熊哲，謝家璇，朱鯤博，張雅婷，楊榮

(江漢大學(xué)醫(yī)學(xué)院1.生理教研室；2.2017級(jí)臨床實(shí)驗(yàn)班，武漢 430056)

芍藥苷(paeoniflorin，Pae)源于毛茛科植物芍藥的根，是芍藥的主要有效成分。該藥具有擴(kuò)張血管、解痙鎮(zhèn)痛、抗炎等作用，但其作用機(jī)制未被完全闡明。研究表明，多個(gè)受體和離子通道可能是芍藥苷發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)作用的靶點(diǎn)[1-2]。酸敏感離子通道(acid-sensing ion channels，ASICs)是H+門控的陽離子通道，在外周神經(jīng)系統(tǒng)，ASICs作為酸感受器參與痛覺產(chǎn)生與調(diào)制，也是筆者前期研究工作的主要靶點(diǎn)之一[3-4]。芍藥苷是否能通過調(diào)控ASICs發(fā)揮鎮(zhèn)痛作用，筆者尚未見研究報(bào)道。筆者在本研究運(yùn)用行為學(xué)和全細(xì)胞膜片鉗方法觀察芍藥苷鎮(zhèn)痛作用與大鼠三叉神經(jīng)節(jié)(trigeminal ganglion，TG)神經(jīng)元上ASICs關(guān)系，探討其可能作用機(jī)制，以期為芍藥苷用于臨床疼痛治療提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 行為學(xué)和膜片鉗實(shí)驗(yàn)均選用健康 SD 雄性大鼠，7～8周齡，體質(zhì)量180～200 g，由華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供[動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào)：醫(yī)動(dòng)字第 19-025號(hào)；實(shí)驗(yàn)動(dòng)物合格證號(hào)：SCXK(鄂)2010-0007號(hào)]，均自由飲食，飼養(yǎng)室溫度(23±2)℃，光暗周期同晝夜周期，相對(duì)濕度 (60±5)%。

1.2藥品與試劑 芍藥苷購自南京替斯艾么中藥研究所(淡黃色粉末，相對(duì)分子質(zhì)量480.46，含量>98%，批號(hào)：TCM068-100316)；腺苷A1受體拮抗劑1，3-二丙基-環(huán)戊黃嘌呤(8-cyclopentyl-1，3-dipropylxanthine，DPCPX，批號(hào)：9A/70155，Tocris公司 )，ASICs拮抗劑阿米洛利(amiloride，批號(hào)：BCBB4202)、三磷酸腺苷鎂(MgATP)、4-羥乙基哌嗪乙磺酸(4-[2-hydroxyethyl]-1-piperazineethanesulfonic acid，HEPES) 、 2-嗎啉乙磺酸 (2-[N-morpholino] ethanesulfonic acid，MES)均購自Sigma公司；木瓜蛋白酶(Roche公司，批號(hào)：201206)；DMEM/F-12培養(yǎng)基(Gibco公司，批號(hào)：12400-016)，其他藥品均為國(guó)產(chǎn)分析純。記錄 ASICs 電流細(xì)胞外液組成成分(mmol·L-1)：氯化鈉(NaCl) 150，氯化鉀(KCl) 5，氯化鎂(MgCl2) 2，氯化鈣(CaCl2) 2，葡萄糖(glucose)10，HEPES 10，辣椒平(Capsazepine，CPZ) 0.01；分別用10 mmol·L-1MES在pH值6.9～5.9，或者10 mmol·L-1醋酸(acetate)在pH值<5.9范圍內(nèi)替代10 mmol·L-1HEPES調(diào)整pH值。

記錄ASICs電流的電極內(nèi)液組成成分(mmol·L-1)：KCl 140，HEPES 10， MgCl22，二醇-雙-(2-氨基乙基)四乙酸(EGTA) 10，MgATP 2，用氫氧化鉀(KOH)調(diào)整pH值為7.2～7.4。

1.3儀器與設(shè)備 Axon patch 200B型膜片鉗放大器，P-97型微電極拉制儀和MP-285型微操縱器(美國(guó)Sutter 公司) ，Axiovert 200型倒置顯微鏡(德國(guó)Zeiss公司)。

1.4動(dòng)物分組、模型制備與給藥方法 采用隨機(jī)數(shù)字表法，將大鼠分為5組，每組5只：對(duì)照組，模型組，阿米洛利組，芍藥苷組，DPCPX+芍藥苷組。造模前15 min，分別在上述各組大鼠右側(cè)觸須墊中央部位皮下注射0.9%氯化鈉溶液(NS)、NS、阿米洛利(30 μg)、NS和DPCPX(10 μg)各50 μL；5 min后分別腹腔注射NS、NS、NS、芍藥苷(50 mg·kg-1)和芍藥苷(50 mg·kg-1)。芍藥苷、阿米洛利和DPCPX于實(shí)驗(yàn)前用NS溶解。腹腔注射10 min后開始制作面部炎性疼痛模型，對(duì)照組利用微量注射器取NS 50 μL注射到大鼠右側(cè)面部觸須墊皮下，其余4組右側(cè)面部皮下注射5% 甲醛50 μL。注射完畢后，立即將大鼠置有機(jī)玻璃觀察箱 (30 cm×30 cm×30 cm)，視頻捕捉系統(tǒng)記錄大鼠自發(fā)痛行為。以大鼠抓搔注射部位時(shí)間( s )作為衡量疼痛行為指標(biāo)，以3 min 為一觀察時(shí)段，連續(xù)記錄45 min。

1.5細(xì)胞的培養(yǎng) SD大鼠腹腔注射20%烏拉坦麻醉(1.2 g·kg-1)，斷頭，迅速取出三叉神經(jīng)節(jié)，置于冷無鈣Hank’s平衡鹽溶液(Hank’s balanced salt solution，HBSS)。HBSS中沖洗2次，剪碎并加入木瓜蛋白酶150 μL、L-半胱氨酸5 mg，HBSS定容至3 mL，37 ℃，5% CO2培養(yǎng)箱消化40～50 min。然后用Pasteur管輕輕吹打使細(xì)胞分散，將細(xì)胞懸液轉(zhuǎn)入10 mL離心管，用含10%胎牛血清DMEM/F-12培養(yǎng)基定容5 mL，1 000 r·min-1離心3次(r=8 cm)，每次5 min。將分離的單個(gè)三叉神經(jīng)節(jié)細(xì)胞滴到多聚賴氨酸包被的蓋玻片，37 ℃，5%CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)過夜。

1.6全細(xì)胞膜片鉗記錄及數(shù)據(jù)的采集和分析 采用全細(xì)胞膜片鉗技術(shù)，在電壓鉗模式下記錄酸敏感離子通道電流。微電極由微電極拉制器兩步拉制而成，使其在充滿電極內(nèi)液后的電阻維持在2～5 MΩ。通過微操縱器控制電極使封接電阻達(dá)GΩ 后，輕施負(fù)壓使細(xì)胞破膜，調(diào)節(jié)相應(yīng)電容補(bǔ)償，即可獲得全細(xì)胞模式。實(shí)驗(yàn)過程中，細(xì)胞均鉗制在-60 mV。信號(hào)采集頻率10 kHz，濾波頻率5 kHz，采樣后數(shù)據(jù)應(yīng)用Clampfit 8.2進(jìn)行分析。給藥通過快速換液裝置的排管進(jìn)行，管口距所記錄的細(xì)胞約50 μm。

酸性液體作用的量效曲線用Hill方程擬合：I/Imax=[1+ {(pH)/pH50}n]-1，n為Hill系數(shù)，I為特定pH值時(shí)記錄到的電流幅度。pH50為半數(shù)有效pH。藥物對(duì)ASIC電流的抑制率按照下列公式計(jì)算：抑制率(%)=(對(duì)照ASIC電流幅值-藥物作用時(shí)ASIC電流幅值)/對(duì)照ASIC電流幅值×100%。

1.7統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用Sigmaplot 9.0版軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，實(shí)驗(yàn)結(jié)果以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)誤表示，t檢驗(yàn)，以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1芍藥苷對(duì)大鼠TG神經(jīng)元上ASICs介導(dǎo)的酸誘導(dǎo)電流(Iasic)的調(diào)制作用 為研究芍藥苷對(duì)TG神經(jīng)元上Iasic影響，在細(xì)胞外液中加入10 μmol·L-1TRPV1阻斷劑Capsazepine(CPZ)，以排除TRPV1介導(dǎo)的酸誘導(dǎo)電流對(duì)實(shí)驗(yàn)的干擾。選擇在中小直徑大鼠TG神經(jīng)元 (15～30 μm)通過全細(xì)胞膜片鉗技術(shù)記錄Iasic。實(shí)驗(yàn)中大部分受檢細(xì)胞(82.4%，98/119)對(duì)pH 5.9外液敏感，產(chǎn)生一個(gè)內(nèi)向電流，阿米洛利(100 μmol·L-1)可明顯抑制酸性外液在TG神經(jīng)元上誘發(fā)的內(nèi)向電流，提示該內(nèi)向電流由ASICs介導(dǎo)。該電流主要表現(xiàn)出3種形態(tài)：S型(slow type)為緩慢失活的內(nèi)向電流(59.2%)、F型(fast type)為快速失活的內(nèi)向電流(8.2%)、B型(biphasic inward current)是雙內(nèi)向電流(32.6%)，B型先出現(xiàn)一個(gè)快速失活的內(nèi)向電流，緊跟著出現(xiàn)一持續(xù)內(nèi)向電流(圖1)。

單獨(dú)應(yīng)用芍藥苷未誘導(dǎo)出電流。實(shí)驗(yàn)中預(yù)加100 μmol·L-1芍藥苷5 min 后，再給予酸性外液(pH值5.9)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，芍藥苷對(duì)3種形態(tài)Iasic峰值均有明顯抑制作用，100 μmol·L-1芍藥苷使S型、F型和B型Iasic峰值分別減少了(36.8±5.1)%(n= 6，P<0.01)、(34.8±4.9)% (n=8，P<0.01) 和(37.4±6.6)% (n=6，P<0.01)，提示芍藥苷對(duì)3種形態(tài)Iasic有類似抑制作用(圖1)。

芍藥苷(100 μmol·L-1)和阿米洛利(100 μmol·L-1)對(duì)酸性外液(pH 5.9)誘發(fā)的緩慢失活型(A) 、快速失活型(B)和雙內(nèi)向電流(C)抑制作用。

圖1 芍藥苷和阿米洛利對(duì)大鼠TG神經(jīng)元ASICs電流的抑制作用

Representative slow inactivated current type (A), fast inactivated current type(B) and biphasic inward current type(C) activated by acid extracellular solution (pH 5.9) were inhibited by Pae (100 μmol·L-1) and amiloride (100 μmol·L-1).

Fig.1InhibitionofPaeandamilorideonASICscurrentinTGneuronsofRats

在10～1000 μmol·L-1濃度范圍內(nèi)，隨著芍藥苷濃度增加，其對(duì)Iasic(pH值5.9)抑制率也增加，最大抑制率(60.2±3.2)% (n=7)，IC50為78.12 μmol·L-1(圖2)。

2.2預(yù)加和不預(yù)加芍藥苷時(shí)Iasic量效關(guān)系 圖3A為100 μmol·L-1芍藥苷對(duì)不同pH值酸性外液誘發(fā)的Iasic的抑制作用。圖3B為不含和含有100 μmol·L-1芍藥苷時(shí)Iasic量效曲線。從圖3可見，預(yù)加100 μmol·L-1芍藥苷 5 min，Iasic量效曲線明顯下移，閾值和最大反應(yīng)pH值不變，預(yù)加芍藥苷前后兩條曲線pH50較接近，分別為6.46和6.38。

2.3芍藥苷對(duì)Iasic抑制作用機(jī)制 聯(lián)合應(yīng)用腺苷A1受體特異性拮抗劑DPCPX ( 1 μmol·L-1) 時(shí)，DPCPX能部分逆轉(zhuǎn)芍藥苷 (100 μmol·L-1) 對(duì)Iasic(pH值5.9)的抑制作用(n=7)(圖4)。

A.不同濃度芍藥苷(10～1000 μmol·L-1)抑制Iasic(pH值5.9)的典型電流圖；B.芍藥苷對(duì)Iasic(pH值5.9)的抑制作用有濃度依賴性。

圖2 芍藥苷濃度依賴性抑制大鼠TG神經(jīng)元Iasic

A.Representative current ofIasic(pH 5.9 ) inhibited with different concentration of Pae(10～1000 μmol·L-1); B.concentration-dependent inhibition of Pae onIasic(pH 5.9).

Fig.2Concentration-dependentinhibitionofPaeonIasicinTGneuronsofRats

2.4芍藥苷對(duì)甲醛誘導(dǎo)的面部炎性自發(fā)痛反應(yīng)的作用 大鼠頜面部皮下注射甲醛 (5%，50 μL)可誘發(fā)典型雙相(第一相：0～3 min，第二相：12～36 min)自發(fā)疼反應(yīng)，見圖5B。阿米洛利(30 μg)可明顯減少40%甲醛(福爾馬林)誘導(dǎo)的第二相(15～24 min)自發(fā)痛反應(yīng)，在第二相15～18 min時(shí)間段，阿米洛利預(yù)先處理使大鼠抓臉持續(xù)時(shí)間由(52.8±4.6)s減少到(33.1±4.2)s(P<0.01)，提示ASICs參與甲醛誘發(fā)的面部炎性自發(fā)痛的產(chǎn)生，見圖5A。預(yù)先腹腔注射芍藥苷 (50 mg·kg-1)，能明顯抑制甲醛注射后18～27 min內(nèi)自發(fā)痛反應(yīng)，此外，大鼠面部皮下預(yù)先注射DPCPX，可部分翻轉(zhuǎn)芍藥苷抗傷害性作用，見圖5B。

A.芍藥苷(100 μmol·L-1) 抑制不同pH值酸性外液誘導(dǎo)的Iasic；B.預(yù)加100 μmol·L-1芍藥苷后，Iacid量效曲線明顯下移。

圖3 芍藥苷對(duì)Iasic量效曲線的影響

A.Current traces showed that Pae(100 μmol·L-1) inhibitedIasicinduced by different pH acid extracellular solution; B.The Concentration-response curve ofIasicwith Pae(100 μmol·L-1) pretreatment shifted downwards significantly.

Fig.3EffectofPaeonDose-responsecurveofIasic

3 討論

筆者在本實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，ASICs參與了5%甲醛溶液皮下注射誘發(fā)的頭面部持續(xù)性疼痛反應(yīng)，芍藥苷可減輕該疼痛反應(yīng)。組織酸化是致痛的原因之一，H+可通過激活外周傷害性感受器上的辣椒素受體(transient receptor potential vanilloid-1，TRPV1)和ASICs產(chǎn)生疼痛[6]。研究報(bào)道芍藥苷可抑制TRPV1介導(dǎo)的炎癥因子釋放，從而產(chǎn)生抗傷害性作用[7]。在全細(xì)胞膜片鉗實(shí)驗(yàn)，筆者在細(xì)胞外液加入TRPV1特異性阻斷劑CPZ，整個(gè)實(shí)驗(yàn)過程中都能觀察到芍藥苷對(duì)阿米洛利敏感的H+誘導(dǎo)電流的抑制作用，說明TG上的ASICs是芍藥苷產(chǎn)生鎮(zhèn)痛作用的新分子靶點(diǎn)。

在10～1000 μmol·L-1范圍內(nèi)，隨著芍藥苷濃度增加，芍藥苷對(duì)TG神經(jīng)元上的ASICs電流的抑制率也增加，呈現(xiàn)明顯濃度依賴性。如圖3所示，芍藥苷(100 μmol·L-1)非常有效地抑制了各pH值誘導(dǎo)的ASICs電流，即使是pH 4.9誘導(dǎo)出ASICs電流最大值也被芍藥苷抑制，提示芍藥苷可能通過非競(jìng)爭(zhēng)性機(jī)制抑制ASICs。非競(jìng)爭(zhēng)性作用方式存在兩種可能性：一種是芍藥苷可通過跨膜信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑來抑制ASICs；另一種是芍藥苷直接結(jié)合到ASICs，然后通過變構(gòu)調(diào)節(jié)作用，進(jìn)而抑制ASICs電流。比較預(yù)加和不預(yù)加芍藥苷時(shí)ASICs電流的量效曲線有以下特點(diǎn)：①預(yù)加芍藥苷后濃度反應(yīng)曲線明顯下移；②兩種情況下pH50值非常接近，分別為(6.31 ± 0.13)和(6.21 ± 0.15)；③預(yù)加芍藥苷后最大反應(yīng)濃度時(shí)ASICs電流幅值減小(54.89±4.94)%。結(jié)果表明，兩種情況下ASICs對(duì)H+親和力基本不變，提示芍藥苷可能通過受體介導(dǎo)的跨膜信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑來抑制ASICs，而不是通過變構(gòu)調(diào)節(jié)來發(fā)揮作用。

A.腺苷A1受體拮抗劑DPCPX阻斷了芍藥苷抑制Iacid(pH=5.9)的典型電流圖；B.聯(lián)合應(yīng)用DPCPX(1 μmol·L-1)阻斷了芍藥苷(100 μmol·L-1)對(duì)Iacid(pH=5.9)抑制作用；與芍藥苷組比較，*1P<0.01。

圖4 芍藥苷抑制Iasic與腺苷A1受體關(guān)系

A.Adenosine A1 antagonist (DPCPX) abrogated the inhibition of Pae onIasic(pH=5.9) ; B.DPCPX combination abrogated the inhibition of Pae(100 μmol·L-1) onIasic(pH=5.9);*1P<0.01 versus Pae.

Fig.4RelationshipoftheinhibitionofPaeonIasicandadenosineA1antagonist

ASICs拮抗劑對(duì)口面部炎性疼痛有鎮(zhèn)痛作用，提示ASICs 參與口面部炎性疼痛信息的產(chǎn)生和(或)傳導(dǎo)。研究報(bào)道芍藥苷可激活腺苷A1受體來產(chǎn)生神經(jīng)保護(hù)作用[8-10]。腺苷A1受體在神經(jīng)系統(tǒng)分布廣泛，在三叉神經(jīng)節(jié)中也存在大量A1受體[11-12]。本實(shí)驗(yàn)中，面部皮下注射A1受體拮抗劑DPCPX可部分阻斷芍藥苷鎮(zhèn)痛效應(yīng)，提示外周A1受體參與了芍藥苷鎮(zhèn)痛作用。此外，筆者還發(fā)現(xiàn)DPCPX可部分阻斷芍藥苷對(duì)ASICs電流抑制作用，表明TG神經(jīng)元上A1受體是芍藥苷發(fā)揮鎮(zhèn)痛作用的靶點(diǎn)之一。

A.阿米洛利對(duì)Formalin誘發(fā)疼痛反應(yīng)的抑制作用；B.Pae的面部鎮(zhèn)痛作用；與模型對(duì)照組比較，*1P<0.01，*4P<0.05；與對(duì)照組比較，*2P<0.01，*3P<0.05；與芍藥苷組比較，*5P<0.05。

圖5 芍藥苷抗傷害性作用與腺苷A1受體關(guān)系

A.amiloride attenuated formalin-induced pain response；B.analgesic effect of Pae on face；Compared with model group,*1P<0.01，*4P<0.05；Compared with control group,*2P<0.01，*3P<0.05；Compared with Pae group,*5P<0.05.

Fig.5Relationshipofanti-nociceptiveresponseofPaeandadenosineA1antagonist

綜上所述，芍藥苷對(duì)口面部外周炎性痛的鎮(zhèn)痛效應(yīng)與其作用于A1受體進(jìn)而下調(diào)TG神經(jīng)元上ASICs的敏感性有關(guān)。本研究結(jié)果對(duì)闡明芍藥苷的鎮(zhèn)痛作用機(jī)制提供了一定的理論和實(shí)驗(yàn)依據(jù)。