劉瑋琳，孔有余，許賢康，鄭凌藝，柳葉霏，韓劍眾*

（浙江工商大學食品與生物工程學院，浙江 杭州 310018）

脂質(zhì)體是由雙親性分子自組裝形成的運載體系，具有高穩(wěn)定性[1]、靶向性[2]、生物相容性[3]和緩釋性[4]等優(yōu)點，已在食品、生物、醫(yī)學、農(nóng)學等領(lǐng)域有廣泛應(yīng)用[5-7]。近年來，脂質(zhì)體逐漸在食品領(lǐng)域嶄露頭角，用以保護敏感性功能成分的穩(wěn)定性或提高生物利用率[8-10]。水凝膠是介于固體與液體間的一種半固體結(jié)構(gòu)體系，具有高分子網(wǎng)絡(luò)狀結(jié)構(gòu)[11-12]。其中，互穿聚合物網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)（interpenetrating polymer network，IPN）[13]作為水凝膠的一種，存在化學交聯(lián)點使其在大部分溶劑中只能溶脹而不溶解，不發(fā)生蠕變和流動，從而有更好的黏接力[14-15]。水凝膠既可以作為一種食品，又可利用其緩釋性作為一種營養(yǎng)強化劑[16]。

脂質(zhì)體水凝膠是一種通過物理或化學交聯(lián)的方式將脂質(zhì)體與凝膠結(jié)合，從而提高脂質(zhì)體包封能力和緩釋作用的新型運載體系。Ditiaio等[17]在20世紀90年代開始了脂質(zhì)體水凝膠的研究，在醫(yī)用硅膠中植入抗生素的脂質(zhì)體水凝膠減少術(shù)后恢復的細菌感染率，與Gao Weiwei等[18]將包埋抗菌藥物的脂質(zhì)體水凝膠能抵抗金黃色葡萄球菌感染相驗證。但是，當前脂質(zhì)體水凝膠的應(yīng)用主要集中在藥學和材料學領(lǐng)域，而在食品中僅見如包埋白藜蘆醇以提高其釋放效率的報道[19]，脂質(zhì)體水凝膠運輸其他活性成分及在消化道的降解研究鮮見。

綜上所述，本實驗采用涂層法制備脂質(zhì)體與IPN膠交聯(lián)構(gòu)建脂質(zhì)體水凝膠并表征其物化性質(zhì)（粒徑、質(zhì)構(gòu)、微觀形貌）；以膨脹系數(shù)、傅里葉變換紅外光譜（Fourier transform infrared spectroscopy，F(xiàn)TIR）、差熱分析和交聯(lián)率探求兩者間的交聯(lián)機理和脂質(zhì)體在水凝膠的包埋方式，為脂質(zhì)體水凝膠應(yīng)用到食品領(lǐng)域提供一定的理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

卵磷脂、殼聚糖 美國Sigma公司；明膠、Hepes、氯化鈉 上海阿拉丁生化科技股份有限公司；轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶（microbial transglutaminase，mTG） 泰興市一鳴生物制品有限公司；磷測試盒 南京建成生物工程研究所。

1.2 儀器與設(shè)備

D11971型超純水系統(tǒng)、Multiskan Spectrum全波長酶標儀 美國Thermo Scientific公司；Sorvall BiofugePrimo R型高速冷凍離心機 美國Kendro公司；TA.XT Plus型組織分析儀 德國IKA公司；SW22型振蕩水浴槽 德國Julabo公司；pH計 梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司；MS3000型激光粒度分析儀 英國Malvern公司；Nicolet FTIR成像系統(tǒng)美國熱電公司；DTA-800差熱分析儀 上海研錦科學技術(shù)有限公司。

1.3 方法

1.3.1 脂質(zhì)體的制備

采用涂層法[20]，將高質(zhì)量濃度的磷脂溶液均勻涂在聚四氟乙烯板上，并放置在培養(yǎng)皿中，在55 ℃條件下用Hepes（0.05 mol/L、pH 5.5）溶液進行浸沒洗膜，避光密封處理，獲得磷脂質(zhì)量濃度為50 mg/mL的脂質(zhì)體。

1.3.2 脂質(zhì)體物化性質(zhì)的測定

采用動態(tài)激光粒度儀測量脂質(zhì)體的平均粒徑和表面電位。取1 mL脂質(zhì)體用純水稀釋至10 mL，混勻后取樣放入樣品池中進行測定，測定條件為20 ℃，磷脂和分散介質(zhì)的折射率的比值為1.120。每個樣品至少平行測定3 次。

通過透射電子顯微鏡表征脂質(zhì)體微觀形貌。用蒸餾水將脂質(zhì)體稀釋至1 mg/mL，將樣品滴加到銅網(wǎng)，而后用醋酸雙氧鈾溶液（2%）染色4 min，用濾紙吸去多余的液體后，在室溫條件下晾干，用透射電子顯微鏡表征其微觀結(jié)構(gòu)。

1.3.3 脂質(zhì)體水凝膠的制備和物化性質(zhì)分析

1.3.3.1 水凝膠的制備

明膠在55 ℃條件下用超純水溶解（6 g/100 mL），殼聚糖用1%的冰乙酸溶液溶解（3 g/100 mL）。分別將明膠與殼聚糖的質(zhì)量比按1∶4、1∶2、1∶1、2∶1、4∶1進行混合，與55 ℃恒溫振蕩混勻，30 min后分別加入質(zhì)量濃度為0、0.1、5、10、50 mg/mL的mTG，繼續(xù)55 ℃恒溫振蕩60 min，取出冰浴快速冷卻至出現(xiàn)固體的凝膠，于KCl（0.01 mol/L、pH 5.5）溶液浸沒2 h，取出4 ℃靜置過夜。

1.3.3.2 脂質(zhì)體水凝膠的制備

水凝膠的制備按1.3.3.1節(jié)方法進行，其中在mTG之后再迅速加入脂質(zhì)體溶液，使脂質(zhì)體在凝膠中的最終質(zhì)量濃度為12.5 mg/mL。

1.3.3.3 脂質(zhì)體水凝膠的外觀形貌

對不同配方脂質(zhì)體水凝膠進行外觀拍照。

1.3.3.4 脂質(zhì)體水凝膠的質(zhì)構(gòu)分析

將不同配方的脂質(zhì)體水凝膠低溫（4 ℃）保存過夜后進行硬度、黏性及回復力等質(zhì)構(gòu)特性測定，選擇質(zhì)地剖面分析（texture profile analysis，TPA）模式，具體參數(shù)為：探頭P/25，壓縮比30%，測前、測中和測后速率均1 mm/s，測定停留時間5 s，觸發(fā)力5 g，每組樣品做多次平行實驗[21-22]。脂質(zhì)體水凝膠的TPA2采用硬度、彈性和咀嚼性表征，其中，硬度指的是第1次壓縮樣品時的最大壓力峰值，感官上代表了用牙齒咬斷樣品時所需的力；彈性指兩次穿刺樣品高度的比值，反映了除去外力后樣品形變的恢復量；回復力指兩次穿刺后抵抗外界破壞所需的能力。

1.3.4 脂質(zhì)體水凝膠結(jié)構(gòu)的形成機理

1.3.4.1 脂質(zhì)體水凝膠的膨脹系數(shù)

采用Cui Li等[13]的方法。將脂質(zhì)體水凝膠平均切成15 mm×15 mm×10 mm長寬高的比例，切好的小塊凝膠靜置在Hepes溶液中（0.05 mol/L、pH 5.5、37 ℃），在不同時間間隔取出凝膠樣品，用干燥濾紙吸干外表面的水珠，稱質(zhì)量。膨脹系數(shù)計算如式（1）所示：

式中：Wt為在t時間點的吸水膨脹的樣品質(zhì)量；Wo為初始樣品的質(zhì)量。

1.3.4.2 脂質(zhì)體水凝膠FTIR分析

稱取經(jīng)過凍干處理后的脂質(zhì)體、空白水凝膠（不加脂質(zhì)體）和脂質(zhì)體水凝膠樣品，與干燥處理過的KBr粉末按照1∶100的比例在研缽中充分研磨壓片，以空氣為背景采集FTIR譜圖，設(shè)置掃描次數(shù)為64 次，在4 000～400 cm-1波數(shù)范圍內(nèi)全波段掃描分析。

1.3.4.3 脂質(zhì)體水凝膠的差熱分析

每個鋁盤里封裝2～6 mg的經(jīng)過凍干處理后的脂質(zhì)體、空白水凝膠和脂質(zhì)體水凝膠樣品，使用DTA-800差熱分析儀進行分析，裝有脂質(zhì)體的鋁盤作為空白對照組。所有的鋁盤都需要放在密室中，在30 ℃保持5 min，以10 ℃/min的速率從30～400 ℃快速升溫，氮吹的速率為20 mL/min。

1.3.4.4 脂質(zhì)體水凝膠的交聯(lián)率

采用Cui Li等[13]的方法進行測量。所需溶液配制如下：溶液I：將1.05 g的檸檬酸溶解在10 mL（0.1 mol/L）的NaOH溶液中，再混合0.04 g的SnCl2·H2O，用去離子水稀釋到25 mL；溶液II：1 g的尼京平溶解在25 mL乙二醇溶液；標溶液III：將溶液I與溶液II進行混合，磁力攪拌45 min并存于暗室。凝膠前處理需冷凍干燥24 h。測量前，1.5 mg的凍干樣品混合2 mL的溶液III在100 ℃水浴加熱20 min，快速冷卻至室溫，用15 mL的50%異丙醇溶液稀釋，分光光度計在570 nm波長處記錄其吸光度。凝膠交聯(lián)率的計算如式（2）所示：

式中：Mo為未交聯(lián)樣品中自由氨基酸的摩爾分數(shù)；Mt為交聯(lián)樣品中自由氨基酸的摩爾分數(shù)。

1.4 統(tǒng)計分析

每項指標均至少重復測量3 個平行樣品，并設(shè)置相應(yīng)的對照組。采用Microsoft Office Excel 2007和Origin 8.5軟件進行數(shù)據(jù)整理和分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 脂質(zhì)體的物化性質(zhì)

圖1 脂質(zhì)體在電子顯微鏡下的微觀“囊泡狀”結(jié)構(gòu)Fig. 1 Transmission electron micrographs of liposomes

由圖1可知，脂質(zhì)體形狀規(guī)整，呈囊泡狀結(jié)構(gòu)，分布較均勻，顆粒間彼此分散、獨立。通過動態(tài)激光粒徑電位儀測得脂質(zhì)體平均粒徑為（1 353±141.0）nm，表面電位為（-0.72±0.49）mV。由于本實驗采用涂板薄膜分散制備脂質(zhì)體，屬于自發(fā)膨脹的自組裝而成，未進行二次高壓力或者高剪切處理，其形狀結(jié)構(gòu)完整、粒徑較大；且該脂質(zhì)體帶電荷少，電位偏中性。粒度儀測量所得粒徑值與透射電子顯微鏡觀察結(jié)果基本相符。

2.2 脂質(zhì)體水凝膠物化性質(zhì)

2.2.1 脂質(zhì)體水凝膠的外觀形貌

圖2 脂質(zhì)體水凝膠的形態(tài)圖Fig. 2 Visual appearance of lips-in-gels

判斷凝膠的形成采取最直觀的倒置分析法，如圖2所示。對于能穩(wěn)定成膠的樣品，其物理結(jié)構(gòu)會形成穩(wěn)定的固體或半固體形態(tài)，能夠保持基本的“站立”狀態(tài)，所以在進行倒置時，膠體不容易坍塌或流動。圖2A中，明膠與殼聚糖比例為4∶1和2∶1形成的膠，倒置狀態(tài)下均保持非常穩(wěn)定的固體狀態(tài)，Cui Li等[13]認為二者可能是通過共價鍵結(jié)合在一起。在1∶1和1∶2的比例中，其膠的結(jié)構(gòu)發(fā)生了坍塌，有一定的流動性，而1∶4比例則明顯不具備膠的半固體狀態(tài)，基本不能成膠，圖2B、C分別為不同質(zhì)量濃度的mTG制備的水凝膠（明膠與殼聚糖的比例為4∶1）和加入了脂質(zhì)體的水凝膠與空白水凝膠的對比，其中mTG是一種良好的交聯(lián)劑。圖2B中5 種水凝膠均可以保持穩(wěn)定的“站立”狀態(tài)，均呈現(xiàn)膠的基本結(jié)構(gòu)，圖2C水凝膠中添加了脂質(zhì)體之后同樣也很好地保持了膠的固體形狀。

2.2.2 脂質(zhì)體水凝膠的質(zhì)構(gòu)分析

圖3 水凝膠的硬度、黏性和回復力質(zhì)構(gòu)指標Fig. 3 Hardness, adhesiveness and resilience of hydrogels

由圖3A得出，隨著明膠比例增高，水凝膠的硬度也逐漸增大；在殼聚糖比例大于明膠時，無法成膠，故不計算其質(zhì)構(gòu)系數(shù)。當明膠與殼聚糖比例為4∶1時，脂質(zhì)體水凝膠的耐咀嚼性為最優(yōu)?；貜土υ谡麄€體系中呈現(xiàn)拋物線形態(tài)，在明膠與殼聚糖比為2∶1時出現(xiàn)峰值。綜合各質(zhì)構(gòu)結(jié)果，采取明膠與殼聚糖比4∶1為后期實驗的制膠比例。從圖3B可以看出，當mTG質(zhì)量濃度為10 mg/mL時，其成膠穩(wěn)定性最好，硬度重復性最強，硬度達到了18.68 g；當mTG質(zhì)量濃度高于10 mg/mL時，4 ℃過夜貯存出現(xiàn)大量脫水的現(xiàn)象，因此本研究選擇mTG質(zhì)量濃度為10 mg/mL。圖3C為脂質(zhì)體水凝膠與空白水凝膠的質(zhì)構(gòu)對比，脂質(zhì)體水凝膠的硬度和黏彈性相較未添加脂質(zhì)體的水凝膠有很大的提升，可能是因為凝膠內(nèi)部充斥著大粒徑的脂質(zhì)體囊泡，使其膠的空間結(jié)構(gòu)得到支撐，從而提高了膠的硬度[23]。

2.3 凝膠結(jié)構(gòu)的形成機理

2.3.1 脂質(zhì)體水凝膠的膨脹系數(shù)

圖4 空白水凝膠和脂質(zhì)體水凝膠在KCl溶液（pH 5.5、0.01 mol/L）中的膨脹系數(shù)Fig. 4 Swelling behaviors of hydrogels and lips-in-gels in KCl solution(pH 5.5, 0.01 mol/L)

由圖4可知，脂質(zhì)體水凝膠和空白水凝膠的膨脹系數(shù)都是呈上升趨勢，與之前文獻報道水凝膠浸沒于相同pH值條件下的離子溶液中都是出現(xiàn)了吸脹的屬性相符[24]。在0～3 h之間，兩者都是極快吸水膨脹，3 h后兩者都出現(xiàn)輕微的脫水；但在7～24 h之間，空白水凝膠和脂質(zhì)體水凝膠又呈現(xiàn)穩(wěn)定的膨脹過程，但是此吸水能力相較之前的快速吸水發(fā)漲能力略有下降，說明兩種膠之間的網(wǎng)狀空洞結(jié)構(gòu)基本都被水分子填滿，特別是脂質(zhì)體水凝膠在18 h之后，質(zhì)量基本保持平穩(wěn)不變。但是，空白水凝膠的膨脹能力比脂質(zhì)體水凝膠更強，可能是在這段時間里空白水凝膠仍具備一定能力的吸水膨脹，而脂質(zhì)體水凝膠中的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)已經(jīng)被脂質(zhì)體的囊泡結(jié)構(gòu)所填滿，其空間結(jié)構(gòu)已經(jīng)基本接近飽和，無法攜帶更多的水分子。

2.3.2 脂質(zhì)體水凝膠FTIR分析

圖5 脂質(zhì)體、空白水凝膠和脂質(zhì)體水凝膠的FTIR圖Fig. 5 FTIR spectra of liposomes, hydrogels and lips-in-gels

由圖5可知，殼聚糖與明膠構(gòu)成的空白水凝膠的FTIR圖譜在3 276 cm-1處形成了明顯的—O—H伸縮振動吸收寬鋒，在1 682 cm-1處出現(xiàn)了殼聚糖酰胺N—H伸縮振動吸收峰，這兩個特征峰都同時在脂質(zhì)體水凝膠中出現(xiàn)相同的峰位置，說明相應(yīng)的功能基團都在脂質(zhì)體水凝膠中出現(xiàn)。脂質(zhì)體水凝膠中在2 849 cm-1出現(xiàn)了較大吸收峰，但空白水凝膠在此未明顯觀察到吸收峰，主要因為脂質(zhì)體壁材中的磷脂CH2基團的對稱和非對稱吸收峰的介入。磷脂結(jié)構(gòu)中的C—C—N＋、C＝O、P＝O和P—O—C的伸縮振動吸收峰分別是960、1 740、1 220、1 090 cm-1，相比于脂質(zhì)體，脂質(zhì)體水凝膠中C＝O吸收峰缺失，可能是由于水凝膠中mTG的氨與其交聯(lián)形成胺基所致[25-26]。在這之后脂質(zhì)體的相關(guān)特征吸收峰在水凝膠上形成峰位移，可能是由于明膠和殼聚糖中的雜環(huán)與磷酯通過氧激進誘導聚合和脫氫形成了雜環(huán)交聯(lián)化合物[27]。在整個由溶液狀的脂質(zhì)體與水凝膠混合冷卻形成的固態(tài)脂質(zhì)體水凝膠過程中，是形成了一系列復雜的化學交聯(lián)反應(yīng)，脂質(zhì)體還可能通過氫鍵的關(guān)系與之聯(lián)結(jié)[27]。

2.3.3 脂質(zhì)體水凝膠的差熱分析

圖6 脂質(zhì)體、空白水凝膠和脂質(zhì)體水凝膠的差熱分析Fig. 6 DSC spectra of liposomes, hydrogels and lips-in-gels

從圖6可知，脂質(zhì)體、空白水凝膠和脂質(zhì)體水凝膠在高溫下均為吸熱反應(yīng)，且最大的吸熱峰均在不同位置，分別對應(yīng)的是133.126、117.726 ℃和126.891 ℃。脂質(zhì)體本身由磷脂組成，水凝膠的形成為蛋白和多糖通過mTG交聯(lián)，若為物理交聯(lián)的膠，其本身沒有重新產(chǎn)生化學鍵而是通過靜電吸附形成；而脂質(zhì)體水凝膠應(yīng)出現(xiàn)兩個吸熱峰，各自對應(yīng)磷脂和蛋白多糖交聯(lián)的部分；但從圖6可以看到，脂質(zhì)體水凝膠只出現(xiàn)1 個大吸熱峰，說明兩者已經(jīng)產(chǎn)生了一定程度的化學交聯(lián)，推測可能是mTG中的氨與C＝O形成了胺基，雜環(huán)與磷酯鍵通過復雜的交叉反應(yīng)誘導聚合，以及出現(xiàn)了氫鍵的原因[28]。脂質(zhì)體水凝膠在250 ℃后出現(xiàn)了2 個小峰，而脂質(zhì)體差熱曲線也均含有這2 個峰，但空白水凝膠卻沒有此現(xiàn)象，這也從另一個角度證實了水凝膠確實包埋了脂質(zhì)體。

2.3.4 脂質(zhì)體水凝膠的交聯(lián)率

圖7 空白水凝膠和脂質(zhì)體水凝膠的交聯(lián)率Fig. 7 Cross-linking degrees of hydrogels and lips-in-gels

交聯(lián)率根據(jù)其中存在的自由氨基酸的比值進行計算[13]。空白水凝膠和脂質(zhì)體水凝膠有蛋白和多糖的結(jié)構(gòu)，而脂質(zhì)體由磷脂組成。由圖7可以分析，空白水凝膠和脂質(zhì)體水凝膠均檢測出自由氨基酸含量，且脂質(zhì)體水凝膠的交聯(lián)率比空白水凝膠低。本研究使用的水凝膠由殼聚糖和明膠通過mTG交聯(lián)形成，一部分的羰基和氨基形成胺基，雜環(huán)上的不穩(wěn)定二價鍵通過共價破壞與磷酯形成交叉反應(yīng)，所以整個水凝膠的自由氨基酸比例有所降低，交聯(lián)率也隨之降低，該結(jié)果與前面實驗所得對應(yīng)。

3 結(jié) 論

本實驗通過研究不同條件形成的水凝膠的物化性質(zhì)及包埋了脂質(zhì)體的水凝膠性質(zhì)，選擇最優(yōu)配方的同時，闡析了脂質(zhì)體與水凝膠的相互交聯(lián)機制。實驗最終選取明膠與殼聚糖比4∶1、mTG質(zhì)量濃度10 mg/mL為最優(yōu)條件，此配方下質(zhì)構(gòu)表現(xiàn)最優(yōu)。相較空白水凝膠，脂質(zhì)體水凝膠的膨脹系數(shù)更小，是由于脂質(zhì)體水凝膠中的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)已經(jīng)被脂質(zhì)體的囊泡結(jié)構(gòu)所填滿，其空間結(jié)構(gòu)已經(jīng)基本接近飽和；同時，F(xiàn)TIR和差熱分析顯示脂質(zhì)體中的C＝O、P＝O鍵與空白水凝膠中的氨和雜環(huán)形成胺基和其他復雜結(jié)構(gòu)，而交聯(lián)率也同時證明了脂質(zhì)體與水凝膠之間的交聯(lián)是通過化學交聯(lián)的方式，破壞了一系列的官能團產(chǎn)生了復雜的共價鍵和氫鍵。本研究為脂質(zhì)體水凝膠應(yīng)用于食品消化和營養(yǎng)因子的緩釋作用提供了理論參考，也可為開發(fā)脂質(zhì)體水凝膠的營養(yǎng)食品提供技術(shù)參考。