趙鋒利 冼紹祥 羅苑苑 王澍欣 徐運升 林新峰

[摘要] 目的 探討參附注射液對膿毒癥小鼠免疫調(diào)節(jié)及炎癥因子的影響。 方法 選取120只10周齡SPF級雄性C57BL/6小鼠，按隨機數(shù)字表法將其分為對照組、假手術(shù)組、膿毒癥模型組、參附注射液治療組，每組30只。采用盲腸結(jié)扎穿孔法制備膿毒癥小鼠模型。對照組、假手術(shù)組和膿毒癥模型組于術(shù)后第1天開始腹腔注射生理鹽水[4 mL/（kg·BW），共3 d]，參附注射液治療組腹腔注射參附注射液[4 mL/（kg·BW），共3 d]。采用酶聯(lián)免疫吸附實驗檢測各組小鼠T淋巴細胞亞群;采用蘇木精-伊紅染色法評價器官病理損傷及炎癥細胞浸潤情況。 結(jié)果 與對照組比較，假手術(shù)組白細胞介素-4（IL-4）、IL-17、γ干擾素（IFN-γ）、IL-10水平及IFN-γ/IL-4、IL-10/IL-17差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P > 0.05）。與假手術(shù)組比較，膿毒癥模型組IFN-γ、IL-10水平均顯著降低，IL-4和IL-17水平顯著升高，IFN-γ/IL-4、IL-10/IL-17均顯著降低，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P < 0.05）;其心臟、肺、腎臟病理損傷嚴重，炎癥細胞浸潤均增加（P < 0.05）;與膿毒癥模型組比較，參附注射液治療組IFN-γ、IL-10水平均升高，IL-4、IL-17水平均降低，IFN-γ/IL-4、IL-10/IL-17均升高，但低于對照組，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（均P < 0.05）;其器官病理損傷明顯緩解，炎癥細胞浸潤情況減輕（P < 0.05）。 結(jié)論 參附注射液能夠調(diào)節(jié)膿毒癥小鼠的免疫系統(tǒng)，抑制炎性反應(yīng)，減輕器官損傷。

[關(guān)鍵詞] 膿毒癥;參附注射液;免疫調(diào)節(jié);炎性反應(yīng)

[中圖分類號] R285.5? ? ? ? ? [文獻標識碼] A? ? ? ? ? [文章編號] 1673-7210（2019）08（a）-0021-05

[Abstract] Objective To investigate the effects of Shenfu Injection on immuno regulation and inflammatory factors in septic mice. Methods A total of 120 10-week-old SPF male C57BL/6 mice were selected and divided into control group， sham operation group， septic model group and Shenfu Injection treatment group according to random number table method， with 30 rats in each group. A septic mice model was prepared by cecal ligation and perforation. The control group， sham-operated group and sepsis model group were given intraperitoneal injection of saline [4 mL/（kg·BW） for 3 days] respectively on the first day after operation， and Shenfu Injection group was given intraperitoneal injection of Shenfu Injection [4 mL/（kg·BW） for 3 days] at the same time. T lymphocyte subsets in each group were detected by enzyme-linked immunosorbent assay， hematoxylin-eosin staining was used to evaluate organ pathological damage and inflammatory cell infiltration. Results Compared with the control group， the levels of interleukin-4 （IL-4）， IL-17， interferon γ （IFN-γ）， IL-10 and IFN-γ/IL-4， IL-10/IL-17 in sham operation group had no significant difference （P > 0.05）. Compared with sham-operated group， the levels of IFN-γ and IL-10 in sepsis model group were significantly decreased， IL-4 and IL-17 were significantly increased， and IFN-γ/IL-4 and IL-10/IL-17 were significantly decreased， the differences were statistically significant （P < 0.05）， and its pathological damage of heart， lung and kidney was serious， and the infiltration of inflammatory cells was increased （P < 0.05）. Compared with sepsis model group， the levels of IFN-γ and IL-10 increased， IL-4 and IL-17 decreased， IFN-γ/IL-4 and IL-10/IL-17 increased in Shenfu injection treatment group， but were lower than those in control group， the difference were statistically significant （P < 0.05）， and its pathological damage of organs was relieved and the infiltration of inflammatory cells was alleviated （all P < 0.05）. Conclusion Shenfu Injection can regulate the immune system of sepsis mice， inhibit inflammation and alleviate organ damage.

[Key words] Sepsis; Shenfu Injection; Immuno regulation; Inflammatory response

膿毒癥是各種嚴重創(chuàng)傷、燒傷、缺血缺氧常見的并發(fā)癥，是急危重患者死亡的主要原因之一[1]。據(jù)統(tǒng)計，全球每年每天約有14 000人死于膿毒癥，并其速度仍在不斷增長[2]。近年來，隨著研究的不斷深入，對膿毒癥機制的認識取得了一定的進展，但其治療效果仍差強人意[3-4]。因此，進一步尋求治療膿毒癥的有效方法具有十分重要的意義。目前，研究[5-6]認為T淋巴細胞介導(dǎo)的炎癥平衡與膿毒癥的發(fā)生、進展存在密切關(guān)系，部分中藥可以調(diào)節(jié)此平衡，具有良好的療效。本研究擬探討參附注射液對膿毒癥模型小鼠的免疫因子及炎癥介質(zhì)的影響，分析參附注射液對膿毒癥器官的保護作用。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

實驗動物雄性C57BL/6小鼠120只，健康狀況良好，SPF級，10周齡，體質(zhì)量30～35 g，購自廣東省醫(yī)學(xué)實驗動物中心，合格證號：2017X119231-2。小鼠自由進食飲水，室內(nèi)溫度（22±2）℃，人工光暗周期12 h。所有實驗均遵循喀什廣東科學(xué)技術(shù)研究院動物倫理規(guī)范。

1.2 儀器與試劑

BIOPAC SYSTEMS生理系統(tǒng)記錄儀、Anke TDL-5低溫離心機、TB電子體溫計、Olympus顯微鏡系統(tǒng)等實驗所需儀器均由廣州中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院中心實驗室提供。

參附注射液購自華潤三九藥業(yè)有限公司（生產(chǎn)批號：2017042303）;小鼠白細胞介素酶聯(lián)免疫吸附試驗檢測試劑盒（生產(chǎn)批號：BY2016112398E）購自武漢碧云天生物科技有限公司;蘇木精-伊紅染色試劑盒（生產(chǎn)批號C0106-2）購自武漢谷歌生物科技有限公司。

1.3 膿毒癥模型制備及分組

采用盲腸結(jié)扎穿孔法構(gòu)建小鼠膿毒癥模型：術(shù)前禁食禁水12 h，麻醉后剪毛，無菌條件下沿下腹部正中線切開，暴露盲腸，避免損傷血管，8號線結(jié)扎盲腸中部，用22號針穿刺盲腸2次，擠出少許腸內(nèi)容物，縫合切口。盲腸結(jié)扎穿孔手術(shù)后立即腹腔注射生理鹽水進行液體復(fù)蘇。術(shù)后3 h開始藥物處理[7]。

將盲腸結(jié)扎穿孔小鼠隨機分為膿毒癥模型組和參附注射液治療組，每組30只。參附注射液治療組小鼠腹腔注射參附注射液[4 mg/（kg·BW）]，連續(xù)3 d。膿毒癥模型組小鼠腹腔注射生理鹽水[4 mg/（kg·BW）]，連續(xù)3 d。假手術(shù)組小鼠30只，腹部切開再縫合，不處理腸道，給予腹腔注射生理鹽水[4 mg/（kg·BW）]，連續(xù)3 d。對照組小鼠30只，不做任何手術(shù)處理。于其他組給藥同時給予腹腔注射生理鹽水[4 mg/（kg·BW）]，連續(xù)3 d。

1.4 小鼠組織病理學(xué)檢測

給藥完成后取各組小鼠左心室、左肺、左腎組織制作石蠟切片，采用二甲苯浸洗3次，再分別用梯度乙醇（100%、95%、90%、80%、65%）處理1次，染色，在光學(xué)高倍鏡下觀察器官組織病理學(xué)改變并拍照，對組織炎癥細胞浸潤程度進行半定量檢測。

炎癥細胞浸潤半定量方法：在低倍顯微鏡下，對每一張切片隨機取5個視野，然后在高倍顯微鏡拍照，使用Image J測量選擇范圍的面積并計數(shù)炎癥細胞數(shù)量，取炎癥細胞數(shù)量均值/面積（個/mm2）代表此張切片炎癥細胞浸潤情況。

1.5 酶聯(lián)免疫吸附法檢測炎性細胞因子水平

取各組小鼠外周血1 mL，在4℃條件下5000 r/min離心10 min，分離得到小鼠血清，采用酶聯(lián)免疫吸附實驗檢測輔助性T細胞1（Th1）、Th2、調(diào)節(jié)性T細胞（Treg）和Th17細胞因子、白細胞介素-4（IL-4）、IL-17、γ干擾素（IFN-γ）、IL-10水平。

1.6 統(tǒng)計學(xué)方法

采用SPSS 12.0統(tǒng)計學(xué)軟件進行數(shù)據(jù)分析，計量資料用均數(shù)±標準差（x±s）表示，多組間比較比較采用單因素方差分析，兩組間比較采用LSD檢驗;計數(shù)資料用率表示，組間比較采用χ2檢驗，以P < 0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組小鼠死亡率比較

對照組和假手術(shù)組小鼠在觀察窗內(nèi)無死亡;膿毒癥模型組小鼠3 d存活10只（生存率：33.33%），參附注射液治療組小鼠3 d存活19只（生存率：63.33%）。參附注射液治療組小鼠的生存率明顯高于膿毒癥模型組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P < 0.05）。

2.2 各組小鼠T淋巴細胞相關(guān)炎性細胞因子比較

與對照組比較，假手術(shù)組IL-4、IL-17、IFN-γ、IL-10水平及IFN-γ/IL-4、IL-10/IL-17差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P > 0.05）。與假手術(shù)組比較，膿毒癥模型組IFN-γ、IL-10水平均顯著降低，IL-4和IL-17水平顯著升高，IFN-γ/IL-4、IL-10/IL-17均顯著降低，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（均P < 0.05）;其心臟、肺、腎臟病理損傷嚴重，炎癥細胞浸潤均增加（P < 0.05）。與膿毒癥模型組比較，參附注射液治療組IFN-γ、IL-10水平均升高，IL-4、IL-17水平均降低，IFN-γ/IL-4、IL-10/IL-17均升高，但低于對照組，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（均P < 0.05）。見表1。

2.3 各組小鼠器官病理改變及炎癥細胞浸潤情況比較

對照組及假手術(shù)組：小鼠心肌形態(tài)正常，細胞排列致密整齊，細胞無腫脹;肺泡結(jié)構(gòu)完整，內(nèi)皮細胞形態(tài)正常，肺泡內(nèi)無滲液，炎癥細胞浸潤少;腎小球、腎小管正常，腎小管上皮細胞無變性、萎縮、壞死或炎癥細胞浸潤，管腔無擴張（圖1）。

膿毒癥模型組小鼠器官組織出現(xiàn)明顯的病理變化：部分心肌細胞腫脹，排列紊亂，存在細胞核碎裂現(xiàn)象;氣道上皮細胞腫脹、部分脫落，基底膜較厚，結(jié)構(gòu)模糊，炎癥細胞浸潤顯著增加，肺泡結(jié)構(gòu)損傷，肺泡內(nèi)大量滲出;腎近曲小管細胞腫脹，管腔消失，部分小管上皮壞死，炎癥細胞浸潤明顯（圖1）。

與膿毒癥模型組比較，參附注射液治療組小鼠上述器官組織病理學(xué)變化得到不同程度的緩解：心臟病理組織切片可見心肌結(jié)構(gòu)尚存，心肌細胞排列較整齊，細胞無腫脹，未見明顯碎裂細胞核;肺泡結(jié)構(gòu)改善，肺泡內(nèi)滲出明顯減少，炎癥細胞浸潤減少;腎近曲小管細胞腫脹情況明顯減輕，炎癥細胞浸潤減少（圖1）。

器官組織炎癥細胞浸潤情況的半定量分析結(jié)果顯示：假手術(shù)組和對照組炎癥細胞浸潤比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P > 0.05）;與假手術(shù)組比較，膿毒癥模型組炎癥細胞浸潤顯著增加（P < 0.05），提示膿毒癥小鼠機體產(chǎn)生嚴重的炎性反應(yīng)。與膿毒癥模型組比較，參附注射液治療組炎癥細胞浸潤減輕（P < 0.05），提示參附注射液能調(diào)節(jié)炎癥因子從而降低膿毒癥小鼠的炎性反應(yīng)。見表2。

3 討論

近年來，越來越多的研究[7]表明，膿毒癥患者存在著免疫功能紊亂，若不能及時糾正，可能發(fā)展為免疫系統(tǒng)“麻痹”，誘發(fā)炎癥瀑布級聯(lián)反應(yīng)，造成多器官功能損傷甚至衰竭。因此，深入探討膿毒癥免疫功能紊亂的病理生理基礎(chǔ)，可為進一步其預(yù)防和治療開拓新方法、新思路[9]。本研結(jié)果提示，參附注射液能夠調(diào)節(jié)膿毒癥小鼠Th1/Th2、Treg/Th17平衡，調(diào)節(jié)免疫，抑制炎性反應(yīng)，減輕器官損傷。

T淋巴細胞具有重要的免疫調(diào)節(jié)功能。學(xué)界依據(jù)其表達細胞因子及功能的異同將其分為4類：①Th1通過產(chǎn)生IFN-γ等，阻斷免疫球蛋白E合成，對速發(fā)型超敏反應(yīng)有抑制作用，參與抵御細胞內(nèi)致病因素;②Th2通過分泌IL-4，對B淋巴細胞免疫應(yīng)答抗原表達起正調(diào)節(jié)作用，參與抵御細胞外致病因素;③Th17通過分泌IL-17等促炎因子刺激成纖維細胞、上皮細胞、內(nèi)皮細胞產(chǎn)生多種細胞因子，如IL-6、IL-1、腫瘤壞死因子-α（TNF-α）、粒細胞-巨噬細胞刺激因子（GM-CSF）及細胞黏附分子1（CAM-1），誘發(fā)一系列傳遞信號而介導(dǎo)炎癥、感染等的發(fā)生和發(fā)展;④Treg細胞是由外周幼稚T細胞發(fā)育而成，主要通過分泌IL-10等發(fā)揮免疫負調(diào)控作用，即抑制幼稚型和記憶型T淋巴細胞增殖反應(yīng)，維持機體內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定[10-11]。正常情況下，Th1、Th2、Th17和Treg細胞及其分泌的細胞因子處于動態(tài)平衡，維持機體正常的免疫功能。膿毒癥病理生理過程中，Th1/Th2及Th17/Treg失衡被證實為重要的免疫機制[12]。研究[13]顯示，膿毒癥患者出現(xiàn)Th2介導(dǎo)的免疫反應(yīng)增強而Th1介導(dǎo)的免疫反應(yīng)減弱的征象，具體表現(xiàn)為患者外周血IL-4水平的高表達而炎癥抑制因子IFN-γ活性的降低，免疫球蛋白E濃度增加及嗜酸性粒細胞過度聚集、浸潤，導(dǎo)致多個器官損傷及功能下降。本研究結(jié)果顯示，與假手術(shù)組比較，膿毒癥模型組小鼠IFN-γ/IL-4顯著降低，提示小鼠此時存在明顯的Th1/Th2平衡失調(diào)。此外，膿毒癥患者在受到外源性細菌、病毒等刺激處于超敏反應(yīng)狀態(tài)時，Th17/Treg的功能平衡也被打破，IL-17分泌顯著增多，誘導(dǎo)大量炎癥細胞尤其是中性粒細胞黏附、趨化，進一步加重器官的炎癥級聯(lián)反應(yīng)和損傷[14]。與此同時，Treg細胞通過分泌IL-10和腫瘤壞死因子-β（TNF-β）等抑制嗜酸性粒細胞的活化，減少促炎因子的分泌從而緩解器官炎性反應(yīng)，抑制甚至阻斷炎癥級聯(lián)反應(yīng)[15]。本研究膿毒癥模型組IL-10/IL-17較對照組顯著降低，進一步證實Th17/Treg平衡失調(diào)的結(jié)論。

參附注射液是臨床常用的藥物，源于宋代名醫(yī)嚴永和《濟生方》記載的“參附湯”，人參長于扶正補虛;附子善于回陽救逆，兩藥合用具有回陽救逆、益氣固脫的作用?，F(xiàn)代藥理及分子生物研究[16]表明，參附注射液可有效降低休克大鼠外周血內(nèi)毒素水平，減輕毛細管滲漏造成的血管和器官的損害，其抗炎作用還與增高機體糖皮質(zhì)激素水平相關(guān)。參附注射液抑制膿毒血癥性休克大鼠心肌組織核因子κB（NF-κB）信號通路的激活及其介導(dǎo)的促炎因子TNF-α等過度表達，促進抗炎因子IL-10等產(chǎn)生，恢復(fù)促炎/抗炎平衡，防止過度炎性反應(yīng)和免疫抑制[17]。參附注射液通過抑制NF-κB核因子p65磷酸化，進而降低IL-6水平，在全身炎性反應(yīng)中起保護作用[18]。體外研究[19-20]證實，參附注射液可以明顯改善膿毒性休克患者的內(nèi)皮細胞功能，限制炎性反應(yīng)和繼發(fā)器官損傷，同時還可以提高機體免疫力。本研究參附注射液組小鼠Th1/Th2及Th17/Treg的比值較膿毒癥模型組均有明顯升高，提示參附注射液能夠恢復(fù)Th1/Th2及Th17/Treg平衡。

綜上，本實驗采用盲腸結(jié)扎穿孔方式復(fù)制膿毒癥小鼠模型，膿毒癥模型組小鼠出現(xiàn)明顯的Th1/Th2及Th17/Treg功能失調(diào)。經(jīng)參附注射液治療后，可改善小鼠Th1/Th2及Th17/Treg平衡，抑制炎癥因子對心臟、肺、腎臟組織的浸潤損傷，實現(xiàn)保護器官的作用。

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（收稿日期：2018-12-25? 本文編輯：王? ?蕾）