zhuǎn)，說(shuō)明抗結(jié)核藥在患者體內(nèi)也可能會(huì)產(chǎn)生一定的作用。

“共識(shí)”缺乏RGM血流感染的專業(yè)指導(dǎo)，治療主要以臨床經(jīng)驗(yàn)為主，尚未確定最佳治療方案。RGM可附著于人工材料、導(dǎo)管等物體表面形成保護(hù)性生物膜而成為感染灶不易被常用抗菌藥物去除，文獻(xiàn)[1,9,13,15]報(bào)道未及時(shí)將感染灶移除患者較及時(shí)移除患者復(fù)發(fā)率高。因此，建議及時(shí)清除感染灶，避免治療失敗及感染復(fù)發(fā)。美國(guó)胸科學(xué)會(huì)和美國(guó)傳染病學(xué)會(huì)推薦應(yīng)給予兩種以上敏感抗菌藥物進(jìn)行治療[15]，Rodriguez-Coste等[3]證實(shí)使用至少兩種抗菌藥物治療的患者，其轉(zhuǎn)歸較好。該院馬德里分枝桿菌感染患者高齡，病史長(zhǎng)(>3個(gè)月)，未能在較短時(shí)間進(jìn)行敏感抗菌藥物治療并移除感染的人工心臟瓣膜，導(dǎo)致患者出現(xiàn)嚴(yán)重的感染性休克并發(fā)多器官功能衰竭而死亡。

近年來(lái)，RGM感染的病例逐年增加，特別是既往RGM敗血癥多為單個(gè)病例報(bào)道，而本研究在短短1年內(nèi)即發(fā)生5例RGM敗血癥，而且其中2例患者死亡，需要引起實(shí)驗(yàn)室和臨床醫(yī)生的重視。本研究結(jié)合文獻(xiàn)報(bào)道的15例RGM敗血癥病例，分析國(guó)內(nèi)外RGM血流感染的現(xiàn)狀，以協(xié)助微生物工作人員和臨床醫(yī)生進(jìn)一步認(rèn)識(shí)不同菌種RGM引起敗血癥的臨床特征，幫助臨床更好、更迅速的診斷和治療，減輕患者的痛苦及經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)，挽救患者生命。

致謝：感謝海南省人民醫(yī)院兒科符彬莎醫(yī)生對(duì)本論文的幫助！