胥 偉，姜依何，田雙紅，朱 旗,*

（1.湖南農業(yè)大學茶學教育部重點實驗室，湖南 長沙 410128；2.四川農業(yè)大學園藝學院，四川 成都 611130）

黑茶初制生產工序歷經殺青、揉捻、渥堆和干燥，由此將茶樹鮮葉制得黑毛茶[1]，黑毛茶再通過篩分、軋切、風選、拼堆、蒸壓、發(fā)花等精制工序加工成不同品質風格的黑茶產品。中國茶葉流通協(xié)會報道了2018年全國黑茶產量為31.89萬 t，占比六大茶類總量的12.20%，位居六大茶類第2位[2]。由于生產黑茶的鮮葉原料采摘通常較為粗老，加工成的黑毛茶需在庫房中存放1～2 a才能進行精制[3]，同時，售出的黑茶商品，消費者通常將其存放一段時間以改善其粗澀的口感。在黑毛茶或成品黑茶貯存過程中，如果遇到高濕高溫的環(huán)境條件，特別是南方的梅雨季節(jié)，茶葉表面則極易滋生霉菌[4-5]，輕者有風霉味，重者失去飲用價值[6]，甚至產生安全問題。

從有關黑茶微生物群落構成的研究成果看，正常生產上暫未發(fā)現黃曲霉菌株的報道[7]。但從外源接種的角度看，黃曲霉可在潮水或回潮的茶葉樣本上生長[8-11]。赭曲霉素A是一類重要的廣泛存在于食品和飼料中的真菌毒素[12]，赭曲霉毒素最初從赭曲霉代謝產物中發(fā)現[13]，進一步研究表明曲霉屬（Aspergillus）和青霉屬（Penicillium）真菌[14]均產生該類具有致癌、致畸、致免疫抑制、致肝臟毒性及嚴重腎毒性的次生代謝產物[15-16]。脫氧雪腐鐮刀菌烯醇（deoxynivalenol，DON），俗稱“嘔吐毒素”，主要是一類由禾谷鐮刀菌和黃色鐮刀菌產生[17]的能夠引起動物或人類嘔吐、腹瀉甚至腸道壞死的次生代謝產物[18]，而嘔吐毒素因其具有明顯的急性致嘔作用而在相關研究中常被報道[9]。

為了解高濕條件下霉變給黑毛茶品質帶來的影響，本研究人工設定溫度和相對濕度環(huán)境促進霉菌在黑毛茶上生長，通過高效液相色譜法及液相色譜-串聯質譜法測定黑毛茶霉變過程中多種品質化學組分及3 種真菌毒素的含量，為高濕霉變導致黑毛茶品質劣變的發(fā)生規(guī)律提供相關依據。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

將來源于黑茶生產企業(yè)的黑毛茶（2016年5月產于湖南省桃源縣，一級，含水量（10.05±0.20）%）樣品盛于培養(yǎng)皿（培養(yǎng)皿開口，每份培養(yǎng)皿15 g茶樣，分別置于培養(yǎng)箱內5 層柵狀隔板上，每層12 份，合計60 份），并置于生化培養(yǎng)箱進行促霉培養(yǎng)。培養(yǎng)條件：溫度25 ℃，相對濕度90%。

人工促霉培養(yǎng)過程中分別按培養(yǎng)至第0、5、7、9、11、13、15天依照柵狀隔板分層取樣混勻，-20 ℃密封凍存。

從市場收集2 份自然霉變黑茶樣品（霉變茯磚茶：ZM1，霉變花卷茶：ZM2）用于真菌毒素的對照分析。

1.2 儀器與設備

GZ-150-HSII恒溫恒濕箱 韶關市廣智科技設備有限公司；PB303-N電子天平 梅特勒-托利多儀器有限公司；LDP-350型高速多功能粉碎機 浙江永康市紅太陽機電有限公司；XMTD-7000恒溫水浴鍋箱 上海精宏實驗設備有限公司；N13462C移液器 德國Eppendorf公司；KQ3200B超聲波清洗器 昆山超聲儀器有限公司；UV-2550紫外-可見分光光度計、LC-20AT高效液相色譜儀 日本島津公司；ACCQ·TagTM氨基酸分析色譜柱（3.9 mm×150 mm，5 μm） 美國Waters公司；ECOSIL-C18色譜柱（4.6 mm×150 mm，5 μm） 廣州綠百草科學儀器有限公司；R-300旋轉蒸發(fā)儀 瑞士Büchi公司；1290-6460液相色譜-串聯質譜儀 美國Agilent公司；Aquelix 5超純水制備儀 美國Millipore公司；35R超速離心機 德國Rotina公司；3001型酶標儀美國Thermo公司。

1.3 方法

1.3.1 茶湯制備

準確稱取粉碎茶樣5.0 g于500 mL三角瓶中，加沸騰蒸餾水450 mL，沸水浴浸提45 min，過濾，洗滌殘渣，濾液合并于500 mL容量瓶中，冷卻后定容，搖勻，待測。測定前待測樣過0.45 μm濾膜，取濾液上機待測。

1.3.2 水分及多酚總量測定

水分含量測定參考GB 5009.3—2016《食品中水分的測定》[19]；茶多酚含量測定參考GB/T 8313—2008《茶葉中茶多酚和兒茶素類含量的檢測方法》[20]。

1.3.3 高效液相色譜分析

兒茶素組分、嘌呤堿、游離氨基酸含量及沒食子酸含量測參考劉建軍等[21]的方法。

兒茶素及嘌呤堿含量測定色譜條件：ECOSIL-C18色譜柱（4.6 mm×150 mm，5 μm）；檢測波長200 nm；進樣量10 μL；柱溫40 ℃；流速1.0 mL/min；流動相A為超純水，流動相B為40% N,N-二甲基甲酰胺溶液溶液。梯度洗脫程序：0.01 min，9% B；10 min，14% B；15 min，23% B；27 min，36% B；31 min，36% B；32 min，9%B；37 min，停止。

給出一個訓練集Τ={(xi,yi),i=1...l}，其中xi∈RN,yi∈R，在特征空間F 中構造一個線性回歸方程：

游離氨基酸組分色譜條件：ACCQ·TagTM色譜柱（3.9 mm×150 mm，5 μm）；檢測波長220 nm；進樣量20 μL；柱溫37 ℃；流速1.0 mL/min；流動相A為10% ACCQ·TagTM洗脫液，流動相B為60%乙腈溶液。梯度洗脫程序：0.01 min，0% B；0.5 min，2% B；15 min，7% B；19 min，10% B；32 min，33% B；34 min，100% B；37 min，100% B；39 min，0% B；42 min，0% B；42.01 min，停止。1.3.4 液相色譜-串聯質譜檢測

1.3.4.1 試樣制備

稱取2.0 g茶樣于50 mL離心管中，加入內標物玉米烯酮（10 μg/kg）和DOM-1（25 μg/kg）。加入10 mL乙酸乙酯-甲酸（99∶1，V/V）溶液，振搖30 min。3 200×g離心15 min。上清液定容到10.0 mL。取2.0 mL于試管中，氮吹近干再用1.0 mL乙腈-水（84∶16，V/V）復溶，這部分提取液稱為“提取液1”。剩下8.0 mL提取液（提取液2）通過200 mg/3 mL的NH2固相萃取柱（用3 mL乙酸乙酯-甲酸（99∶1，V/V）溶液活化），過濾液收集于試管中，NH2柱抽干10 min，過濾液氮吹近干，然后用2.0 mL乙腈-水（84∶16，V/V）復溶并通過500 mg/6 mL C18固相萃取柱（用5 mL乙腈-水（84∶16，V/V）活化）。提取液2通過C18柱后，提取液1也通過同一根C18柱。兩部分過濾液都收集于試管中，C18固相萃取柱抽干10 min，過濾液氮吹近干，然后用100 μL流動相水-甲醇（60∶40，V/V）和0.3%甲酸溶液復溶。14 000×g離心15 min，然后上機測定[22]。

1.3.4.2 液相色譜-串聯質譜測定條件

液相色譜條件：柱溫60 ℃；進樣量10.0 μL；流動相A為0.3%甲酸溶液，流動相B為甲醇-0.3%甲酸溶液；流速0.55 mL/min；洗脫程序：0～1 min，0% B；1～1.5 min，0%～15% B；1.5～8 min，15% B；8～8.5 min，15%～30% B；8.5～11 min，30%～40% B；11～12 min，40% B；12～14 min，40%～55% B；14～16 min，55% B；16～19 min，55%～85% B；19～20 min，85%～100% B；20～22 min，100% B；22～23 min，100%～0% B；23～25 min，0% B。

質譜條件：電噴霧離子源，正離子模式，溫度120 ℃；脫溶劑溫度400 ℃；毛細管電壓3.2 kV；碰撞氣體為氬氣；錐氮和脫溶劑氣流50～800 L/h。在每個分析物的前體離子選擇之后，產物離子與錐孔電壓和碰撞能相結合。為提高靈敏度和選擇性，在選定的反應監(jiān)測中進行數據采集。離子化質荷比分別為：AFB1：母離子m/z313.0，子離子m/z241.0、269.0；赭曲霉毒素A（ochratoxin A，OTA）：母離子m/z404.0，子離子m/z358.0、239.0；DON：母離子m/z297.0，子離子m/z249.0、203.3。

1.4 數據統(tǒng)計

采用Microsoft Excel 2007軟件和SPSS 22.0軟件進行數據統(tǒng)計分析。

2 結果與分析

2.1 黑毛茶霉變過程氨基酸組分變化

表1 氨基酸組分含量Table 1 Changes in amino acid composition during incubation of raw black tea at high humidity

氨基酸是茶湯呈味物質的主要構成之一，口感主要體現為鮮爽味，氨基酸含量的高低對茶湯鮮爽味的呈現起著很大的作用。如表1所示，氨基酸總量隨著霉變時間的延長而逐漸降低，在霉變之初0～5 d降低最快，降低率約為80.23%。茶氨酸為測定的18 種游離氨基酸組分中含量最高的一類氨基酸，未霉變時約占游離氨基酸總量的40.92%。在未霉變黑毛茶樣本中，含量前5的氨基酸組分為茶氨酸、精氨酸、谷氨酸、天冬氨酸和蛋氨酸，霉變第15天時排名前5的氨基酸組分為茶氨酸、天冬氨酸、谷氨酸、賴氨酸、苯丙氨酸。精氨酸和蛋氨酸含量在霉變過程中降解速度很快，說明精氨酸較容易成為霉菌的氮源而被霉菌所利用轉化。在18 種氨基酸組分中僅酪氨酸含量略有增加，未見因霉菌生化代謝轉化而導致某類氨基酸含量明顯上升的現象。采用最小顯著性差異法對茶氨酸和18 種氨基酸總和在不同霉變時期的含量進行差異顯著性分析。結果表明：茶氨酸從霉變起始至霉變第5天時含量變化呈顯著性差異（P＜0.05）；18 種氨基酸總量從霉變起始到霉變第7天時含量變化呈顯著性差異，霉變第9～15天含量變化呈現顯著性差異。

2.2 黑毛茶霉變過程嘌呤堿組分變化

表2 嘌呤堿組分含量Table 2 Changes in contents of purine alkaloids during incubation of raw black tea at high humidity

茶樹中的嘌呤堿主要為3 類：咖啡堿（1,3,7-三甲基黃嘌呤）、茶葉堿（1,3-二甲基黃嘌呤）、可可堿（3,7-二甲基黃嘌呤），是茶湯呈味物質的主要構成之一，口感主要體現為苦味。如表2所示，嘌呤堿總量在霉變起始階段（0～7 d）中的變化存在顯著性差異，而且表現出上升的趨勢。這可能與霉變起始階段其他內含成分降低迅速而嘌呤堿化學性質穩(wěn)定不易被霉菌利用有關。霉變第9～15天，嘌呤堿總量基本保持穩(wěn)定，無顯著性差異。茶堿霉變第9～15天呈顯著性差異，呈現上升趨勢，而這種上升的趨勢與咖啡堿的下降趨勢又表現出相對應的數量關系，這表明茶堿的變化主要由咖啡堿轉化而來。嘌呤堿總量隨著霉變時間的延長而表現出先升高后穩(wěn)定的規(guī)律，同時也說明霉菌生長所利用的氮源主要來源于氨基酸，而嘌呤堿的利用度較小。

2.3 黑毛茶霉變過程兒茶素組分及多酚含量變化

表3 兒茶素組分及多酚含量Table 3 Changes in contents of catechins and polyphenols during incubation of raw black tea at high humidity

茶多酚類物質是茶葉的主要呈味品質成分，本研究測定茶葉中主要存在的幾類兒茶素及沒食子酸，觀察霉變過程兒茶素組分的變化情況。如表3所示，EGC含量由起始的16.19 mg/g下降至6.26 mg/g；EGCG含量則由起始的31.51 mg/g下降至15.28 mg/g。而沒食子酸含量也相應有所降低，由起始的1.66 mg/g降低至0.96 mg/g；EC、DL-C及GCG含量則變化不大。茶多酚總量在促霉培養(yǎng)前5 d下降速度較快，由126.01 mg/g降低至110.18 mg/g（第5天檢出數據顯示與第0天呈顯著性差異），表明多酚類物質在霉菌侵染的過程中能夠被轉化吸收利用于霉菌自身代謝。從霉變起始至霉變第5天，無論是兒茶素組分還是多酚總量均表現出顯著性差異，呈現降低規(guī)律。而茶多酚總量從霉變第5天開始，隨著霉變時間的延長而不再表現顯著性降低趨勢。表明霉菌在霉變起始利用多酚類物質做為碳源最為劇烈，隨著霉菌的生長，開始向其他類物質攝取碳源物質。

2.4 霉變黑毛茶霉變過程3 種真菌毒素含量測定結果

圖1 3 種真菌毒素標準品色譜-質譜圖Fig. 1 Chromatograms and mass spectra of three mycotoxin standards

有學者采用酶聯免疫方法檢測黑茶中的真菌毒素[23-25]，但本研究前期實驗表明，由于黑茶茶色素的干擾導致酶聯免疫技術不適用于黑茶樣品的真菌毒素檢測，與相關文獻研究結論一致[26-28]。故采用液相色譜-串聯質譜技術研究霉變過程中AFB1、OTA和DON在霉變黑茶樣本及霉變過程中的存在情況。

如圖1和表4所示，測定的霉變黑茶樣品中OTA、DON、AFB13 種真菌毒素均未檢出（或低于檢出限），表明上述3 種真菌毒素并非廣泛存在于黑茶樣品中。而外源接種黃曲霉菌株（ACCC30899）的陽性對照黑毛茶樣品中檢出的AFB1含量為12.98 μg/kg，表明外源污染的真菌種類是導致霉變黑毛茶殘留真菌毒素的主要誘因。

表4 3 種真菌毒素含量Table 4 Changes in contents of three mycotoxins during incubation of raw black tea at high humidity

3 討 論

黑茶品質化學多集中于品質形成機理研究，但對于高濕霉變環(huán)境引起的黑茶品質劣變的研究較少。本研究從高濕條件下誘導黑毛茶的霉變過程著手，模擬梅雨季節(jié)的貯藏條件，研究霉變黑毛茶的主要品質成分變化規(guī)律及真菌毒素殘留狀況。

黑毛茶霉變過程中，氨基酸和兒茶素類物質在霉變初期（第0～5天）含量下降迅速，其中茶氨酸作為18 種游離氨基酸組分中含量最高的氨基酸，其含量的變化是霉變過程黑毛茶氨基酸下降的主要原因，實驗過程未檢測到因霉菌生化代謝轉化而導致某類氨基酸含量明顯上升的現象。從霉變起始至霉變第5天，茶氨酸和18 種氨基酸總量分別下降了71.65%和78.67%，至霉變第15天時，其含量僅為起始含量的12.31%和13.95%。表明霉變過程對黑茶品質帶來了極大的影響。3 種嘌呤生物堿的總量在霉變過程中基本保持穩(wěn)定，茶堿在霉變過程中有所上升，而咖啡堿則有所下降，兩者存在數量相關性，其原因可能在于部分霉菌存在嘌呤堿之間的轉化能力[29]。兒茶素類組分主要以EGCG和EGC的含量降低為主，不含沒食子酸基團的兒茶素（EC、DL-C）和非表型兒茶素（GCG）含量變化不大。這表明，霉菌存在水解兒茶素沒食子基團的能力，這在單體物質代謝研究中已經被證明[30-31]，但這種能力是否還受制于兒茶素的構型，有待進一步實驗證明。茶多酚和沒食子酸含量在霉菌侵染的過程中逐漸降低，表明該類物質能夠被霉菌所代謝和轉化，具體的代謝轉化機制及通路有待進一步研究。

本實驗采用液相色譜-串聯質譜技術研究霉變黑毛茶樣品中OTA、DON、AFB13 種真菌毒素，結果表明上述3 種真菌毒素并非廣泛存在于黑茶樣品中，而陽性對照樣品的檢出結果則說明了外源污染真菌種類可能是導致黑茶霉變產生真菌毒素的主要原因，生產上需要嚴格防范；高濕霉變條件下，多種茶葉有效成分降低，導致黑毛茶品質的下降，因此貯存環(huán)境的控制是保持黑毛茶品質的重要因素。與此同時，除防范生產過程導致的安全問題外，如若在霉變過程中發(fā)生了有害真菌的污染，高濕霉變也會導致黑毛茶品質的安全問題，高濕條件的霉變和產毒真菌的污染，應引起黑茶生產企業(yè)的高度重視。

4 結 論

高濕條件下，黑茶霉變迅速，多種內含成分在霉變起始至霉變第5天時表現出顯著性降低趨勢。霉變起始階段，霉菌利用黑茶品質成分用于自身碳代謝和氮代謝，氨基酸組分、18 種氨基酸總量、兒茶素組分及多酚總量均在霉變第5天時表現出顯著性降低趨勢。嘌呤堿化學性質穩(wěn)定，含量表現出先上升后維持穩(wěn)定的規(guī)律，霉變第9～15天時，茶堿含量的上升與咖啡堿含量的下降表現出對應的數量關系，表明霉菌存在將咖啡堿轉化成茶堿的生化機制。

酶聯免疫測試黑茶真菌毒素時，存在假陽性結果，不適用于黑茶真菌毒素的檢測。黑茶霉變過程中，有害霉菌污染可導致黑茶真菌毒素殘留。生產上，要嚴格保障倉儲環(huán)境，杜絕高濕條件下茶葉霉變產生真菌毒素殘留的食品安全問題。