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        高效液相色譜法測(cè)定生附子中3種雙酯型生物堿含量*

        2019-10-30 07:45:52楊海寧文瑾孫筱林王登才張宇佳鄭穩(wěn)生
        醫(yī)藥導(dǎo)報(bào) 2019年11期
        關(guān)鍵詞:實(shí)驗(yàn)

        楊海寧,文瑾,孫筱林,王登才,張宇佳,鄭穩(wěn)生

        (1.中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院藥物研究所,藥物傳輸技術(shù)及新型制劑北京市重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,北京 100050;2.中國(guó)藥學(xué)會(huì)學(xué)術(shù)部,北京 100022;3.三株醫(yī)藥生物研究所,濟(jì)南 250100)

        附子是毛茛科植物烏頭(AconitumcarmichaeliiDebx.)子根的加工品,每年六月下旬至八月下旬采挖,主產(chǎn)于四川、湖南、湖北等地,始載于《神農(nóng)本草經(jīng)》。附子味辛、甘,性大熱,有毒,具有補(bǔ)火助陽(yáng)、散寒止痛、回陽(yáng)救逆之功效,自古以來(lái)就是醫(yī)家常用之品,但其毒性較強(qiáng),臨床用之不當(dāng)可能導(dǎo)致中毒或死亡。《中華人民共和國(guó)藥典》2015年版規(guī)定,附子常用量3~15 g[1-3]。但火神派代表吳佩蘅在方劑中動(dòng)輒使用百余克附子,病情嚴(yán)重者可加至200~400 g[4]。附子中所含有效成分與有毒物質(zhì)均為二萜類生物堿類,其毒性主要作用于神經(jīng)系統(tǒng)、肌肉組織和心臟。其中雙酯型生物堿毒性最強(qiáng),主要包括烏頭堿、次烏頭堿和新烏頭堿,此3種生物堿含量高,特征性強(qiáng),常作為含附子制劑的測(cè)定指標(biāo)[5-6]。目前文獻(xiàn)中對(duì)生物堿類物質(zhì)的提取多采用氨水堿化樣品,再用有機(jī)試劑進(jìn)行提取,但該方法操作較繁瑣,重復(fù)性差。筆者在本研究采用酸水提取附子中雙酯型生物堿,提取率更高,操作更簡(jiǎn)單,重復(fù)性好,建立的同時(shí)測(cè)定3種雙酯型生物堿的高效液相色譜法靈敏度高、操作簡(jiǎn)單、重復(fù)性好,可以用于生附子中3種雙酯型的含量測(cè)定,可為生附子質(zhì)量控制提供參考。

        1 儀器與試藥

        1.1儀器 普析L600型高效液相色譜儀(北京普析通用公司),檢測(cè)器(北京普析通用公司,型號(hào):L600-UV);色譜柱WondaSil C18(4.6 mm×250 mm,5 μm);XS105DU型電子天平(梅特勒-托利多儀器公司,感量:0.01 mg);BSA423S-CW型電子天平(北京塞多利斯科學(xué)儀器有限公司,感量:0.001 g);DTC-27型超聲波清洗機(jī)(鼎泰生化科技設(shè)備制造有限公司)。

        1.2試藥 生附子(濟(jì)南三株醫(yī)院提供,批號(hào):171225,180108,180302;產(chǎn)地四川,經(jīng)濟(jì)南三株醫(yī)院牛紀(jì)江主任醫(yī)師鑒定為毛茛科植物烏頭AconitumcarmichaeliiDebx.的子根);烏頭堿對(duì)照品(批號(hào):17110910,含量98.01%)、次烏頭堿對(duì)照品(批號(hào):17111310,含量99.04%)、新烏頭堿對(duì)照品(批號(hào):MUST-17111010,含量98.12%)均由成都曼思特生物科技有限公司提供;乙腈(上海安譜實(shí)驗(yàn)科技股份有限公司,批號(hào):G2781296,含量99.99%)、甲醇(賽默飛世爾科技有限公司,批號(hào):175167,含量99.99%)、四氫呋喃(上海安譜實(shí)驗(yàn)科技股份有限公司,批號(hào):V593K072,含量99.99%)、醋酸銨(北京伊諾凱科技有限公司,批號(hào):KBCK706,含量97%)、鹽酸(北京化工廠,批號(hào):20150701,含量36%~38%)、其余試劑均為分析純。

        2 方法與結(jié)果

        2.1色譜條件 Wondasil C18色譜柱(250 mm×4.6 mm,5 μm) ;以60 mmol·L-1醋酸銨作為流動(dòng)相A,以乙腈-四氫呋喃(9:1)為流動(dòng)相B,梯度洗脫(0~50 min,26%→38%B),流速1.0 mL·min-1;柱溫35 ℃; 波長(zhǎng)235 nm;理論板數(shù)按烏頭堿計(jì)算應(yīng)≥3000,相鄰兩色譜峰分離度應(yīng)>1.5?;旌蠈?duì)照品、樣品色譜圖見(jiàn)圖1。

        2.2對(duì)照品的制備 精密稱取各對(duì)照品適量,用0.05%鹽酸甲醇溶解,配成新烏頭堿、次烏頭堿、烏頭堿(分別為0.526,0.522,0.108 mg·mL-1)混合對(duì)照品儲(chǔ)備液。取該儲(chǔ)備液1 mL,加0.05%鹽酸甲醇至10 mL,定容,濾過(guò),取20 μL進(jìn)樣。

        2.3供試品溶液的制備 取過(guò)篩孔內(nèi)徑0.15 mm(100目篩)生附子粉末1 g于具塞磨口錐形瓶中,精密加入1%鹽酸10 mL,搖勻,超聲處理30 min,放至室溫,3000 r·min-1離心10 min(r=15.7 cm),取上清液,濾過(guò),取20 μL進(jìn)樣。

        2.4線性關(guān)系考察 精密吸取“2.2”項(xiàng)對(duì)照品儲(chǔ)備溶液1,4,8,10,12,20 μL,分別進(jìn)樣測(cè)定峰面積,以對(duì)照品進(jìn)樣量為橫坐標(biāo)(X),以峰面積為縱坐標(biāo)(Y)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。新烏頭堿回歸方程Y=1 063 519.314X-31 122.424(r= 0.999 7)。結(jié)果表明,在0.526~10.520 μg范圍內(nèi),新烏頭堿峰面積與進(jìn)樣量呈良好的線性關(guān)系;次烏頭堿回歸方程為Y=1 216 539.728X-34 643.270(r=0.999 5)。結(jié)果表明,在0.522~10.440 μg范圍內(nèi),次烏頭堿峰面積與進(jìn)樣量呈良好的線性關(guān)系;烏頭堿回歸方程為Y=1 190 920.635X-6 345.444(r=0.999 2)。結(jié)果表明,在0.108~2.160 μg范圍內(nèi),烏頭堿進(jìn)樣量與峰面積呈良好的線性關(guān)系。

        A.混合對(duì)照品;B.生附子;1.新烏頭堿;2.次烏頭堿;3.烏頭堿。

        A.mixed reference substances; B.lateral roots ofAconitumcarmichaeliiDebx.;1.mesaconitine; 2.hypaconitine;3.aconitine.

        Fig.1HPLCchromatogramsofmixedreferencesubstancesandlateralrootsofAconitumcarmichaeliiDebx.

        2.5精密度考察 精密吸取混合對(duì)照品溶液20 μL,按上述色譜條件注入高效液相色譜儀,重復(fù)進(jìn)樣6次,記錄色譜圖。結(jié)果新烏頭堿、次烏頭堿、烏頭堿峰面積的RSD 值分別2.97%,1.14%,2.39%,表明該色譜方法精密度良好。

        2.6加樣回收率實(shí)驗(yàn) 精密稱取已知含量的生附子藥材粉末9份各1.000 g,分別精密加入新烏頭堿、次烏頭堿及烏頭堿對(duì)照品溶液適量,使樣品溶液中新烏頭堿、次烏頭堿及烏頭堿含量為樣品中相應(yīng)物質(zhì)含量的80%(3份)、100%(3份)、120%(3份)。照“2.3”項(xiàng)供試品溶液制備方法制備,照“2.1”項(xiàng)色譜條件測(cè)定3種雙酯型生物堿含量,分別計(jì)算加樣回收率及RSD值,結(jié)果見(jiàn)表1。

        2.7穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn) 精密吸取同一樣品,分別于0,2,4,8,10,24 h 注入高效液相色譜儀,檢測(cè)相應(yīng)雙酯型生物堿的峰面積,新烏頭堿、次烏頭堿、烏頭堿峰面積RSD值分別為2.95%,3.01%,2.08%。結(jié)果表明采用酸水提取的供試品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

        表1 3種雙酯型生物堿加樣回收率實(shí)驗(yàn)結(jié)果

        2.8重復(fù)性實(shí)驗(yàn) 分別精密稱定同一批生附子粉末6份,每份1 g,照“2.3”項(xiàng)供試品溶液的制備方法制備供試品溶液,按“2.1”項(xiàng)色譜條件進(jìn)行測(cè)定,記錄各色譜峰面積。測(cè)得新烏頭堿、次烏頭堿、烏頭堿的峰面積RSD值分別為2.3%,1.1%,1.3%,結(jié)果表明本方法測(cè)定3種雙酯型生物堿含量重復(fù)性良好。

        2.9樣品含量測(cè)定 取生附子3批,按“2.3”項(xiàng)方法制備供試品,按照“2.1”項(xiàng)色譜條件進(jìn)行測(cè)定,結(jié)果見(jiàn)表2。

        3 討論

        3.1提取方法考察 附子中生物堿除極少部分以游離狀態(tài)存在外,大部分以生物堿鹽的形式存在于植物細(xì)胞?!吨腥A人民共和國(guó)藥典》2015年版采用氨水堿化樣品,將生物堿游離出來(lái),再提取。但實(shí)際操作中筆者發(fā)現(xiàn),采用該方法提取雙酯型生物堿,含量明顯低于酸水直接提取。筆者在本實(shí)驗(yàn)中還考察了不同有機(jī)溶劑對(duì)結(jié)果的影響,結(jié)果顯示,采用三氯甲烷提取時(shí)三氯甲烷易揮發(fā),實(shí)驗(yàn)操作困難,結(jié)果可重復(fù)性差;采用異丙醇:乙酸乙酯(1:1)提取重復(fù)性較好,但操作繁瑣,提取率偏低,約為1%酸水提取率的75%。同時(shí),筆者在本實(shí)驗(yàn)中還考察了酸用量對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果的影響,結(jié)果表明,在1%鹽酸溶液中,烏頭堿穩(wěn)定性優(yōu)于0.5%鹽酸。因此,筆者選擇1%酸水作為最終提取液。

        表2 樣品含量測(cè)定結(jié)果

        Tab.2Resultsofcontentdeterminationonsamplesμg·g-1

        樣品平均含量新烏頭堿次烏頭堿烏頭堿171225689.2698.2139.7180108622.9657.9128.2180302402.7457.278.1

        3.2液相色譜條件的選擇 本實(shí)驗(yàn)中,筆者考察了甲醇-水、乙腈-水、乙腈-四氫呋喃-水等系統(tǒng)作為流動(dòng)相的色譜情況。由于3種雙酯型生物堿最佳檢測(cè)波長(zhǎng)約235 nm,采用甲醇-水系統(tǒng)時(shí)基線波動(dòng)較大,不利于檢測(cè),而采用乙腈-水系統(tǒng)時(shí)可以有效避免基線波動(dòng),但烏頭堿類生物堿屬于含氮化合物,具有弱堿性,單純使用乙腈-水系統(tǒng)會(huì)有拖尾峰出現(xiàn),因此選擇在水相中加入醋酸銨來(lái)改善峰型[7]。筆者在實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn),加入10 mmol·L-1醋酸銨時(shí),僅對(duì)低濃度烏頭堿峰形有改善作用,而隨著烏頭堿濃度增加,依然有拖尾,所以最終色譜條件選擇60 mmol·L-1醋酸銨溶液作為水相。雖然乙腈-水-醋酸銨系統(tǒng)基線平穩(wěn),峰型較好,但3種雙酯型生物堿分離度較差,調(diào)節(jié)流動(dòng)相比例依然不能將其完全分離,而采用乙腈與四氫呋喃9:1混合作為有機(jī)相時(shí),3種雙酯型生物堿分離度良好。

        3.3附子的毒性及減毒 附子毒性主要來(lái)源于雙酯型生物堿,且該類化合物對(duì)Na+通道的II位點(diǎn)具有高親和力,其可增加Na+內(nèi)流,進(jìn)而引起心律失常,導(dǎo)致嚴(yán)重急性毒性(LD50約0.15 mg·kg-1)[8]。雙酯型生物堿穩(wěn)定性差,經(jīng)炮制和煎煮可水解成苯甲酰類單酯型生物堿及原堿,且隨煎煮時(shí)間的變化,其含量呈現(xiàn)一定規(guī)律變化。生成的單酯類生物堿活性較強(qiáng)且毒性顯著降低[9-11]。因此,現(xiàn)在臨床煎劑及中成藥中一般選用制附子。附子的傳統(tǒng)炮制解毒方式較多,包括去皮、炮、炒、煨、燒、黑豆制、蜜制、姜制等[12]。在此基礎(chǔ)上,有學(xué)者利用先進(jìn)的科學(xué)技術(shù),摸索出附子炮制新工藝,如鄧文偉等[13]采用烘箱烘烤法成功制備出質(zhì)量合格的制附子,楊明等[14]采用微波炮制出藥效好、毒性低的附子。附子與其他中藥配伍也能在一定程度上減輕其毒性,例如與甘草配伍,甘草中羧酸可與附子中生物堿發(fā)生締合作用生成沉淀,進(jìn)而降低附子之毒[15]。

        綜上所述,筆者在本實(shí)驗(yàn)建立的液相檢測(cè)方法能同時(shí)測(cè)定生附子中烏頭堿、新烏頭堿、次烏頭堿含量,且該方法簡(jiǎn)單、靈敏,可用于附子中雙酯型生物堿的質(zhì)量控制。

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