周猛 梁園園 曲晨菲 翟藝 張濤 亓文倩 張競競 岳啟安

臨床上發(fā)生面頸部頑固性細菌感染的患者以青少年多見，該病對藥物耐藥性較強，易反復感染，缺乏理想的治療方法，嚴重影響青少年的身心健康。我們首次在臨床上使用多價葡萄球菌菌苗治療1 195 例面頸部頑固性細菌感染患者，一次性治愈率可達75%左右，具有較理想的治療效果[1]。為探討該藥物的作用機理，本研究分析多價葡萄球菌菌苗對小鼠白細胞介素-2 受體（IL-2R）、腫瘤壞死因子受體（TNF-αR）基因表達及血清IL-2 水平的影響，現(xiàn)報道如下。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑 PCR 儀（TC-XP，博日科技），凝膠成像系統(tǒng)（Tanon-1600R，上海天能），低溫離心機（Neofuge 13R，上海力申），-80℃超低溫冰箱（海爾），酶標儀DNM-9602A（北京普朗新技術有限公司）。多價葡萄球菌菌苗[2～4]；RNA 提取與基因擴增試劑盒購于上海生工；檢測小鼠IL-2 的ELISA 試劑盒購于青島捷世康公司；SD 昆明種小鼠購于青島市藥檢所。

1.2 小鼠動物試驗 隨機選取健康SD 昆明種小白鼠40 只，體重22～24g，隨機分成4 組，雌雄混合，放飼養(yǎng)籠內(nèi)單獨飼養(yǎng)，喂養(yǎng)標準特制的混合飼料，并供應充足的自來水。分為對照組、低劑量組（5 億個/ml 細菌）、中劑量組（10 億個/ml 細菌）、高劑量組（20 億個/ml 細菌），每組10 只小白鼠，小白鼠腹腔內(nèi)無菌注射，實驗組按不同組別每只每次注射1ml菌液，正常對照組每只每次注射生理鹽水1ml。注射療程：1、3、6、9、14日為全療程，最后一次于第14天實驗前1h 每組先注射無菌肉湯1ml，再注射細菌1ml（中劑量），并輕柔腹部，注射30min 后以頸動脈放血方法處死。用小剪刀剪開腹部，再用無菌小剪刀將小鼠脾臟和肝臟剪除，放電子天平的無菌玻璃紙上稱重，然后放-80℃超低溫冰箱保存。

1.3 RNA 提取 取脾臟組織塊（30～50mg）在玻璃勻漿器中研磨粉碎，將玻璃勻漿器加入1ml Trizol 抽打勻漿，移入1.5ml 離心管，用5ml 針頭抽打，冰上放置5min，放置4℃離心機，12 000r/min 離心5min。取上清液至1.5ml 新離心管，加0.2ml 氯仿，震蕩，冰上孵育5min，＜12 000r/min，4℃離心10min，取上清液移入1.5ml 新離心管，加0.5ml 異丙醇，震蕩，＜12 000r/min，4℃離心5min，棄去上清液，加入1ml 75%乙醇，震蕩，＜7 500r/min，4℃離心5min，棄去上清液，室溫下使之變透明，加入DEPC 水20μl 溶解RNA（放低溫冰箱保存）。

1.4 小鼠脾臟 IL-2R、TNF-αR 基因擴增

1.4.1 RNA 逆轉錄合成cDNA 將1μg RNA 與1μl Oligo（dT）18 引物混合，65℃ 10min，冰浴1～2min，加入4μl 5×buffer、1μl dNTP（2.5mM）、Rnasin 1μl、逆轉錄酶0.5μl（20μl）、去離子水15.5μl。將上述反應體系在42℃溫育60min，進行cDNA 的合成，70℃ 5min 滅活逆轉錄酶，冰浴4min，-20℃保存。

1.4.2 PCR 擴增 設計IL-2R 和TNF-αR 編碼基因的引物序列，IL-2R 上游引物：5'-AACGGCACCATC CTAAACTG-3'；IL-2R 下游引物：5'-ACACTCTGTC CTTCCACGAAA-3'；TNF-αR 上游引物：5'-GTTGT CAATTGCTGCCCTGT-3'；TNF-αR 下游引物：5'-T AATTTGCAAGCGGAGGAG-3'；β-actin 上游引物：5'-CGTGTTCCTACCCCCAATGT-3'；β-actin下游引物：5'-TGTCATCATACTTGGCAGGTTTCT-3'。cDNA模板2μl加入10×buffer 5μl、1～4μl dNTP（2.5mM）、3μl MgCl2（25mM）、上游引物0.5μl、下游引物0.5μl、Taq 酶0.2μl（5μl）、加去離子水補至50μl。在50μl的PCR 體系中加入石蠟油30～50μl，將反應管置于PCR 儀內(nèi)，按下列條件進行PCR 反應：94℃預變性5min，然后94℃變性30s、54℃退火30s、72℃延伸30s，共進行42 個循環(huán)。擴增結束后，用電泳儀測定PCR 擴增產(chǎn)物，用凝膠成像系統(tǒng)測定電泳產(chǎn)物條帶及產(chǎn)物含量。

1.5 用ELISA 法測定血清中IL-2 含量 免疫結束后，以無菌法分別取各組血液于無菌試管中，待血液凝固后2 000r/min 離心10min，取血清放低溫冰箱保存，按照ELISA 試劑盒說明書用酶標儀測定IL-2 的含量。

1.6 統(tǒng)計學分析 應用SPSS 16.0 統(tǒng)計學軟件進行數(shù)據(jù)分析，計量資料以±s表示，兩組樣本間比較采用t檢驗。以P＜0.05 為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 多價葡萄球菌菌苗對小鼠脾臟重量的影響 低劑量組、中劑量組和高劑量組與對照組比較，小鼠脾臟重量差異均有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），最佳劑量組為中劑量組，而低劑量組和高劑量組不但沒有增加脾重，反而抑制了脾重，見表1。

表1 多價葡萄球菌菌苗對小鼠脾臟重量的影響（±s）

表1 多價葡萄球菌菌苗對小鼠脾臟重量的影響（±s）

注：各劑量組分別與對照組比較

組別 數(shù)量（只） 脾重（g） t P對照組 10 0.052±0.011低劑量組 10 0.035±0.001 -3.89 ＜0.05中劑量組 10 0.498±0.068 22.63 ＜0.05高劑量組 10 0.030±0.003 -5.429 ＜0.05

2.2 多價葡萄球菌菌苗對小鼠脾臟IL-2R 基因表達的影響 低劑量組、中劑量組和高劑量組與對照組比較，小鼠脾臟IL-2R 基因表達水平差異均有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），而中劑量組與低劑量組和高劑量組比較，差異也有統(tǒng)計學意義（t=34.20，P＜0.05；t=31.97，P＜0.05），以中劑量組效果最佳，見表2。

表2 多價葡萄球菌菌苗對小鼠脾臟IL-2R 基因表達的影響（±s）

表2 多價葡萄球菌菌苗對小鼠脾臟IL-2R 基因表達的影響（±s）

注：各劑量組分別與對照組比較

組別 數(shù)量（只） 灰值 t P對照組 10 1.54±0.03低劑量組 10 5.63±0.09 20.38 ＜0.05中劑量組 10 13.09±0.14 33.36 ＜0.05高劑量組 10 4.40±0.14 24.48 ＜0.05

2.3 多價葡萄球菌菌苗對小鼠脾臟TNF-αR 基因表達的影響 低劑量組、中劑量組和高劑量組與對照組比較，小鼠脾臟TNF-αR 基因表達水平差異均有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），而中劑量組與低劑量組和高劑量組比較，差異也有統(tǒng)計學意義（t=47.96，P＜0.05；t=30.88，P＜0.05），以中劑量組效果最佳，見表3。

表3 多價葡萄球菌菌苗對小鼠脾臟 TNF-αR 基因表達的影響（±s）

表3 多價葡萄球菌菌苗對小鼠脾臟 TNF-αR 基因表達的影響（±s）

注：各劑量組分別與對照組比較

組別 數(shù)量（只） 灰值 t P對照組 10 1.50±0.10低劑量組 10 8.33±0.27 8.44 ＜0.05中劑量組 10 13.87±0.40 113.78 ＜0.05高劑量組 10 9.71±0.39 76.24 ＜0.05

2.4 多價葡萄球菌菌苗對小鼠血清中IL-2 含量的影響 低劑量組、中劑量組和高劑量組與對照組比較，小鼠血清中IL-2 含量差異均有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），中劑量組與低劑量組和高劑量組比較，差異也有統(tǒng)計學意義（t=3.76，P＜0.05；t=7.14，P＜0.05），以中劑量組效果最佳，見表4。

表4 多價葡萄球菌菌苗對小鼠血清IL-2 含量的影響（±s，ng/ml）

表4 多價葡萄球菌菌苗對小鼠血清IL-2 含量的影響（±s，ng/ml）

注：各劑量組分別與對照組比較

組別 數(shù)量（只） IL-2 含量 t P對照組 10 0.25±0.03低劑量組 10 0.34±0.03 10.28 ＜0.05中劑量組 10 0.36±0.03 15.65 ＜0.05高劑量組 10 0.29±0.02 4.44 ＜0.05

3 討論

面頸部頑固性細菌感染多由耐藥性葡萄球菌感染引起，由于多數(shù)致病性的葡萄球菌產(chǎn)生血漿凝固酶，使感染局部周圍的血漿發(fā)生凝固，藥物不易滲透到炎癥內(nèi)部，使局部或全身性抗生素治療效果不佳。在之前的研究中我們使用多價、不同比例、高濃度葡萄球菌菌苗對1 195 例頑固性頭頸部感染性皮膚病患者進行治療，40d 為1 個療程，一次性治愈率達到75%左右，有效率達到95%以上，獲得了較理想的治療效果，深受青少年患者的歡迎[2～4]。經(jīng)多價葡萄球菌菌苗治療后效果明顯而持久，無明顯副作用。為探討該藥物的作用機理，本研究采用不同劑量的多價葡萄球菌菌苗免疫小鼠后，檢測小鼠脾臟重量，脾臟IL-2R、TNF-αR 基因表達及血清IL-2 含量的變化。經(jīng)過免疫后的3 個實驗組中，脾臟增重、IL-2R、TNF-αR 基因表達和血清中IL-2 濃度都以中劑量效果最顯著，中劑量組與其他各劑量組比較差異均有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），顯示具有明顯的劑量依賴關系。Th1 細胞主要介導細胞毒性和局部炎癥有關的免疫應答，參與細胞免疫及遲發(fā)型超敏性炎癥的發(fā)生，通過分泌IL-2 細胞因子促進Th1 細胞進一步增殖。因此，IL-2 在血清中含量增多，可以誘導活化T 細胞、NK 細胞的增殖與分化，增強TC、NK 細胞和吞噬細胞的活性，更有利于清除局部感染的病原菌，加快局部組織的修復[5～8]。同時IL-2 可作為治療腫瘤的輔助藥物[9～11]，提高人體免疫力，增強對腫瘤細胞的殺傷能力。TNF-α是單核巨噬細胞分泌的一種細胞因子，除了具有抗腫瘤作用外，可在局部誘發(fā)炎癥作用和免疫調(diào)節(jié)作用，吸引中性粒細胞到炎癥局部，增強吞噬細胞的吞噬作用[12]。

本研究表明，多價葡萄球菌菌苗治療面頸部頑固性細菌感染，主要是增強了T 細胞介導的細胞免疫，通過增加血清IL-2 含量和脾臟IL-2R 基因的表達，更有利于刺激T 細胞的進一步活化，產(chǎn)生更多的IL-2 釋放到體液中，提高了吞噬細胞的殺傷活性。TNF-αR 基因的表達可增強單核吞噬細胞分泌TNF-α細胞因子，誘發(fā)局部的炎癥反應和免疫調(diào)節(jié)作用，吸引中性粒細胞到炎癥局部，從而可以明顯增強小鼠的細胞免疫功能，提高炎癥局部的吞噬細胞數(shù)量和增強吞噬細胞的吞噬功能，最終起到抗感染的作用。