王鳳娟，夏曉雨，張 娜，符 群，郭慶啟，3

（1.東北林業(yè)大學 林學院，黑龍江 哈爾濱 150040；2.哈爾濱商業(yè)大學 食品工程學院，黑龍江 哈爾濱 150076；3.黑龍江省森林食品資源利用重點實驗室，黑龍江 哈爾濱 150040）

紅松屬于長青喬木，其堅果通常長9～12 mm，含油量高。紅松籽油本身營養(yǎng)價值豐富，其脂肪酸含量高達70%左右，其中含有50%多不飽和脂肪酸（PUFA），40%單不飽和脂肪酸（MUFAs）和10%飽和脂肪酸（SFAs）。《本草綱目》記載：“松仁味溫，味甘，無毒，主治關節(jié)風濕，頭眩，潤五臟，逐風痹寒風，補體虛，滋潤皮膚，久服輕身不老”。現(xiàn)代研究表明紅松籽油具有調節(jié)血脂[1]、抗氧化[2]、抗炎[3]、減肥[4]等功能。

隨著現(xiàn)代高新工程技術的發(fā)展，酶輔助提取法[5]、超臨界CO2萃取[6]以及超聲波技術[7]等正逐漸的應用于油脂工業(yè)中。但酶輔助提取法提取油脂需進行破乳且油脂與蛋白質不易分離，酶制劑價格昂貴，應用于工業(yè)生產有一定的局限性。超臨界CO2萃取技術得率高，但提取周期長，設備一次性投資較高。超聲波提取技術具有節(jié)約溶劑、簡化提取步驟、提高有效成分得率等優(yōu)點。大多數(shù)功能性食品有效成分具有熱敏性，減壓條件下容器內氣壓低，溶劑分子間分子鏈的能量減少，沸點降低。同時超聲波可改變物質介質形態(tài)，加速化學反應和觸發(fā)新的反應通道[8]?？栈饔眉哟蠓肿娱g的加速度及其對分子鏈和細胞壁的作用[9]，因此將減壓技術與超聲波提取技術聯(lián)用可以更有效的提高目標物質得率。近年來，減壓耦合超聲技術廣泛應用于丹參、茶多酚的研究中[10-11]，但應用于紅松籽油未見報道。

本試驗旨在研究減壓-超聲波聯(lián)用提取紅松籽油單因素的基礎上，采用提取動力學反映不同超聲波功率在不同時間條件下對紅松籽油提取效果的影響[12]，并采用OriginPro 8 軟件將不同多項式方程與動力學提取過程進行模型擬合，對最佳方程模型進行試驗驗證。通過氣相色譜-質譜聯(lián)用技術（GC-MS）檢測減壓-超聲波聯(lián)用提取的紅松籽油脂肪酸組成并測定抗氧化活性，為紅松籽油的提取和工業(yè)化規(guī)模生產提供理論基礎。

1 材料與方法

1.1 試劑與儀器

試劑：1，1- 二苯基-2- 三硝基苯肼（1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl，DPPH）（≥98%），購于Sigma 公司；2，2-聯(lián)氮-雙-3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸（2,2’-azino-bis-3-ethylbenzothiazoline-6-sulfoniic acid，ABTS）（≥98%），購于Sigma公司；所用化學試劑均為分析純。

試驗儀器：7890-5973N 型氣質聯(lián)用儀（GCMS），美國Agilent 公司；UV-5500PC 紫外可見分光光度計，上海元析儀器有限公司；高功能粉碎機，天津泰斯特儀器有限公司；RE-2000A 旋轉蒸發(fā)器，鞏義市予華儀器有限公司；DL-6M離心機，湖南星科科學儀器有限公司。減壓-超聲波聯(lián)用裝置為實驗室自制，其中超聲波清洗機型號為SB25-12 DTD，寧波新芝生物科技股份有限公司制造；SHB-IIIG 真空泵，鄭州長城科工有限公司制造。

1.2 試驗方法

1.2.1 原料預處理

紅松籽產自黑龍江省伊春市，將種籽剝去外殼及種皮后在60 ℃烘干至恒重（質量差＜0.002 g），粉碎過80 目篩。處理后的紅松籽粉裝入密封袋，4 ℃條件下保存?zhèn)溆?。經測定其水分含量為6.52%，粗脂肪含量為68.76%。

1.2.2 理化性質測定方法

水分，GB/T 50093—2016；粗脂肪，GB/T 5512—2008；酸值，GB/T 5009.229—2016；碘值，GB/T 5532—2008；皂化值，GB/T 5534—2008；過氧化值，GB/T 5009.227—2016。

1.2.3 紅松籽油脂肪酸組成測定

紅松籽油甲脂化按照GB/T 17376—2008 方法進行；

色譜分析條件：DB-5MS 石英毛細柱色譜柱（30 m×250 μm×0.25 μm）；柱升溫程序：初溫60 ℃，以10 ℃/min 升至270 ℃，保留5 min，再以8 ℃/min 升至300 ℃，保留8 min；進樣口溫度270 ℃，色譜-質譜接口溫度260 ℃；載氣:氦氣；載氣流量：1.0 mL/min；用于電子沖擊的電離能量70 eV；質量范圍50～550m/z；氣質分析結果與數(shù)據庫檢索比對，確定各峰代表的物質，并根據峰面積計算每個成分的相對含量。

1.2.4 減壓-超聲波利用提取紅松籽油單因素試驗

準確稱取烘干至恒質量的樣品5.00 g，在真空度為0.08～0.09 MPa，分別選用丙酮、正己烷、石油醚（30～60 ℃）、無水乙醇進行減壓-超聲波聯(lián)用試驗確定最佳提取溶劑后，在一定超聲波功率和超聲溫度下，以一定料液比提取25 min，4 000 r/min 離心10 min 后，取上清液在45 ℃下旋蒸至恒重，計算紅松籽油得率，確定最佳提取工藝。得率計算公式如下：

得率/(g·100g-1)= [最終油脂質量(g)/初始紅松籽質量(g)]×100。

1.2.5 減壓-超聲波聯(lián)用提取動力學模型設計

本試驗在減壓-超聲波聯(lián)用提取紅松籽油單因素的基礎下，研究不同超聲波功率在不同時間條件下對紅松籽油得率的影響。對該過程進行擬合，確定最佳提取方程模型后進行驗證，并采用Fick擴散公式計算擴散速率并分析。

1.3 紅松籽油的抗氧化能力測定

1.3.1 紅松籽油對DPPH 自由基的清除能力

以無水乙醇為溶劑，采用分光光度法測定紅松籽油清除DPPH 自由基能力[13-14]，按照下式計算清除率：

式中：A為樣品（不同質量濃度樣品溶液）與DPPH 自由基混合溶液的吸光度；A0為樣品（同上）與無水乙醇混合溶液的吸光度；A1為無水乙醇與DPPH 自由基混合溶液的吸光度。

1.3.2 紅松籽油對ABTS+自由基的清除能力

無水乙醇為溶劑，采用分光光度計法測定紅松籽油清除ABTS+自由基的能力[15]，按照下式計算其清除率：

式中：A為樣品（不同質量濃度樣品溶液）與ABTS+自由基混合溶液的吸光度；A0為樣品（同上）與無水乙醇混合溶液的吸光度；A1為無水乙醇與ABTS+自由基混合溶液的吸光度。

2 結果與分析

2.1 減壓-超聲波聯(lián)用提取紅松籽油工藝條件的確定

2.1.1 溶劑對減壓-超聲波聯(lián)用提取紅松籽油得率的影響

本研究中采用四種溶劑（丙酮、正己烷、石油醚（30～60 ℃）、無水乙醇）作為提取溶劑，加入粉碎烘干后紅松籽仁5.00 g，在真空度為0.08～0.09 MPa，料液比1∶7（g∶mL），超聲波溫度45 ℃，超聲波功率210 W 條件下，超聲波提取25 min，結果如圖1所示。

圖1 溶劑對紅松籽油得率的影響Fig.1 Effect of solvents on the yield of Korean pine seed oil

各溶劑得率順序為：正己烷＞石油醚＞丙酮＞無水乙醇，正己烷提取紅松籽油得率顯著高于丙酮和無水乙醇（p＜0.05），為52.11%，石油醚提取紅松籽油的得率為50.83%。洪晴悅等[16]以油用牡丹籽為原料，利用超聲波輔助提取牡丹籽毛油時篩選最佳溶劑時，正己烷與石油醚得率差異不顯著，但考慮到安全性選用正己烷為提取溶劑。宋于洋[17]研究沙棘籽油有機溶劑提取工藝中得出，以正己烷為溶劑的樣品得率和溶劑回收率均高于以石油醚為溶劑的樣品。根據《食品添加劑使用標準》（GB 2760—2014）食品工業(yè)用加工助劑中規(guī)定正己烷和石油醚均可作為提取溶劑使用，但正己烷可用于大豆油加工工藝，故選用正己烷為最佳溶劑。

2.1.2 超聲波功率對減壓-超聲波聯(lián)用提取紅松籽油得率的影響

以正己烷為提取溶劑，在真空度為0.08～0.09 MPa，料液比1∶7（g∶mL），超聲波溫度45 ℃條件下，超聲25 min，考察不同超聲波功率對紅松籽油得率的影響，結果如圖2所示。

圖2 超聲波功率對紅松籽油得率的影響Fig.2 Effect of ultrasonic power on the yield of Korean pine seed oil

在超聲波功率150～210 W 時紅松籽油得率隨著超聲波功率的增大而增加，其原因可能是超聲波功率的增大，加劇分子間的擴散速度，機械作用及空化效應相應增加，共同促進溶劑分子間的相互作用，有利于紅松籽油的釋放；超聲波功率為210～300 W 時，得率隨超聲波功率的增加而減少，其原因可能是當超聲波功率超過一定值后，溶劑內滲透壓達到平衡，溶劑運動狀態(tài)減緩，從而減少物料與溶劑的相互接觸，導致紅松籽油得率下降[18-19]，故最佳超聲波功率為210 W。Ai-Jun 等[20]認為隨超聲波功率加大，溶劑表面張力系數(shù)和粘度系數(shù)降低，有利于產生空化氣泡。當功率達到一定值后，蒸汽壓的增加導致空化強度或空化效應下降，故隨著超聲波功率加大，得率先增加后減小。

2.1.3 溫度對減壓-超聲波聯(lián)用提取紅松籽油得率的影響

以正己烷為提取溶劑，在真空度為0.08～0.09 MPa，料液比1∶7（g∶mL），超聲功率210 W，超聲25 min，考察不同超聲波溫度下對紅松籽油得率的影響，結果如圖3所示。

圖3 超聲波溫度對紅松籽油得率的影響Fig.3 Effect of ultrasonic temperature on the yield of Korean pine seed oil

當溫度為35～45 ℃時，得率隨溫度的升高而增加，這可能是由于溶劑提取速度主要取決于擴散系數(shù)，當顆粒大小和溶劑半徑確定時，擴散系數(shù)取決于溫度。隨著提取溫度的升高，溶劑與油分子的動態(tài)能量增加，分子間運動速率增加加速紅松籽油的釋放，紅松籽油得率提高[21]。在提取溫度為45 ℃時得率達到最高。當溫度為45～60 ℃時，隨著溫度的升高，紅松籽油得率逐漸降低。當超聲溫度高于45 ℃后，達到正己烷負壓狀態(tài)下的沸點溫度，導致溶劑與物料的接觸時間縮短；高溫致使油脂分解，少量揮發(fā)性油損失，導致紅松籽油得率下降[22]，試驗最佳超聲波溫度為45 ℃。YANG 等[23]在利用超聲波提取黃芩苷時得到類似結果。Moradi N 等[24]認為空化和熱效應影響得率，空化引起氣化泡內爆，導致更高的湍流度，熱效應升高溶質的溶劑熱度，降低溶劑黏度從而增加跨細胞傳質。當溫度高于最適溫度時，氣化效應隨溫度的升高而降低，熱效應本身不做貢獻，得率降低。

2.1.4 料液比對減壓-超聲波聯(lián)用提取紅松籽油的影響

以正己烷為提取溶劑，在真空度為0.08～0.09 MPa，超聲功率210 W，超聲溫度45 ℃，超聲25 min，考察不同料液比對紅松籽油得率的影響，結果如圖4所示。

圖4 料液比對紅松籽油得率的影響Fig.4 Effect of solid-liquid ratio on the yield of Korean pine seed oil

料液比在1∶4～1∶7 的范圍內，紅松籽油得率呈上升趨勢，當料液比達到1∶7 時，得率達到53.01%±0.30%。其原因可能是溶劑量的增加改變原料與溶劑間的濃度差異，促進溶劑與物料的接觸。當料液比在1∶7～1∶9 的范圍內，得率無明顯增加。可能是擴散速率已達到最大值，溶劑的增加對紅松籽油得率影響不大[25]。Moradi N[24]研究了料液比對葵花籽油得率的影響時認為當料液比達到一定閾值后，增加溶劑量對得率無顯著影響。

為比較減壓-超聲波聯(lián)用與單獨超聲波對紅松籽油提取效果的差異性，以正己烷為溶劑，在超聲波功率210 W，超聲波溫度45 ℃，超聲時間25 min，料液比1∶7（g∶mL），4 000 r/min 離心10 min 后，取上清液在45℃下旋蒸至恒重，測定紅松籽油得率，做3組平行對照試驗。經計算后得出，其得率為50.25%±0.46%，減壓-超聲波聯(lián)用提取比超聲波提取紅松籽油的得率提高2.76%。

2.2 減壓-超聲波聯(lián)用提取紅松籽油動力學

2.2.1 減壓-超聲聯(lián)用提取紅松籽油動力學方程的擬合

以正己烷為提取溶劑，超聲波溫度45 ℃，料液比1∶7（g∶mL），真空度0.08～0.09 MPa條件下，考察不同超聲波功率和時間對紅松籽油得率的影響，結果如圖5所示。

圖5 不同減壓-超聲波功率下得率隨時間的變化Fig.5 Changes of the yield under different decompression assisted ultrasonic power and time

由圖5可知，在一定超聲波功率條件下，得率隨時間的延長而增加。在5～20 min 時，得率的增加較為明顯，可能是由于這一階段處于傳質的洗滌和擴散階段[26]，胡愛軍等[27]研究超聲波提取油脂動力學發(fā)現(xiàn)，在洗滌過程油脂整體呈現(xiàn)核-殼結構，隨提取時間的延長，該結構中核不斷縮小，殼厚度增加。充分攪拌提取液時，溶質穿過殼層向溶劑擴散；在20～30min 時，不同超聲波功率提取條件下得率的增加較為緩慢，紅松籽油向溶劑的浸出接近平衡[32]。

采用不同多項式方程擬合試驗數(shù)據，結果見表1。表中相關系數(shù)（R2）越大，表示該模型越能準確描述不同提取功率在不同時間條件下紅松籽油的提取動力學過程。由表1可知，在超聲波功率150 W、180 W、210 W 時，最能反映紅松籽油得率隨超聲波時間和功率變化的動力學方程為Boltzman 模型，對應的R2分別為0.986 6、0.979 8、0.995 3。為進一步驗證動力學方程模型的準確性，分別選取兩個不同時間點，測定紅松籽油得率，并對比預測值和實測值，結果如表2所示。

表1 不同減壓-超聲波功率條件下提取模型的擬合參數(shù)Table 1 Fitting parameters of extraction models under different decompression assisted ultrasonic power

表2 減壓-超聲波聯(lián)用提取紅松籽油提取動力學模型驗證Table 2 Verification of dynamic extraction model of Korean pine seed oil under decompression assisted ultrasonic power

由表1和表2可知玻爾茲曼動力學模型最能反映紅松籽油得率隨時間的變化，相關系數(shù)R2≥0.979 8。對該模型進行驗證，由表2可知，紅松籽油的預測值和實測值的擬合程度變化范圍是0.951 8～0.977 0，擬合程度較好，故玻爾茲曼動力學模型能很好的反應提取動力學過程。

2.2.2 減壓-超聲波聯(lián)用提取紅松籽油過程中的擴散系數(shù)

減壓-超聲波聯(lián)用提取紅松籽油的擴散過程可以采用Fick 擴散公式描述，在不同提取壓力條件下對應的擴散系數(shù)如表3所示。

表3 不同提取功率下的擴散系數(shù)值Table 3 Deff values under different extraction power

本項研究中，通過菲克第二定律推導出的有效擴散系數(shù)結果如表3可知，紅松籽油的有效擴散系數(shù)與超聲波功率呈現(xiàn)正相關。隨著超聲波功率的增加，有效擴散系數(shù)從1.489 4×10-11m2/min增加到2.513 4×10-11m2/min。這可能是由于功率的增加為傳質提供推動力，紅松籽油與溶劑接觸頻率增多，加快了浸出進程。

2.3 減壓-超聲波連用提取的紅松籽油理化性質及脂肪酸組成

2.3.1 減壓-超聲波聯(lián)用提取的紅松籽油理化性質

對紅松籽油的理化性質進行測定，結果如表4所示。

表4 減壓-超聲波聯(lián)用提取紅松籽油的理化性質Table 4 Physicochemical properties of Korean pine seed oil under decompression assisted ultrasonic

從表4可知，紅松籽油的碘值大于130 g/100 g，說明其為干性油脂，是高度不飽和脂肪酸且酸值小于國標（≤4.0 mg/g），過氧化值小于國標（≤0.25 g/100 g）。紅松籽油皂化值大于大豆油標準（189～195 mg/g）。采用減壓-超聲波聯(lián)用提取所得紅松籽油的酸值，過氧化值均達到國家食用油標準。

2.3.2 減壓-超聲波聯(lián)用提取的紅松籽油脂肪酸組成

由圖6和表5可知，紅松籽油中主要含有8種脂肪酸，分別為棕櫚酸、硬脂酸、油酸、亞油酸、皮諾斂酸、花生一烯酸、花生二烯酸、花生三烯酸。亞油酸含量最高，為46.27%，油酸次之，為28.95%。紅松籽油中的亞油酸含量與張思桐等[28]研究不同品系中紅松籽油脂肪酸分布特征中亞油酸含量43.20%～46.14% 相符。亞油酸有助于抑制動脈血栓的形成和降低血清膽固醇，在預防心腦血管疾病方面有重要作用。由于亞油酸是一種必需脂肪酸，人體無法合成，必須從食物中攝取，所以人們以亞油酸含量的高低作為評價食用油質量好壞的指標之一[29]。棕櫚酸和硬脂酸為飽和脂肪酸，其含量均在4.00%以下。紅松籽油不飽和脂肪酸高達90.00%，遠遠高于飽和脂肪酸。皮諾斂酸含量為13.26%。皮諾斂酸是紅松籽油中獨特的脂肪酸成分，參與類花生素的生物合成并刺激機體分泌抑制食欲的膽囊收縮素和胰高血糖素樣肽，向大腦中樞傳遞“飽腹感”，降低食欲[30]。此試驗中也檢測到少量的二十碳一烯酸（1.04%）、二十碳二烯酸（0.54%）和二十碳三烯酸（0.82%）。

圖6 減壓-超聲波聯(lián)用提取的紅松籽油脂肪酸氣相色譜圖Fig.6 Gas chromatogram of fatty acid in Korean pine seed oil extracted by decompression assisted ultrasonic

表5 減壓-超聲波利用提取的紅松籽油的脂肪酸組成及含量Table 5 Fatty acid composition and content of Korean pine seed oil extracted by decompression assisted ultrasonic

2.4 減壓-超聲波聯(lián)用提取的紅松籽油體外抗氧化能力測定

2.4.1 不同濃度紅松籽油對DPPH 自由基的清除作用

由圖7可知，在4～16 mg/mL 范圍內，DPPH自由基清除率由31.08%增加至74.13%，隨著紅松籽油濃度的升高逐漸增大；在16～24 mg/mL 范圍內，清除率緩慢增加后逐漸趨于平緩。當樣品濃度為24 mg/mL 時，清除率達到84.36%，而VE在濃度為24 mg/mL 時，清除率已達到93.06%。紅松籽油對DPPH 自由基的IC50值為8.20± 0.77 mg/mL，VE的IC50值是6.22±1.77 mg/mL。VE 和紅松籽油對DPPH 自由基清除率的差異不大。Wei 等[31]研究發(fā)現(xiàn)山核桃、巴西松子的清除率分別為79.20%、62.50%；王媛等[32]發(fā)現(xiàn)采用超聲波技術提取的葡萄籽油在濃度為25 mg/mL 時，其DPPH 自由基清除率達到80.00%左右。本試驗采用減壓-超聲波聯(lián)用提取的紅松籽油與DPPH 清除能力呈正相關，表明紅松籽油具有良好的抗氧化能力。

圖7 紅松籽油和VE 對DPPH 自由基的清除作用Fig.7 DPPH radical scavenging capacity of Korean pine seed oil and VE

2.4.2 不同濃度紅松籽油對ABTS+自由基的清除作用

由圖8可知，隨著紅松籽油和VE質量濃度的升高，對ABTS+自由基的清除能力呈現(xiàn)先增加后趨于平緩的趨勢。紅松籽油在4～24 mg/mL 的范圍內，清除率由41.16%迅速增加至92.86%后趨于平緩。在濃度為24 mg/mL 時，紅松籽油清除率達到最大值93.27%，VE對ABTS+自由基的清除能力達到98.82%。紅松籽油對ABTS+自由基清除能力的IC50值為7.74±0.06 mg/mL，VE的IC50值為5.72±1.10 mg/mL。余甘子核仁油對ABTS+自由基清除能力與本試驗中紅松籽油對ABTS+自由基清除能力趨勢相同，均表現(xiàn)為在一定范圍內隨著樣品濃度的增加清除能力逐漸增大，之后趨于平緩。從IC50值來看，幾種油對ABTS+自由基清除能力大小的順序為：紅松籽油＞葡萄籽油＞余甘子仁油＞裸仁南瓜籽油＞亞麻籽油[33-34]。

圖8 紅松籽油和VE 對ABTS+自由基的清除作用Fig.8 ABTS+ radical scavenging capacity of Korean pine seed oil and VE

3 結論與討論

單因素試驗優(yōu)化得出減壓-超聲波聯(lián)用提取最佳工藝條件為：在真空度為0.08～0.09 MPa 的條件下，以正己烷為提取溶劑，在料液比1∶7（g∶mL），超聲功率為210 W，溫度45 ℃條件下超聲25 min，紅松籽油的得率是（53.01%± 0.30%）；擬合不同減壓-超聲輔助提取功率下紅松籽油的得率隨時間變化的動力學過程得知，玻爾茲曼學模型擬合程度較高，相關系數(shù)R2≥0.979 8。驗證試驗中實測值與預測值之間擬合度≥0.951 8。說明此擬合模型是可靠的。研究表明，減壓-超聲波聯(lián)用技術與超聲法、抽真空-回流法提取效果接近，均高于常規(guī)回流提技術。該技術通過降低容器內壓強，減少溶液間的分子壓力，進而降低提取過程中的能耗，縮短提取時間，降低提取溫度，有利于保護熱敏性成分物質的抗氧化活性[9,11]。

測定脂肪酸組成可知，紅松籽油不飽和脂肪酸高達90.00%，亞油酸含量最高，為46.27%，油酸次之，為28.95%，其中松籽油中獨特的不飽和脂肪酸—皮諾斂酸高達13.26%。采用減壓-超聲波聯(lián)用提取的紅松籽油酸值、碘值均符合國標，碘值163.70 g/100 g 遠高于不同品系紅松籽油碘值最大值127.22 g/100 g[28]。皂化值是判定平均相對分子量大小的指標，皂化值越大，平均分子量越大，紅松籽油的皂化值205.77 mg/g，不同區(qū)域紅松籽油的皂化值179～181 mg/g[35]。其DPPH 自由基和ABTS+自由基清除能力的IC50值分別為8.20± 0.77 mg/mL、7.74±0.06 mg/mL，具有一定的抗氧化活性能力。減壓-超聲波聯(lián)用提取的紅松籽油脂肪酸含量與下一步將對紅松籽油中的多不飽和脂肪酸進一步分離純化，并研究其功能性。