賀秋紅，鞏志金，顏 梅

（曲阜師范大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，山東 曲阜 273100）

脂肪酶（lipase EC3.1.1.3）是一類能催化甘油酯水解的酶的總稱，催化效率高，副產(chǎn)物少，反應(yīng)條件溫和，不需要輔酶或輔因子的參與，已在合成反應(yīng)、生物燃料、制藥工業(yè)以及洗滌劑、食品、紡織等領(lǐng)域得到廣泛應(yīng)用。脂肪酶不僅能催化甘油酯類水解與合成，還能催化酯化反應(yīng)、酯交換反應(yīng)、醇解反應(yīng)，促進(jìn)多肽、表面活性劑和藥物等的合成反應(yīng)[1]。微生物脂肪酶的研究始于20世紀(jì)初，經(jīng)過100多年的研究，目前已經(jīng)成為脂肪酶的主要來源。特別是近幾十年來，隨著高效篩選技術(shù)和先進(jìn)基因工程技術(shù)的應(yīng)用，已經(jīng)實(shí)現(xiàn)了曲霉、毛霉和假單胞菌的相對(duì)高產(chǎn)，并且部分菌株已經(jīng)實(shí)現(xiàn)工業(yè)化應(yīng)用[2]。我國(guó)高質(zhì)量的脂肪酶產(chǎn)生菌種類少，產(chǎn)量低，很多企業(yè)不得不依賴價(jià)格昂貴的進(jìn)口脂肪酶，因此篩選和培育高產(chǎn)優(yōu)勢(shì)脂肪酶產(chǎn)生菌顯得尤為重要[3]。另外，脂肪酶催化的反應(yīng)類型和條件多種多樣，不同類型的脂肪酶應(yīng)用方向千差萬(wàn)別，因此篩選不同來源的脂肪酶是脂肪酶研究的基礎(chǔ)。

微生物脂肪酶的表達(dá)主要受環(huán)境因子的調(diào)節(jié)，產(chǎn)脂肪酶微生物需要以油脂和脂肪酸作為碳源生長(zhǎng)，因此常用的微生物篩選來源包括油脂加工廠、乳制品工廠以及附近被油脂污染的土壤和水域等[2]。芽孢桿菌是一類潛在的優(yōu)良脂肪酶生產(chǎn)菌株，目前用于生產(chǎn)脂肪酶的芽孢桿菌有枯草芽孢桿菌[4]、蠟狀芽孢桿菌[5]、類芽孢桿菌[6]和地衣芽孢桿菌[7]等?？莶菅挎邨U菌所生產(chǎn)的脂肪酶屬于胞外酶，便于下游分離純化，適用于大規(guī)模工業(yè)化生產(chǎn)[8-9]，并且普遍具有較高的堿耐受力[10-11]，在洗滌劑和紡織等領(lǐng)域市場(chǎng)需求巨大。本研究從油脂污染水樣中分離出一株產(chǎn)脂肪酶菌株，對(duì)其進(jìn)行形態(tài)學(xué)特征、生理生化試驗(yàn)及分子生物學(xué)鑒定，并通過單因素試驗(yàn)和響應(yīng)面試驗(yàn)對(duì)其發(fā)酵培養(yǎng)基組分進(jìn)行優(yōu)化，旨在提高脂肪酶產(chǎn)量，進(jìn)一步對(duì)其酶學(xué)性質(zhì)研究提供技術(shù)參考和實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 材料

從曲阜市多個(gè)食堂和食品廠附近被油脂污染的下水道中采集樣品10份。

1.1.2 化學(xué)試劑

葡萄糖、酵母膏、磷酸氫二鈉、硫酸銨、氯化鈉、三水磷酸氫二鉀、七水硫酸鎂、瓊脂粉、蛋白胨、橄欖油、羅丹明B、聚乙烯醇（polyvinyl alcohol，PVA）：國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

1.1.3 培養(yǎng)基[12-14]

富集培養(yǎng)基：酵母膏0.2 g/L，氯化鈉0.5 g/L，磷酸氫二鈉3.5 g/L，磷酸二氫鉀1.5 g/L，七水硫酸鎂0.5 g/L，橄欖油10 mL，用蒸餾水定容至1 000 mL，121 ℃滅菌20 min。

初篩羅丹明B培養(yǎng)基[14]：硫酸銨0.5 g，氯化鈉4 g，磷酸氫二鉀1 g，七水硫酸鎂0.5 g，瓊脂粉15 g，三丁酸甘油脂乳化液100 mL（4%PVA∶三丁酸甘油脂=3∶1，超聲乳化），用蒸餾水定容至1 000 mL，121 ℃滅菌20 min后，待溫度降至60 ℃時(shí)加入1 mL羅丹明B 溶液（質(zhì)量濃度＜10 mg/mL），混勻后倒平板。

初始發(fā)酵培養(yǎng)基：葡萄糖5.0 g/L，蛋白陳2 g/L，尿素6.0 g/L，三水磷酸氫二鉀1.0 g/L，硫酸銨1 g/L，七水硫酸鎂0.5 g/L，三丁酸甘油脂10.0 mL，用蒸餾水定容至1 000 mL，自然pH，115 ℃滅菌15 min。

1.2 儀器與設(shè)備

SW-CJ-1D超凈工作臺(tái)：蘇州凈化設(shè)備有限公司；SIGMA 2-16PK通用型離心機(jī)：德國(guó)Sigma公司；TS-1102立式搖床：上海天呈試驗(yàn)儀器制造有限公司；CL-32L高壓蒸汽滅菌鍋：日本ALP公司；上海申安醫(yī)療器械廠；T100型PCR儀、Mini-SubCell核酸電泳儀：美國(guó)BioRad公司；CX23生物顯微鏡：日本奧林巴斯有限公司。

1.3 方法

1.3.1 菌株的篩選

將采集的樣品分別依次進(jìn)行富集培養(yǎng)、初篩和初始發(fā)酵復(fù)篩。樣品經(jīng)過3次富集培養(yǎng)后，分別取50 μL菌液上清涂布于羅丹明B培養(yǎng)基平板，羅丹明B能與脂肪酶降解油脂產(chǎn)生的脂肪酸特異性結(jié)合，產(chǎn)酶菌落周圍會(huì)生成玫紅色，在波長(zhǎng)365 nm紫外燈下呈現(xiàn)橙黃色。將羅丹明B平板放在波長(zhǎng)365 nm紫外燈下進(jìn)行觀察，選取橙黃色圈較大的菌株進(jìn)行分離培養(yǎng)，鏡檢至無(wú)雜菌后作為出發(fā)菌種，接種于初始發(fā)酵培養(yǎng)基中進(jìn)行復(fù)篩，選出脂肪酶高產(chǎn)菌株[15-17]。

1.3.2 菌種鑒定

根據(jù)《常見細(xì)菌系統(tǒng)鑒定手冊(cè)》[18]，對(duì)所篩選的菌株進(jìn)行形態(tài)學(xué)特征和生理生化鑒定。提取目的菌株的基因組脫氧核糖核酸（deoxyribonucleic acid，DNA）為模板，以16S rDNA序列的通用引物進(jìn)行聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（polymerase chain reaction，PCR）擴(kuò)增。擴(kuò)增產(chǎn)物送至上海博尚生物科技有限公司進(jìn)行測(cè)序，并將得到的序列與GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)中的序列進(jìn)行比對(duì)分析，使用MEGA-X軟件構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹[19]。

1.3.3 產(chǎn)脂肪酶菌株的種子液的制備及發(fā)酵培養(yǎng)

種子液的制備：將1.3.1篩選得到的菌種于無(wú)菌條件下，接種一環(huán)菌至裝液量為50 mL/250 mL的初始發(fā)酵培養(yǎng)基中，35 ℃、220 r/min，搖瓶培養(yǎng)12 h，制備成種子液。將種子液按照10%（V/V）裝液量接種至為25 mL/250 mL的發(fā)酵培養(yǎng)培養(yǎng)基中，發(fā)酵液pH=7，35 ℃、220 r/min條件下?lián)u瓶培養(yǎng)40 h。

1.3.4 發(fā)酵培養(yǎng)基組分優(yōu)化

單因素試驗(yàn)：設(shè)計(jì)單因素試驗(yàn)考察發(fā)酵培養(yǎng)基中三丁酸甘油酯添加量（1.2%、1.4%、1.6%、1.8%、2.0%、2.2%、2.4%）、葡萄糖添加量（4 g/L、5 g/L、6 g/L、7 g/L、8 g/L、9 g/L、10 g/L）及尿素添加量（6 g/L、8 g/L、10 g/L、12 g/L、14 g/L、16 g/L、18 g/L）對(duì)發(fā)酵液中粗脂肪酶活性的影響，確定各因素的中心值及水平。

響應(yīng)面試驗(yàn)：根據(jù)響應(yīng)面分析法中Box-Behnken Design（BBD）試驗(yàn)設(shè)計(jì)原理，采用上述單因素試驗(yàn)確定的中心值、低水平和高水平（分別用0、-1、+1表示），以脂肪酶活力（Y）為響應(yīng)值，對(duì)發(fā)酵培養(yǎng)基中三丁酸甘油酯添加量（A）、葡萄糖添加量（B）、尿素添加量（C）進(jìn)行優(yōu)化，得到最佳發(fā)酵條件組合，試驗(yàn)因素與水平見表1。

表1 發(fā)酵條件優(yōu)化響應(yīng)面試驗(yàn)因素與水平Table 1 Factors and levels of response surfer experiments for fermentation conditions optimization

1.3.5 發(fā)酵液中脂肪酶活力的檢測(cè)

粗酶液的制備：將發(fā)酵液低溫離心去除菌體，4 ℃、5 500 r/min條件下離心15 min，除菌體。上清用0.22 μm濾膜過濾，制成粗酶液于4 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

脂肪酶活力檢測(cè)：參考國(guó)標(biāo)GB/T 23535—2009《脂肪酶制劑》[20]。脂肪酶活力定義：在pH7.5，40 ℃條件下，每分鐘產(chǎn)生1 μmol可滴定脂肪酸所需的酶量為1個(gè)酶活力單位（U/mL）。

2 結(jié)果與分析

2.1 目的菌株的篩選

經(jīng)過初篩和富集培養(yǎng)，從10份樣品中篩選分離得到4株橙黃色圈較大的菌株，分別編號(hào)為U1、U2、U4、U5，再分別進(jìn)行搖瓶發(fā)酵培養(yǎng)，測(cè)定各發(fā)酵液中產(chǎn)脂肪酶的活力值，結(jié)果見表2。由表2可知，菌株U5脂肪酶酶活最高，為3.3 U/mL，其余3株菌脂肪酶酶活較低，均在1.3～2.9 U/mL范圍內(nèi)。因此，選擇菌株U5作進(jìn)一步鑒定。

2.2 菌株U5的鑒定

2.2.1 菌株U5形態(tài)學(xué)特征

菌株U5的菌落及細(xì)胞形態(tài)見圖1。由圖1A可知，在瓊脂平板上，菌落乳白色，邊緣不規(guī)則，不透明，菌落表面粗糙，略有突起。由圖1B可知，菌體呈圓桿狀，無(wú)莢膜，有鞭毛。

圖1 菌株U5的菌落（A）及細(xì)胞（B）形態(tài)Fig.1 Colony morphology (A) and cell morphology (B) of strain U5

2.2.2 生理生化鑒定

菌株U5能利用甘露醇、檸檬酸鹽、葡萄糖，接觸酶試驗(yàn)、硝酸鹽還原、V-P試驗(yàn)、7%氯化鈉生長(zhǎng)均為陽(yáng)性。根據(jù)菌株U5的形態(tài)特征和生理生化特性，可以初步鑒定菌株為芽孢桿菌屬（Bacillussp.）。

2.2.3 分子生物學(xué)鑒定

以菌株U5基因組DNA為模板，采用細(xì)菌16S rDNA通用引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，PCR產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)擴(kuò)增條帶約1 500 bp，測(cè)序結(jié)果見圖2。

圖2 菌株U5 16S rDNA測(cè)序結(jié)果Fig.2 Sequencing results of 16S rDNA of strain U5

由圖2可知，擴(kuò)增片段長(zhǎng)1 406 bp，符合細(xì)菌16S rDNA序列特征。將擴(kuò)增序列結(jié)果同美國(guó)國(guó)家生物技術(shù)信息中心（national center of biotechnology information，NCBI）中的Genbank核酸數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行基本局部比對(duì)搜索工具（basic local alignment search tool，BLAST）同源性比對(duì)分析，用MEGA-X構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，結(jié)果見圖3。

圖3 菌株U5 16S rDNA序列系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.3 Phylogenetic tree of strain U5 based on 16S rDNA sequence

由圖3可知，菌株U5與Bacillus subtilisstrain IAM10（MH815091.1）位于同一族群，親緣關(guān)系最近，再結(jié)合形態(tài)學(xué)觀察和生理生化試驗(yàn)結(jié)果，進(jìn)一步證實(shí)菌株U5為枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）。

2.3 發(fā)酵培養(yǎng)基組分的優(yōu)化

2.3.1 單因素試驗(yàn)結(jié)果

分別對(duì)發(fā)酵組分中三丁酸甘油酯（1.2%～2.4%）、葡萄糖（4～10 g/L）、尿素（6～18 g/L）的添加量進(jìn)行單因素試驗(yàn)設(shè)計(jì)，結(jié)果如圖4所示。

由圖4a可知，隨著三丁酸甘油酯添加量的增加，脂肪酶活力呈現(xiàn)先升后降的趨勢(shì)，當(dāng)三丁酸甘油酯添加量為1.8%時(shí)，脂肪酶活力最高，達(dá)到4.0 U/mL，故將1.8%作為響應(yīng)面設(shè)計(jì)中三丁酸甘油酯含量的中心點(diǎn)，中心點(diǎn)左、右兩側(cè)等距離的因變量1.6%和2.0%作為低水平和高水平。

由圖4b可知，隨著葡萄糖添加量的增加，脂肪酶活力整體呈現(xiàn)先上升后略微下降的趨勢(shì)，當(dāng)葡萄糖添加量為8 g/L時(shí)，脂肪酶活力達(dá)到最高；葡萄糖添加量＞8 g/L后略有下降，故葡萄糖含量的中心點(diǎn)設(shè)為8 g/L，低水平和高水平分別為7 g/L和9 g/L。

由圖4c可知，隨著尿素添加量的增加，脂肪酶活力呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢(shì)，當(dāng)尿素添加量為10 g/L時(shí)，脂肪酶活力達(dá)到最高，為3.7 U/mL；尿素添加量＞10 g/L脂肪酶活力顯著下降，故將10 g/L作為響應(yīng)面設(shè)計(jì)中尿素含量的中心點(diǎn)，中心點(diǎn)左、右兩側(cè)等距離的因變量8 g/L和12 g/L作為低水平和高水平。

圖4 三丁酸甘油（a）、葡萄糖（b）及尿素（c）添加量對(duì)脂肪酶活力的影響Fig.4 Effects of tributyrin (a),glucose (b) and urea (c) addition on lipase activity

2.3.2 Box-Behnken Design試驗(yàn)結(jié)果

根據(jù)單因素確定的中心點(diǎn)和因素水平，運(yùn)用DesignExpert 8.0.5b中BBD試驗(yàn)設(shè)計(jì)原理進(jìn)行3因素3水平的響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)，試驗(yàn)設(shè)計(jì)方案和結(jié)果見表3，方差分析見表4。對(duì)表3中進(jìn)行多元回歸擬合，建立二階回歸模型，找到最優(yōu)響應(yīng)因子水平，多元二次回歸方程如下所示：

表3 Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果Table 3 Design and results of Box-Behnken experiments

由模型的回歸結(jié)果分析和方程方差分析可知，該二次模型顯著（P=0.000 9＜0.05），失擬項(xiàng)不顯著（P=0.495 7＞0.05），決定系數(shù)R2=0.950 1，說明有95.01%的變差能夠由該模型解釋；變異系數(shù)為2.21%，說明變異（偏離）程度較小。由圖5可知，各因素間有一定的交互作用，最佳預(yù)測(cè)點(diǎn)在試驗(yàn)考查范圍內(nèi)。因此，該二階歸模型具有良好的擬合度，能真實(shí)地描述各因素與響應(yīng)值之間的關(guān)系，可對(duì)菌株U5發(fā)酵產(chǎn)脂肪酶條件進(jìn)行預(yù)測(cè)和分析。一次項(xiàng)A、B，交互項(xiàng)AC，二次項(xiàng)B2對(duì)結(jié)果影響極顯著（P＜0.01）。

表4 響應(yīng)面試驗(yàn)回歸模型方差分析Table 4 Variance analysis of response surface experiments

由回歸方程預(yù)測(cè)得到三丁酸甘油脂添加量為2.00%，葡萄糖添加量為8.84 g/L，尿素添加量為8.00 g/L，發(fā)酵獲得粗脂肪酶活力預(yù)測(cè)值為4.36 U/mL。為方便實(shí)際培養(yǎng)基配制，選取三丁酸甘油脂添加量為2%，葡萄糖添加量為9 g/L，尿素添加量為8 g/L。在此優(yōu)化培養(yǎng)基條件下，發(fā)酵獲得粗脂肪酶活力實(shí)際值為4.30 U/mL，與預(yù)測(cè)值基本接近，說明所建模型擬合良好且可靠。因此通過響應(yīng)面優(yōu)化后得到的最佳發(fā)酵培養(yǎng)基配方為三丁酸甘油脂2%，葡萄糖9 g/L，尿素8 g/L，蛋白陳2 g，K2HPO4·3H2O 1.0 g/L，（NH4）2SO41.0 g/L，MgSO4·7H2O 0.5 g/L；發(fā)酵條件為接種量10%，初始pH值=7，溫度35 ℃，轉(zhuǎn)速220 r/min，搖瓶培養(yǎng)40 h。

圖5 三丁酸甘油脂、葡萄糖及尿素添加量對(duì)發(fā)酵產(chǎn)脂肪酶活力影響的響應(yīng)面及等高線Fig.5 Response surface plots and contour line of effects of interaction of between tributyrin,glucose and urea addition on lipase activity

2.4 模型驗(yàn)證及分析

為檢驗(yàn)?zāi)Ｐ涂煽啃院陀行?，分別用模型預(yù)測(cè)的最優(yōu)培養(yǎng)基配方和原始培養(yǎng)基配方進(jìn)行搖瓶發(fā)酵，每組試驗(yàn)設(shè)置3個(gè)平行，檢測(cè)不同取樣時(shí)間時(shí)的脂肪酶活力，結(jié)果見圖6。由圖6可知，脂肪酶活力最高為4.3 U/mL，比未優(yōu)化前的活力3.7 U/mL提高16.22%。模型的預(yù)測(cè)值與實(shí)際發(fā)酵結(jié)果十分接近說明模型預(yù)測(cè)性良好。

圖6 培養(yǎng)基組分優(yōu)化前后脂肪酶活力的變化Fig.6 Changes of lipase activity before and after culture medium optimization

3 結(jié)論

研究從富油水樣中篩選出一株脂肪酶產(chǎn)生菌株U5，經(jīng)形態(tài)觀察、生理生化試驗(yàn)及16SrDNA序列分析鑒定其為枯草芽孢桿菌（Bacillussubtilis），利用單因素及響應(yīng)面試驗(yàn)優(yōu)化，得到菌株U5發(fā)酵產(chǎn)脂肪酶的培養(yǎng)基中最佳配方為三丁酸甘油2%，葡萄糖9 g/L，尿素8 g/L，在此培養(yǎng)基組分下所產(chǎn)脂肪酶活力為4.3 U/mL，比未優(yōu)化前的酶活力提高16.22%，研究可繼續(xù)對(duì)U5芽孢桿菌發(fā)酵產(chǎn)脂肪酶的菌種進(jìn)行工程化改造、發(fā)酵過程控制優(yōu)化、發(fā)酵罐放大試驗(yàn)等方面做進(jìn)一步探索，逐步提高芽孢桿菌U5產(chǎn)脂肪酶的能力和活力。