賈田芊，黃喆，崔春利，李興歡，任麗，唐志書，史亞軍，孫靜

(1.陜西中醫(yī)藥大學藥學院，咸陽 712046；2.西安高新醫(yī)院放射科，西安 710075)

復方丹參方是活血化瘀、理氣止痛的經(jīng)典方劑，該方由丹參、三七、冰片組成，用于胸中憋悶、心絞痛，是治療心血管病最常用的中成藥[1-3]。目前臨床應(yīng)用劑型有片劑、滴丸劑、顆粒劑、口服液、膠囊劑和氣霧劑等十余種。復方丹參方主要成分[3-5]有來自丹參的丹酚酸類，如丹酚酸B、丹參素、原兒茶醛等和丹參酮類，如丹參酮ⅡA、丹參酮及隱丹參酮等；來自三七中皂苷類，如人參皂苷Rg1、Rb1及三七皂苷R1等和黃酮類；另有來自冰片的龍腦類。

近年來，對復方丹參方質(zhì)量及復方中有效成分的藥動學[4-8]研究較多，常以方中丹參或三七為指標進行研究，鮮有將丹參、三七中主要有效成分于同一指紋圖譜中展現(xiàn)出來。在前人研究的基礎(chǔ)上，筆者建立超高效液相色譜(UPLC)法在同一色譜條件下快速、方便檢測復方丹參方中丹參、三七中主要有效成分，并進行整合藥動學研究。本實驗在同一色譜條件下對大鼠血漿中丹酚酸B、人參皂苷Rg1、三七皂苷R1、丹參酮ⅡA 的藥動學特征進行研究，并運用復方丹參片與復方丹參滴丸45 min時在體內(nèi)的吸收情況來驗證該色譜條件及處理方法的可行性，根據(jù)4種成分在體內(nèi)的吸收量可為藥材、制劑的質(zhì)量研究提供新的依據(jù)，為復方丹參方體內(nèi)指紋圖譜的建立提供參考。

1 材料

1.1動物 雄性SPF級SD大鼠，體質(zhì)量(200±20) g，均來自成都達碩實驗動物有限公司，實驗動物生產(chǎn)許可證號：SCXK(川)2015-030。大鼠飼養(yǎng)室溫度保持20～25 ℃，相對濕度50%～65%，并在封閉飼養(yǎng)室采用光照定時裝置，提供適當(光照12 h、黑暗12 h或光照14 h、黑暗10 h)晝夜光變化周期。

1.2儀器 Waters I-class超高效液相色譜儀(美國Waters公司)，雙波長紫外檢測器(美國Waters公司)，U-3000高效液相色譜儀(美國賽默飛世爾公司)，486紫外檢測器(美國賽默飛世爾公司)，KH-400KDE高功率數(shù)控超聲波清洗器(昆明市超聲儀器有限公司)，MS205DU電子天平(北京賽多利斯儀器系統(tǒng)有限公司，感量：0.1 mg)，EYELA MG-2200氮吹儀(上海賽默生物科技發(fā)展有限公司)，Allegra64R冷凍離心機(美國貝克曼庫爾特有限公司)，SK-2渦旋振蕩器(上海奧然科貿(mào)有限公司)。

1.3試藥 三七皂苷R1(批號：110745-201318，含量：95%)、人參皂苷Rb1(批號：110704-201424 含量：94%)、人參皂苷Rg1(批號：110703-201530，含量：92%)；丹參酮ⅡA(批號：110766-201520 ，含量：99%)、丹酚酸B(批號：111562-201514，含量：94% )均來自中國食品藥品檢定研究院。復方丹參片(廣州白云山制藥股份有限公司，批號：20160821)、復方丹參滴丸(天士力制藥集團股份有限公司，批號：20160511)；丹參(批號：20160721)、三七(批號：20160507)、冰片均購于陜西興盛德藥業(yè)有限責任公司，均由陜西中醫(yī)藥大學藥學院胡本祥教授鑒定，分別為丹參、三七、冰片藥材。甲醇、乙腈為色譜純，磷酸、鹽酸為分析純，水為娃哈哈純凈水。

2 方法與結(jié)果

2.1色譜條件 色譜柱Waters Acquity UPLC C18(50 mm×2.6 mm，1.7 μm)；流動相為0.02%磷酸(A)和含0.02%磷酸的80%乙腈(B )，梯度洗脫；柱溫：40 ℃；流速：0.42 mL·min-1；檢測波長：203 nm；進樣量：3 μL；流動相梯度：0～0.8 min，90% (A)～80%(B)，4～10 min 75%(A)～25%(B)，10 min 95%(B)。

2.2復方丹參方提取物的制備 精密稱取丹參450 g、三七150 g、冰片7.5 g，丹參飲片加乙醇回流1.5 h，濾過，得濾液一；藥渣加50%乙醇回流1.5 h，濾過，得濾液二；藥渣加水煎煮2 h，濾過，得濾液三；三七粗粉加70%乙醇回流1.5 h，濾過，得濾液四；濾渣加水煎煮2 h，濾過，得濾液五；合并濾液一、二、三、四、五，減壓干燥為粉末，加入冰片研勻備用。

2.3對照品溶液的制備 分別取丹酚酸B、人參皂苷Rg1、三七皂苷R1、丹參酮ⅡA 對照品適量，精密稱定，加甲醇制成每毫升含丹酚酸B 60 μg、人參皂苷Rg1 0.2 mg、三七皂苷R1 0.05 mg及丹參酮ⅡA 40 μg的混標溶液及單標溶液，即得。

2.4給藥與血漿采集 大鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)1周，實驗前禁食不禁水12 h，復方丹參方提取物按照“2.2”項方法制備，按10 g·kg-1提取物(丹酚酸B：598 mg·kg-1，丹參酮ⅡA：110 mg·kg-1，三七皂苷R1：121 mg·kg-1，人參皂苷Rg1：300 mg·kg-1，冰片：500 mg·kg-1)溶于羧甲基纖維素鈉中灌胃，每組平行灌胃大鼠12只，每個采血點(5，10，15，30，45，60，90，120，240，360，480，600 min)對應(yīng)1只大鼠進行眼眶采血，平行5組，采血液4 mL于肝素抗凝離心管中，后進行離心，取血漿800 μL，-20 ℃保存。

2.5血漿中丹酚酸B、人參皂苷Rg1、三七皂苷R1、丹參酮ⅡA測定樣品處理 取血漿800 μL，加入乙腈2.5 mL，渦旋震蕩10 min，15 000 r·min-1離心(r=9.5 cm)10 min，吸取上清液，37 ℃氮氣吹干，加70%甲醇200 μL復溶，15 000 r·min-1離心10 min，取上清液，備用。

2.6方法學考察

2.6.1專屬性考察 取大鼠空白血漿，加入含丹酚酸B 60 μg·mL-1、人參皂苷Rg1 0.2 μg·mL-1、三七皂苷R1 0.05 μg·mL-1、丹參酮ⅡA 40 μg·mL-1的混合對照品300 μL，按“2.5”項處理，按“2.1”項進行檢測，色譜圖見圖1，結(jié)果可見4種成分與相鄰成分的分離度良好，大鼠體內(nèi)內(nèi)源性物質(zhì)不影響所選指標的檢測，該方法專屬性良好。

A.混合標準品；B.空白血漿；C.空白血漿加混合對照品；D.給藥后45 min血漿樣品；1.丹酚酸B；2.三七皂苷R1；3.人參皂苷Rg1；4.丹參酮ⅡA

圖1 大鼠血漿HPLC色譜圖

A. mixed standard; B. blank plasma; C. blank plasma spiked with mixed standard; D. plasma sample from a patient 45 min after medication；1.salvianolic acid B；2.notoginsenoside R1；3.ginsenoside Rgl；4.tanshinone ⅡA

Fig.1HPLCchromatogramofplasmasamplefromrats

2.6.2線性范圍考察 取4種成分儲備液適量，用甲醇逐級稀釋，加入空白大鼠血漿，使其混標中丹酚酸B、人參皂苷Rg1、三七皂苷R1、丹參酮ⅡA制得20，50，100，300，500，800，1000 ng·mL-1質(zhì)控樣品。將上述質(zhì)控樣品按“2.3”項方法處理，按“2.1”項條件下測定，以被測物質(zhì)的峰面積(Y)對其在血漿中的濃度(X)進行回歸分析，所得4種成分的標準曲線方程、線性范圍、相關(guān)系數(shù)及檢測限和定量限見表1。表明丹酚酸B、人參皂苷Rg1、三七皂苷R1、丹參酮ⅡA在線性范圍內(nèi)相關(guān)性良好。

2.6.3精密度與準確度 取空白血漿，加入混合對照品制成高、中、低濃度質(zhì)量控制樣品，按“2.5”項方法處理，每個濃度連續(xù)進樣5次，連續(xù)5 d，通過標準曲線計算含量，計算日內(nèi)與日間精密度及準確度，結(jié)果見表2。結(jié)果表明Waters I-class超高效液相色譜儀的精密度良好。

表1 血漿中4種成分標準曲線和線性范圍

Tab.1Standardcurveandlinearityrangeoffourcomponentsinplasma

成分回歸方程線性范圍/(ng·mL-1)相關(guān)系數(shù)(r)檢測線定量限(ng·mL-1)三七皂苷R1Y=7.99X+25.520～10000.990 03.2010.92人參皂苷Rg1Y=545.76X-557420～10000.995 14.5913.35丹酚酸BY=83.12X-30120～10000.991 05.1016.22丹參酮ⅡAY=2496.92X+76420～10000.990 12.516.90

2.6.4基質(zhì)效應(yīng)與提取回收率 首先，按照對照品的配制方法分別配制高、中、低濃度對照品溶液，按“2.1”項條件下測定并記錄4種成分的峰面積A1、B1、C1、D1，每個濃度點平行測定5次。其次，取空白血漿按照“2.5”項方法處理后加入上述4種成分高、中、低濃度對照品溶液，測得4種成分峰面積分別為A2、B2、C2、D2，每個濃度點平行測定5次。然后，按照樣品處理方法直接測定高、中、低濃度的4種成分的對照品溶液，測定4種成分的峰面積分別為A3、B3、C3、D3，每個濃度點平行測定5次。最終，基質(zhì)效應(yīng)為峰面積A2、B2、C2、D2與峰面積A1、B1、C1、D1之比，高、中、低濃度平均基質(zhì)效應(yīng)分別為三七皂苷R1：102.5%，110.3%，108.1%；人參皂苷Rg1：97.8%，95.9%，100.6%；丹酚酸B：99.2%，96.2%，94.8%，丹參酮ⅡA：101.2%，105.1%，101.8%；提取回收率為A3、B3、C3、D3與A2、B2、C2、D2之比，高、中、低濃度平均提取回收率分別為三七皂苷R1：88.3%，86.1%，81.9%；人參皂苷Rg1：91.3%，89.9%，87.2%；丹酚酸B：93.7%，90.3%，91.2%；丹參酮ⅡA：101.2%，103.1%，102.5%。結(jié)果說明，基質(zhì)效應(yīng)不影響4種成分測定且回收率結(jié)果良好。

表2 大鼠血漿中4個指標成分日內(nèi)和日間精密度及準確度測定結(jié)果

Tab.2Inter-andintra-dayprecisionandaccuracyoffourmakercomponentsinratplasmang·mL-1，n=5

成分加入量日內(nèi)平均測得量精密度(RSD)準確度(RE)%日間平均測得量精密度(RSD)準確度(RE)%三七皂苷R12019.144.09-4.3019.115.34-4.4510094.285.32-5.7294.176.31-5.831000948.906.03-5.11948.106.23-5.20人參皂苷Rg12018.775.21-6.1318.588.11-7.1210096.304.21-3.7096.675.34-3.331000955.006.50-4.50948.317.32-5.17丹酚酸B2019.116.66-4.4718.966.99-5.19100103.495.673.49102.228.232.221000946.914.21-5.31940.403.13-5.96丹參酮ⅡA2018.666.50-6.6618.586.68-7.0910095.895.06-4.1194.795.55-5.211000956.914.67-4.31938.115.01-6.19

2.6.5穩(wěn)定性實驗 精密吸取血漿200 μL，加入高、中、低濃度丹酚酸B、人參皂苷Rg1、三七皂苷R1、丹參酮ⅡA對照品溶液，按照“2.5”項方法進行處理，制成高、中、低濃度質(zhì)控樣品，在5種條件下進行處理： ①放于室溫中6 h；②凍融3次；③-20 ℃儲存30 d；④-80 ℃儲存30 d；⑤血漿處理后4 ℃存放2，8，12 h，結(jié)果可得4種成分的RSD<6.2%，表明血漿樣品在5種條件下穩(wěn)定性良好。

2.7血漿的藥動學研究 將血漿樣品按“2.4”項方法采集，按“2.5”項方法處理，按“2.1”項條件下測定，記錄4種成分的峰面積，代入回歸方程中，計算4種成分隨時間變化體內(nèi)吸收濃度。所得數(shù)據(jù)用DAS軟件進行非房室模型擬合，計算藥動學參數(shù)。得出各被測成分平均血藥濃度-時間曲線，見圖2，主要藥動學參數(shù)見表3。

2.8復方丹參片與復方丹參滴丸中4種成分45 min時體內(nèi)含量測定 將復方丹參片與復方丹參滴丸分別研成粉末，用羧甲基纖維素鈉制成混懸液，按兩種取藥量方式進行給藥，①取等量復方丹參片與復方丹參滴丸各0.6 g；②按照復方丹參片與滴丸日服用量，取高(片劑：9片、滴丸：30丸)、中(片劑：6片、滴丸：20丸)、低(片劑：3片、滴丸：10丸)劑量進行灌胃，根據(jù)權(quán)重可得在45 min時4種成分吸收峰均較佳，故以此圖譜為標準圖譜進行45 min時灌胃復方丹參片與復方丹參滴完體內(nèi)含量計算。按照“2.4”項采血，按照“2.5”項處理方法，按照“2.1”項色譜條件進行含量測定，結(jié)果見表4。通過同時測定復方丹參片與復方丹參滴丸中4種有效成分含量，進一步運用復方丹參片與復方丹參滴丸來驗證該色譜條件及處理方法的可行性，并為兩種復方丹參方制劑的質(zhì)量檢測提供依據(jù)，為復方丹參片與復方丹參滴丸有效成分在大鼠體內(nèi)含量特征提供參考。

圖2 大鼠灌胃給予復方丹參方后三七皂苷R1 (A)、人參皂苷Rg1 (B)、丹酚酸B (C)、丹參酮ⅡA(D)在血漿中藥物濃度-時間曲線(n=5)

Fig.2Meanplasmaconcentration-timeprofileofnotoginsenosideR1(A)、ginsenosideRg1(B)、salvianolicacidB(C)andtanshinoneⅡA(D)inratplasmaafteroraladministrationofcompoundDanshenpreparation(n=5)

表3 大鼠灌胃給予復方丹參方后4種成分在血漿中主要藥動學參數(shù)

Tab.3MainplasmapharmacokineticsoffourcomponentsinratplasmaafteroraladministrationofcompoundDanshenpreparation

成分AUC(0-t)AUC(0-∞)(μg·h·L-1)tmax/hCmax/(μg·L-1)MRT(0-t)/ht1/2z/hVz/(L·kg-1)Cl/L/(h·kg-1)丹酚酸B2 848.7±1 021.33 574.3±577.71.5±01 784.0±322.32.3±0.58.8±0.72 122.6±578.3167.3±45.1人參皂苷Rg11 957.6±981.52 297.2±832.50.5±0.11 811.0±452.62.5±0.24.7±1.3887.9±302.5130.6±56.7三七皂苷R1886.5±311.81 615.4±409.10.3±0330.0±112.73.9±0.49.1±1.2986.6±541.274.9±70.1丹參酮ⅡA5 459.9±2011.616 161.7±1769.91.5±03 300.0±1223.63.5±0.125.9±1.5255.1±77.56.8±4.2

表4 復方丹參片與復方丹參滴丸中4種成分在大鼠體內(nèi)45 min時含量

Tab.4ContentoffourcomponentsofcompoundDanshentabletsandcompoundDanshendrippingpillsinRatsafter45mintreatment

劑型給藥量成分測得量/ngRSD/%片劑0.6 g三七皂苷R115.195.15丹酚酸B75.036.11人參皂苷Rg122.114.31丹參酮ⅡA47.743.883片三七皂苷R128.226.87丹酚酸B39.433.77人參皂苷Rg1200.125.13丹參酮ⅡA60.143.326片三七皂苷R138.326.23丹酚酸B78.335.16人參皂苷Rg1423.993.45丹參酮ⅡA93.323.679片三七皂苷R169.137.11丹酚酸B769.584.81人參皂苷Rg1130.333.99丹參酮ⅡA171.035.11劑型給藥量成分測得量/ngRSD/%滴丸0.6 g三七皂苷R131.195.14丹酚酸B23.944.53人參皂苷Rg147.004.21丹參酮ⅡA0.000.0010丸三七皂苷R145.555.17丹酚酸B38.004.32人參皂苷Rg154.423.88丹參酮ⅡA0.000.0020丸三七皂苷R176.755.74丹酚酸B69.323.88人參皂苷Rg191.667.66丹參酮ⅡA0.000.0030丸三七皂苷R192.745.78丹酚酸B154.185.12人參皂苷Rg1111.534.79丹參酮ⅡA0.000.00

3 討論

3.1指標成分的選擇 中藥復方是指在辨證審因決定治法以后，選擇合適的藥物酌定用量，按照組成原則妥善配伍而成的一組藥物。其所含化學成分復雜，如何選擇控制指標為其難點，本實驗參考《中華人民共和國藥典》[1]及文獻[9-14]，丹參藥材中主要含有水溶性成分和脂溶性成分，故選擇水溶性成分中丹酚酸B和脂溶性成分中丹參酮ⅡA為指標；三七中主要成分為皂苷類，最終選擇三七皂苷R1、人參皂苷Rg1作為指標成分，所選指標成分不僅代表性強，同時科學合理，將復方丹參方中丹參、三七主要有效成分于同一色譜條件下展現(xiàn)出來。

3.2色譜條件的選擇 將所含發(fā)色團、助色團不同的4種成分于同一波長下檢測出來，首先將丹酚酸B、人參皂苷Rg1、三七皂苷R1、丹參酮ⅡA進行全波長掃描，丹酚酸B在280 nm、丹參酮ⅡA在270 nm、三七皂苷R1在203 nm處有最大吸收，因三七中皂苷發(fā)色團與助色團較少，只能在低波長處檢測出來，因203 nm處存在末端吸收，通過不斷的調(diào)整流動相比例，使得檢測成分吸收峰與末端吸收峰分離度大于1.5，最終以末端吸收203 nm進行色譜條件的探索，同時實驗運用超高效液相色譜儀，將此圖譜于10 min內(nèi)展現(xiàn)出來，分析時間短，分離度好，有利于藥品檢測機構(gòu)高效的檢測送檢樣品，節(jié)省人力、物力。其次，參考相關(guān)文獻及《中華人民共和國藥典》，通過調(diào)整流動相比例，比較流動相為0.02%磷酸水-含0.02%磷酸的80%乙腈、甲醇-水、醋酸甲醇-醋酸水、水-乙腈、醋酸水-乙腈時所得色譜圖中峰數(shù)、峰型、峰高、峰面積，最終選擇0.02%磷酸水-含0.02%磷酸的80%乙腈為流動相進行檢測。同時進行柱溫考察，當25，30，35，40 ℃時，最終選擇40 ℃為檢測柱溫。以此色譜條件為基礎(chǔ)，測定4種成分在大鼠血漿中藥動學過程，同時在采血45 min處比較復方丹參片與復方丹參滴丸主要有效成分在大鼠體內(nèi)吸收情況。

3.3血漿處理方法的選擇 在對采血量的選擇過程中，參考文獻[4-8]選擇血漿200 μL進行研究，在檢測過程中發(fā)現(xiàn)大鼠血漿中藥物的含量較小，對藥動學過程會產(chǎn)生影響，同一只大鼠進行多次采血，結(jié)果未測出其中2種成分，本實驗后采取一只動物一個點進行研究，實驗購買同一批大鼠，飼養(yǎng)環(huán)境相同，嚴格控制大鼠的一致性，最終采取大鼠血漿800 μL進行研究，提高藥動學研究過程中檢測的穩(wěn)定性。在對血漿處理方法選擇時，依照簡單、方便的原則選擇甲醇、10%三氯乙酸、乙腈對血漿進行一步沉淀處理，甲醇處理所得色譜圖末端吸收嚴重，故不選用；10%三氯醋酸處理所得色譜圖中丹酚酸B回收率低，同時色譜圖中出現(xiàn)非檢測成分的較大吸收峰，影響所選成分的檢測，故不選；乙腈處理所得色譜圖中丹酚酸B、人參皂苷Rg1、三七皂苷R1、丹參酮ⅡA回收率良好，故選擇乙腈對其進行沉淀蛋白。

3.4血漿藥動學參數(shù) 根據(jù)藥動學結(jié)果，得出4種成分在給藥后10 min內(nèi)均能檢測出來，藥物吸收較快。丹參酮ⅡA的血漿濃度-時間曲線下面積(AUC)大于其他成分AUC，且丹參酮ⅡA的給藥劑量小于其他成分給藥劑量，原因可能丹酚酸B為親脂性成分，其余均為親水性成分，親水性物質(zhì)[13]經(jīng)細胞旁路過腸膜，由于旁路細胞占腸上皮細胞總表面積小于0.1%，上皮細胞之間的緊密連接限制了藥物吸收，所以親水性化合物的吸收較差。三七皂苷R1在體內(nèi)吸收相比于其他三種成分最快，達峰時間為0.29 h，人參皂苷Rg1的AUC是三七皂苷R1的3倍，最大吸收濃度為7倍，由此可見人參皂苷Rg1給藥后口服吸收優(yōu)于三七皂苷R1。

本實驗同時測定大鼠體內(nèi)4種成分的藥動學過程，節(jié)省實驗及分析時間，10 min內(nèi)快速將4種成分在同一圖譜中檢測出來，能說明復方丹參方中主要有效成分整體的含量在體內(nèi)的變化過程，從而為進一步探索提高復方丹參方主要成分整體在體內(nèi)的吸收提供方法與依據(jù)。