王 晨，謝巖黎*，范亭亭

（河南工業(yè)大學(xué)糧油食品學(xué)院，河南省糧油食品安全檢測與控制重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，河南 鄭州 450001）

面筋蛋白是小麥粉中的主要儲存蛋白，主要由醇溶蛋白（gliadin，Gli）及麥谷蛋白（glutenin，Glu）組成[1]。Gli屬于單體蛋白，有4 種類型，分為α、β、γ、ω四種類型，Gli決定面團(tuán)的黏性[2]。Glu是多肽鏈通過分子間二硫鍵相互連接成的大分子聚合物，主要由2 種亞基組成，分別為低分子質(zhì)量亞基和高分子質(zhì)量亞基，其分子內(nèi)含有較多的β-折疊結(jié)構(gòu)，易發(fā)生聚集作用，主要為面團(tuán)提供彈性[3-4]。

花青素是植物多酚類化合物的其中一種，它廣泛存在于谷物、水果和蔬菜中，并且可以產(chǎn)生鮮艷的色彩[5]。由于它能夠預(yù)防心血管疾病、癌癥并具有抗炎、抗菌及抗氧化的能力，近年來膳食花青素受到越來越多的關(guān)注[5-7]。以富含花青素的谷物如黑豆粉為配料，添加到小麥粉中加工成主食品。在食加工中，多酚類會與小麥粉中的蛋白質(zhì)發(fā)生共價(jià)或共價(jià)交聯(lián)，從而影響到面團(tuán)的流變性及面制品的品質(zhì)[8-10]。Hager等[11]發(fā)現(xiàn)沒食子酸交聯(lián)蛋白質(zhì)可以改善面筋蛋白的彈性；Liu Rui等[9]向小麥粉中添加低聚原花青素可以改善面團(tuán)的黏彈性及面筋蛋白的穩(wěn)定性。這些植物多酚可以通過二硫鍵、氫鍵和疏水相互作用和面筋蛋白發(fā)生相互作用[6]。天然植物多酚對人體也有很多益處，包括抗氧化、抗菌和抗動脈硬化作用[9]，它還能降低過敏性。例如，Pérot等[7]發(fā)現(xiàn)蔓越莓多酚能夠有效降低小Gli的免疫原性和致敏性。因此，植物多酚作為天然、安全、有效的小麥粉添加劑，能夠有效地提高面制品的營養(yǎng)價(jià)值及增筋作用。但是多酚對于面筋蛋白的作用機(jī)制并不清楚，了解多酚與面筋蛋白（Gli和Glu）的相互作用方式及本質(zhì)是必要的。本實(shí)驗(yàn)利用多光譜學(xué)研究了花青素與面筋蛋白（Gli和Glu）的相互作用。

本實(shí)驗(yàn)利用熒光光譜和傅里葉變換紅外光譜研究花青素與Gli、Glu相互作用之間的表觀結(jié)合常數(shù)、結(jié)合位點(diǎn)數(shù)、作用力及對兩種蛋白結(jié)構(gòu)的變化，為花青素對主食品品質(zhì)的影響及花青素作為一種天然食品添加劑在主食品產(chǎn)業(yè)發(fā)展提供可靠的理論基礎(chǔ)和科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

矢車菊素-3-O-葡糖苷（cyanidin-3-O-glucoside，C3G），純度98%，由實(shí)驗(yàn)室自制[12]；Gli（純度95%）上海梯希愛化成工業(yè)發(fā)展有限公司；Glu（純度＞85%）上海源葉生物科技有限公司；實(shí)驗(yàn)中所用試劑均為分析純；所用水為去離子水。

1.2 儀器與設(shè)備

UV-6100S型分光光度計(jì) 上海美譜達(dá)儀器有限公司；F-7100FL熒光分光光度計(jì) 日本Shimadzu公司；ALPHA傅里葉變換紅外光譜儀 德國布魯克分析儀器（上海）公司；LGJ-10C冷凍干燥機(jī) 北京四環(huán)科學(xué)儀器廠有限公司；DL-5-B離心機(jī) 上海安亭科學(xué)儀器廠。

1.3 方法

1.3.1 溶液配制

C3G溶液：用pH 7.0的磷酸緩沖液配制50 mg/L的C3G溶液，實(shí)驗(yàn)時(shí)稀釋到所需質(zhì)量濃度；Gli溶液：稱取一定質(zhì)量的Gli，用75%乙醇溶液溶解，溶液稀釋至100 mg/L。Glu溶液：稱取一定質(zhì)量的Glu，用pH 7.0的磷酸鹽緩沖液（10 mmol/L）溶解，離心（因?yàn)镚lu只溶于稀酸或稀堿），取上清液稀釋至需質(zhì)量濃度，備用。

1.3.2 熒光光譜分析

向一定濃度的Gli及Glu溶液添加不同量的C3G溶液，使最終蛋白質(zhì)質(zhì)量濃度為50 mg/L，C3質(zhì)量濃度分別為0、4.49、8.99、13.48、17.97、22.47、26.96 mg/L，于25、35、45 ℃的恒溫水浴鍋中水浴1 h后測定。熒光光譜測定條件：激發(fā)波長280 nm，發(fā)射波長300～450 nm，激發(fā)波長和發(fā)射波長狹縫寬度均為5 nm，同步熒光光譜測定條件如下：25 ℃，分別設(shè)定激發(fā)波長與發(fā)射波長之間的固定波長差Δλ為15 nm及60 nm，進(jìn)行同步熒光光譜掃描。

1.3.3 傅里葉變換紅外光譜分析

將Gli-C3G、Glu-C3G的混合液（Gli質(zhì)量濃度為50 mg/L、Glu質(zhì)量濃度50 mg/L、C3G質(zhì)量濃度分別為0、13.48、26.96 mg/L）冷凍干燥，按樣品粉末與溴化鉀粉末質(zhì)量比1∶50混合，置于模具中壓片，分辨率為32 cm-1掃描16 次，在4 000～4 00 cm-1波數(shù)范圍內(nèi)掃描紅外光譜。

利用Peak Fit4.12軟件對圖譜中1 700～1 600 cm-1酰胺I帶區(qū)域進(jìn)行分析，通過校正基線、去卷積、二階導(dǎo)數(shù)求導(dǎo)，將不同的譜帶完全分辨開，參照文獻(xiàn)[13]確定各子峰與不同二級結(jié)構(gòu)的對應(yīng)關(guān)系后（表1），根據(jù)各子峰面積計(jì)算各部分二級結(jié)構(gòu)的相對含量。

表1 蛋白質(zhì)紅外光譜吸收波數(shù)與二級結(jié)構(gòu)的關(guān)系[13]Table 1 Relationship between infrared absorption characteristics and protein secondary structure

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

每組數(shù)據(jù)均做3 次平行，利用Origin 8.5軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理與作圖。利用SPSS 16.0軟件進(jìn)行ANOVA差異顯著性分析及相關(guān)性分析，P＜0.05，差異顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 熒光光譜分析

2.1.1 C3G對Gli、Glu內(nèi)源性熒光光譜的影響

熒光光譜法是研究小分子與蛋白質(zhì)相互作用較為普遍的方法。由于熒光基團(tuán)與猝滅劑分子的相互作用使得量子產(chǎn)率減小，從而產(chǎn)生熒光猝滅現(xiàn)象[14]。一般發(fā)熒光的蛋白質(zhì)分子含有色氨酸、酪氨酸和苯丙氨酸，它們最大熒光強(qiáng)度的波長分別為348、303 nm和282 nm[15]。由于酪氨酸極易被猝滅，苯丙氨酸量子產(chǎn)率過小，研究小分子物質(zhì)與蛋白質(zhì)相互作用常用色氨酸的熒光信息。以280 nm為激發(fā)波長，蛋白質(zhì)的全部熒光主要來源于色氨酸，其次還有酪氨酸。而以295 nm為激發(fā)波長，蛋白質(zhì)的熒光全部來源于色氨酸，但是其熒光強(qiáng)度過低[16]。本實(shí)驗(yàn)以280 nm為激發(fā)波長研究C3G與Gli、Glu的相互作用。

圖1 C3G對Gli（A）、Glu（B）熒光光譜的影響Fig. 1 Fluorescence emission spectra of C3G-Gli (A) and C3G-Glu (B)systems at pH 7.0 and 25 ℃

由圖1可知，C3G對兩種蛋白的熒光都有猝滅作用，且猝滅效果隨C3G質(zhì)量濃度的增大而增強(qiáng)。在激發(fā)波長280 nm，Gli、Glu的最大發(fā)射波長（λmax）分別為342.2 nm（圖1A）和342.6 nm（圖1B），加入C3G后，Gli、Glu的λmax都發(fā)生了紅移現(xiàn)象，這說明C3G與兩種蛋白都發(fā)生了相互作用，導(dǎo)致Gli、Glu的色氨酸周圍微環(huán)境由疏水性環(huán)境向親水性環(huán)境發(fā)生轉(zhuǎn)變，C3G是水溶性物質(zhì)，可與蛋白質(zhì)的親水性側(cè)鏈殘基發(fā)生相互作用從而使得蛋白質(zhì)的肽鏈變得更加伸展，從而使得蛋白質(zhì)的構(gòu)象發(fā)生變化[17-18]。而Gli紅移1.6 nm，Glu紅移1 nm，這說明C3G與Gli作用更強(qiáng)。

2.1.2 熒光猝滅機(jī)理的判定

小分子結(jié)合蛋白的熒光猝滅機(jī)制熒光猝滅分為靜態(tài)猝滅與動態(tài)猝滅，靜態(tài)猝滅由于猝滅劑與熒光基團(tuán)形成復(fù)合物，其猝滅常數(shù)隨著溫度的上升呈下降的趨勢。動態(tài)猝滅表現(xiàn)為溫度的升高增加離子的擴(kuò)散和碰撞，其猝滅常數(shù)隨著溫度的上升而增大。利用Stern-Volmer方程對猝滅類型進(jìn)行判斷[2]：

式中：F0、F分別為不添加C3G與添加C3G后黑豆分離蛋白的熒光強(qiáng)度；[Q]為C3G濃度/（mol/L）；KSV為動態(tài)猝滅常數(shù)/（L/mol）；Kq為生物大分子猝滅速率常數(shù)/（L/（mol·s））；τ0為不存在猝滅劑時(shí)熒光分子的壽命，平均壽命約為10-8s。

圖2 不同溫度條件下C3G猝滅Gli（A）、Glu（B）的Stern-Volmer圖Fig. 2 Stern-Volmer plot of F0/F as a function of C3G concentration at different temperatures for C3G-Gli (A) and C3G-Glu (B) systems

表2 C3G-Gli、C3G-Glu復(fù)合物的熒光猝滅常數(shù)及線性相關(guān)系數(shù)Table 2 Stern-Volmer quenching constants (KSV) and molecular quenching constants (Kq) for C3G-Gli and C3G-Glu systems at different temperatures

根據(jù)Stern-Volmer方程（1），以F0/F為縱坐標(biāo)，對[Q]進(jìn)行線性擬合，經(jīng)Origin 8.5繪制得圖2，進(jìn)而得出C3G 與Gli、Glu相互作用的動態(tài)猝滅常數(shù)（KSV）和生物大分子猝滅速率常數(shù)（Kq）。由表2可知，隨著溫度的升高，Glu的KSV不斷減小，這說明C3G對Glu的熒光猝滅機(jī)制屬于靜態(tài)猝滅。對于生物大分子，各類猝滅劑由擴(kuò)散碰撞產(chǎn)生的最大動態(tài)猝滅常數(shù)為2×1010L/（mol·s）[16-17]，又因?yàn)镃3G與Glu相互作用的Kq值遠(yuǎn)大于2×1010L/（mol·s），進(jìn)一步表明C3G對Glu的猝滅機(jī)理是C3G與蛋白結(jié)合形成基態(tài)穩(wěn)定復(fù)合物所引起的靜態(tài)猝滅。溫度由298 K升到308 K時(shí)，C3G與Gli相互作用的猝滅常數(shù)呈現(xiàn)增大的趨勢，由308 K升到318 K時(shí)，KSV值變化不大，而C3G對Gli的猝滅速率常數(shù)Kq遠(yuǎn)大于最大猝滅常數(shù)，可以得出C3G與Gli的相互作用方式是動態(tài)猝滅和靜態(tài)猝滅同時(shí)發(fā)生。Joye等[19]研究發(fā)現(xiàn)溫度由35 ℃上升至40 ℃時(shí)，白藜蘆醇和Gli相互作用的KSV值也呈現(xiàn)增大的趨勢，之后保持不變，這與本實(shí)驗(yàn)中C3G與Gli相互作用的結(jié)果一致。

2.1.3 結(jié)合常數(shù)和結(jié)合位點(diǎn)的計(jì)算

根據(jù)文獻(xiàn)，測定熒光分子和猝滅劑相互作用的結(jié)合常數(shù)和結(jié)合位點(diǎn)數(shù)，采用以下公式計(jì)算：

式中：F0和F分別為不添加C3G與添加C3G后黑豆分離蛋白的熒光強(qiáng)度；[Q]為C3G濃度/（mol/L）；KA為結(jié)合常數(shù)；n為結(jié)合位點(diǎn)。

圖3 不同溫度條件下 C3G-Gli（A）和C3G-Glu（B）復(fù)合物的雙對數(shù)圖Fig. 3 Plot of lg[(F0-F)/F] as a function of log of C3G concentration at different temperatures for C3G-Gli (A) and C3G-Glu (B) systems

根據(jù)公式（2），以lg[（F0-F）/F]對lg[Q]作圖（圖3），計(jì)算出不同溫度條件下C3G與Gli、Glu相互作用的表觀結(jié)合常數(shù)（KA）和結(jié)合位點(diǎn)數(shù)（n）（表3），以上數(shù)據(jù)表明：溫度升高，C3G與Gli的結(jié)合常數(shù)KA值升高，說明升高溫度增大了C3G-Gli復(fù)合物的穩(wěn)定性，且兩者的反應(yīng)是吸熱過程[20]。而Glu有著相反的趨勢，說明C3G與Glu的反應(yīng)是一個(gè)放熱過程。不同溫度條件下，C3G與Gli相互作用的KA和n分別為20.827×104L/mol、1.263（298 K），22.463×104L/mol、1.253（308 K），58.060×104L/mol、1.355（318 K）。相比于Glu，C3G與Gli相互作用的KA和n都較大，說明C3G與Gli的結(jié)合能力較強(qiáng)。這兩種蛋白的結(jié)合位點(diǎn)數(shù)n都接近 1，由此可知C3G與兩種蛋白之間都形成了物質(zhì)的量比約1∶1的靜態(tài)復(fù)合物[21]。

表3 C3G-Gli和C3G-Glu復(fù)合物的結(jié)合位點(diǎn)數(shù)、表觀結(jié)合常數(shù)及線性相關(guān)系數(shù)Table 3 Apparent binding constants, number of binding sites and linear correlation coef fi cients of C3G-Gli and C3G-Glu systems

2.1.4 熱力學(xué)參數(shù)與相互作用力類型

根據(jù)Van’t Hoff方程用計(jì)算熱力學(xué)參數(shù)[22-23]：

式中：ΔH、ΔG和ΔS分別表示焓變/（kJ/mol）、吉布斯自由能變化/（kJ/mol）、熵變/（J/K）；R為氣體常數(shù)8.314 J/（mol·K）；T為實(shí)驗(yàn)溫度；KA為相應(yīng)的溫度下的結(jié)合常數(shù)；結(jié)合反應(yīng)的焓變在溫度相差不大時(shí)，可視為常數(shù)[23]。

小分子和蛋白結(jié)合的相互作用力主要有4 種：1）ΔH＞0、ΔS＞0時(shí)，疏水相互作用；2）ΔH＞0、ΔS＜0時(shí)，靜電和疏水相互作用；3）ΔH＜0、ΔS＜0 時(shí)，范德華力和氫鍵相互作用；4）ΔH＜0、ΔS＞0時(shí)，靜電相互作用[22]。從表4可以看出，對Gli而言，ΔH＞0、ΔS＞0，說明C3G與Gli之間的作用力主要為疏水作用，ΔH＞0，表明兩者之間的相互作用為吸熱反應(yīng)，升溫應(yīng)有利于兩者結(jié)合；而對Glu而言，ΔH＜0、ΔS＜0，說明C3G與Glu的主要作用力為范德華力和氫鍵，ΔH＜0，表明C3G和Glu之間的反應(yīng)是放熱的，降溫應(yīng)有利于兩者結(jié)合。另外，兩種蛋白的ΔG都小于0，說明C3G與這兩種蛋白的結(jié)合都是自發(fā)的。

表4 C3G與Gli、Glu結(jié)合的相關(guān)熱力學(xué)參數(shù)Table 4 Thermodynamic parameters of C3G-Gli and C3G-Glu systems

2.1.5 同步熒光光譜

圖4 C3G-Gli和C3G-Glu體系的同步熒光光譜Fig. 4 Synchronous fluorescence spectra of C3G- Gli and C3G-Glu systems

同步熒光分析被應(yīng)用于研究蛋白質(zhì)的構(gòu)象，特別是熒光基團(tuán)微環(huán)境的變化，具有選擇性高、譜圖簡化、光散射干擾少等特點(diǎn)[24]。通過設(shè)定Δλ，獲得熒光光譜。當(dāng)Δλ為15 nm時(shí)，只顯示酪氨酸殘基的特征熒光光譜；當(dāng)Δλ為60 nm時(shí)，只顯示色氨酸殘基的特征熒光光譜[25]。所以，可判斷蛋白質(zhì)酪氨酸殘基和色氨酸殘基在C3G作用下附近微環(huán)境的極性變化。

從圖4可以看出，隨著C3G質(zhì)量濃度的增大，Gli、Glu的酪氨酸和色氨酸殘基熒光強(qiáng)度均有猝滅現(xiàn)象且最大吸收波長均有不同程度的紅移現(xiàn)象。這說明C3G與兩種蛋白都發(fā)生了相互作用，并使得蛋白質(zhì)構(gòu)象發(fā)生一定的改變，進(jìn)而使得兩種蛋白中色氨酸和酪氨酸附近的微環(huán)境向親水性環(huán)境轉(zhuǎn)變，疏水性減小[26-27]。Gli中酪氨酸殘基（圖4A1）和色氨酸殘基（圖4A2）分別紅移0.2 nm和0.4 nm；而Glu酪氨酸殘基（圖4B1）和色氨酸殘基（圖4B2）分別紅移1.2 nm和0.8 nm，這說明C3G與Gli的結(jié)合位點(diǎn)更接近色氨酸殘基，而與Glu的結(jié)合位點(diǎn)更接近酪氨酸殘基[28]。

2.2 傅里葉變換紅外光譜

圖5 C3G與Gli、Glu復(fù)合的Peakfit擬合圖譜Fig. 5 Secondary derivative resolution enhancement and curve fi tted amide I band

蛋白質(zhì)酰胺I帶吸收峰的變化反映了蛋白二級結(jié)構(gòu)的變化（1 700～1 600 cm-1）[13]，由圖5可知，加入不同濃度的C3G后，兩種蛋白的紅外擬合峰數(shù)目及峰形發(fā)生明顯變化，蛋白的二級結(jié)構(gòu)所占百分比也發(fā)生改變，表明加入C3G后，兩種蛋白的構(gòu)象都發(fā)生了改變。由表5可知，兩種蛋白質(zhì)的二級結(jié)構(gòu)中，β-折疊結(jié)構(gòu)所占比例最高。隨著C3G的加入，Gli中β-折疊和β-轉(zhuǎn)角結(jié)構(gòu)有減少的趨勢，而α-螺旋和無規(guī)卷曲含量有增大趨勢，這與Tozzi等[29]的研究結(jié)果一致，可能是由于C3G和Gli作用后形成了復(fù)合物，導(dǎo)致肽鏈上羰基氫鍵的重排，從而引起Gli結(jié)構(gòu)的變化。Glu中β-折疊含量減少，α-螺旋和β-轉(zhuǎn)角含量增加，而無規(guī)卷曲含量無明顯變化（P＞0.05），這與史春悅[30]的研究結(jié)果一致，可能是由于C3G與Glu之間形成的鍵是由疏水相互作用引起的。相比于C3G對Glu二級結(jié)構(gòu)的影響，可以檢測到C3G存在時(shí)Gli更多的變化，可能是由于C3G與Gli的相互作用更強(qiáng)[31]。這與內(nèi)源性熒光的結(jié)果一致。

表5 C3G對Gli、Glu蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)相對含量的影響（x± s，n=3）Table 5 Effect of C3G concentration on secondary structure of Gli and Glu (x± s, n= 3)%

3 結(jié) 論

本實(shí)驗(yàn)采用熒光光譜、同步熒光光譜和傅里葉變換紅外光譜3 種方法研究C3G與Gli、Glu的相互作用及對蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的影響，主要結(jié)論如下：1）熒光圖譜結(jié)果表明C3G對Gli、Glu都有熒光猝滅作用，與Glu的猝滅機(jī)制屬于靜態(tài)猝滅，主要通過疏水相互作用相結(jié)合；與Gli的猝滅機(jī)制為靜態(tài)猝滅和動態(tài)猝滅的結(jié)合，主要通過范德華力和氫鍵作用結(jié)合。2）Gli、Glu與C3G結(jié)合位點(diǎn)數(shù)n都接近1，形成了物質(zhì)的量比約1∶1的靜態(tài)復(fù)合物；同步熒光光譜表明C3G與Gli的結(jié)合位點(diǎn)更接近色氨酸殘基，而與Glu的結(jié)合位點(diǎn)更接近酪氨酸殘基。3）傅里葉變換紅外光譜數(shù)據(jù)表明C3G的加入改變了小麥蛋白結(jié)構(gòu)，Gli表現(xiàn)為β-折疊和β-轉(zhuǎn)角占總空間結(jié)構(gòu)百分比減少，而α-螺旋和無規(guī)卷曲結(jié)構(gòu)相對含量增加；Glu表現(xiàn)為β-折疊相對含量減少，α-螺旋和β-轉(zhuǎn)角相對含量增加，無規(guī)卷曲相對含量變化不大。