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        嗜熱脂肪芽孢桿菌液體發(fā)酵條件的優(yōu)化

        2019-10-28 18:06:26陶文靖胡素麗趙婷婷付敏
        食品安全導(dǎo)刊 2019年8期
        關(guān)鍵詞:培養(yǎng)基

        陶文靖 胡素麗 趙婷婷 付敏

        摘 要:本文通過對芽孢液體發(fā)酵條件進(jìn)行優(yōu)化,確定了嗜熱脂肪芽孢桿菌產(chǎn)孢培養(yǎng)基的最佳配比:0.8%蛋白胨、0.3%酵母粉、0.3%NaCl、Mn2+0.9mmol/L、Ca2+10mmol/L;最佳發(fā)酵條件:pH7.0、接種量0.1%、裝液量100mL、培養(yǎng)時間24h、溫度65℃。對優(yōu)化后的綜合條件進(jìn)行檢測實驗,結(jié)果顯示,液體發(fā)酵產(chǎn)孢率可達(dá)48%左右,較優(yōu)化之前提高15%左右。

        關(guān)鍵詞:嗜熱脂肪芽孢桿菌 液體發(fā)酵 培養(yǎng)基 產(chǎn)孢率

        1 嗜熱脂肪芽孢桿菌的介紹

        1.1 嗜熱脂肪芽孢桿菌的特性

        1917年Smith等在實驗室分離出嗜熱脂肪芽孢桿菌,1920年Donk將其歸類于芽孢桿菌屬(Bacillus)并以嗜熱脂肪芽孢桿菌(Bacillus stearothermophilus)來命名[1]。2001年,Nazina等將包括嗜熱脂肪芽孢桿菌在內(nèi)的6種菌株從芽孢桿菌屬分離出來,并歸類為芽孢桿菌屬(Geobacillus),目前該屬已經(jīng)被國際所公認(rèn)[2]。ATCC、DSMZ,以及國際權(quán)威標(biāo)準(zhǔn)和藥典等已經(jīng)將嗜熱脂肪芽孢桿菌(Bacillus stearothermophilus)更名為嗜熱脂肪土芽孢桿菌(Geobacillus stearothermophilus),但中國依然習(xí)慣稱其為嗜熱脂肪芽孢桿菌(Bacillus stearothermophilus)。

        嗜熱脂肪芽孢桿菌是革蘭氏陽性細(xì)菌,該菌營養(yǎng)細(xì)胞呈長桿、圓端狀,多數(shù)為單菌落,少數(shù)會成對或呈鏈狀排列[ 3 ]。嗜熱脂肪芽孢桿菌的最佳生長溫度為5 6 ~ 6 0℃,最高生長溫度為6 5 ~ 7 5℃,最低生長溫度為3 5 ~ 4 5℃。此外,該菌是需氧或兼性厭氧菌,消耗葡萄糖產(chǎn)酸不產(chǎn)氣,其最適p H值為6 . 8 ~ 7 . 2,當(dāng)p H值接近5時該菌就不能生長[ 4 ]。培養(yǎng)基的營養(yǎng)成分對芽孢生成率有明顯的影響——在培養(yǎng)基中加入無機(jī)離子可提高芽孢產(chǎn)率和芽孢熱抗力,如鈣離子濃度增加可使芽孢的熱抗力增強(qiáng)[ 1 ]。

        1.2 嗜熱脂肪芽孢桿菌的應(yīng)用

        嗜熱脂肪芽孢桿菌可以作為生物指示劑,由于其產(chǎn)生的孢子具有非致病性、無熱原、無毒等特性,并且耐高溫和高壓,因此被歐洲藥典、美國藥典和日本藥典用作熱滅菌生物指示劑。我國也將該菌株列入《消毒與滅菌效果的評價方法與標(biāo)準(zhǔn)》(GB 5981-1995)和《消毒技術(shù)規(guī)范》(2002版)[5]。此外,該菌還被廣泛應(yīng)用于牛奶中抗生素的檢測[6],乳品中抗生素試劑盒應(yīng)用的檢測方法就是依據(jù)嗜熱脂肪芽胞桿菌生長、萌發(fā)產(chǎn)酸使培養(yǎng)基的顏色發(fā)生改變的原理,將其作為檢測指標(biāo)。

        2 儀器與材料

        2.1 實驗儀器

        超凈工作臺:江蘇蘇凈安泰有限公司;pH測試計:ALALIS安萊立思;恒溫?fù)u床:上海一恒科學(xué)儀器有限公司;電子天平:梅特勒-托利多國際貿(mào)易(上海)有限公司;滅菌鍋:上海三申醫(yī)療器械有限公司;磁力攪拌器:IKA儀科;恒溫振蕩器:常州國華電器有限公司;顯微鏡:奧林巴斯(北京)銷售服務(wù)有限公司。

        2.2 實驗材料和試劑

        蛋白胨:北京陸橋技術(shù)有限責(zé)任公司;酵母粉:北京陸橋技術(shù)有限責(zé)任公司;NaCl、CaCl2等:北京陸橋技術(shù)有限責(zé)任公司;NaOH:國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

        3 實驗方法

        3.1 菌株的活化培養(yǎng)

        在無菌條件下用接種環(huán)取一環(huán)誘變后的HY嗜熱脂肪芽孢桿菌,接入含有50mL配有培養(yǎng)基的150mL三角瓶里,置于60℃、140rpm/min的條件下在水浴搖床培養(yǎng)18h,制備種子液。

        3.2 芽孢鏡檢及產(chǎn)率計算

        ①玻片制備:取一片干凈的載玻片,于中央處滴加1滴無菌水,在超凈工作臺內(nèi)用接種針取菌膜涂于水滴內(nèi)并混勻。載玻片用酒精燈的外焰過火加熱直至菌膜干涸。

        ②染色:滴加7.6%的孔雀石綠染液于菌膜上,待看到染液上方發(fā)煙后開始計時,并不停補(bǔ)色,5min后用細(xì)水流沖洗玻片一端,然后用洗耳球吹干水分。滴沙黃復(fù)染液,染色5min,沖洗玻片后吹干。

        ③觀察:打開顯微鏡,用100倍油鏡觀察。在視野中可看到菌體被染成紅色,芽孢被染成綠色。觀察結(jié)束后,用蘸有乙醚酒精液的擦鏡紙擦拭鏡頭。

        芽孢產(chǎn)率計算公式如下:

        該式中,Z為芽孢產(chǎn)率;M1為芽孢數(shù);M2為細(xì)菌數(shù)。

        3.3 產(chǎn)孢培養(yǎng)基營養(yǎng)成分的優(yōu)化

        設(shè)定基礎(chǔ)培養(yǎng)基成分配比及產(chǎn)孢條件:0.5%蛋白胨、0.6%酵母粉、0.3%NaCl、pH7.0、接種量0.1%、裝液量100mL、培養(yǎng)時間24h、培養(yǎng)溫度60℃。通過單因素實驗對基礎(chǔ)培養(yǎng)基成分進(jìn)行實驗優(yōu)化,分別設(shè)置實驗條件因素如下:

        ①蛋白胨濃度分別為0.5%、0.8%、1.0 %、1.2%、1.5%、1.8%;

        ②酵母膏濃度分別為0.3%、0.4%、0.5%、0.6%、0.7%;

        ③NaCl濃度分別為0.1%、0.2%、0.3%、0.4%、0.5%;

        ④添加MnSO4濃度分別為0、0.1、0.3、0.5、0.7、0.9、1.1、1.3mmol/L;

        ⑤添加CaCl2濃度分別為0、2.5、5、7.5、10、12.5、15mmol/L;

        ⑥添加FeSO4?7H2O濃度分別為0、1、2.5、5、7.5、10mmol/L;

        ⑦pH分別選擇至6.0、6.2、6.4、6.6、6.8、7.0、7.2、7.4。

        分別取100mL培養(yǎng)基裝入250mL的錐形瓶中,將活化后的嗜熱脂肪芽孢桿菌種子液以0.1%的接種量接種到培養(yǎng)基中,置于培養(yǎng)箱中,將溫度調(diào)至60℃培養(yǎng)24h,通過芽孢染色和顯微鏡鏡檢的方法估算芽孢產(chǎn)率,以芽孢產(chǎn)率為指標(biāo),重復(fù)3次實驗,確定培養(yǎng)基中營養(yǎng)成分配比。

        3.4 產(chǎn)孢培養(yǎng)條件的優(yōu)化

        以3.3中得到的最優(yōu)培養(yǎng)基組分為基礎(chǔ),進(jìn)行發(fā)酵條件(溫度、時間、接種量)優(yōu)化。通過單因素實驗對產(chǎn)孢條件進(jìn)行實驗優(yōu)化,分別設(shè)置實驗條件因素如下:

        ①培養(yǎng)溫度分別設(shè)置為55、60、65、70、75℃;

        ②培養(yǎng)時間分別設(shè)置為16、20、24、32、36、40h;

        ③接種量分別設(shè)置為0.03%、0.06%、0.1%、0.2%、0.4%。

        通過芽孢染色和顯微鏡鏡檢的方法估算芽孢產(chǎn)率,以芽孢產(chǎn)率為指標(biāo),重復(fù)3次實驗,確定最佳產(chǎn)孢條件。

        3.5 優(yōu)化后條件的驗證

        對經(jīng)過3.3和3.4實驗優(yōu)化所得到的最優(yōu)條件進(jìn)行組合,進(jìn)行5次芽孢發(fā)酵實驗,對芽孢產(chǎn)率進(jìn)行驗證。

        4結(jié)果與分析

        4.1 培養(yǎng)基營養(yǎng)成分的確定

        4.1.1蛋白胨濃度的確定

        依照3.3的實驗方案,以最初培養(yǎng)基組成比例為基礎(chǔ),更改蛋白胨的含量分別為0.5%、0.8%、1.0%、1.2%、1.5%、1.8%,結(jié)果如圖1所示。

        由圖1結(jié)果顯示,在一定范圍內(nèi),隨著蛋白胨濃度的加大,芽孢產(chǎn)率隨之升高。當(dāng)?shù)鞍纂藵舛葹?.8%時,芽孢產(chǎn)率達(dá)到最高,為37.1%;當(dāng)?shù)鞍纂藵舛却笥?.0%時,芽孢產(chǎn)率隨之呈現(xiàn)下降趨勢。所以,確定以0.8%蛋白胨濃度作為以下產(chǎn)孢培養(yǎng)基的成分。

        4.1.2酵母膏濃度的確定

        依照3.3的實驗方案,以前述實驗確定的參數(shù)為前提,更改酵母膏的濃度分別為0.1%、0.2%、0.3%、0.4%、0.5%,結(jié)果如圖2所示。

        由圖2結(jié)果顯示,在一定范圍內(nèi),伴隨酵母膏濃度的加大,芽孢產(chǎn)率隨之提高。當(dāng)酵母膏濃度在0.3%時,芽孢產(chǎn)率達(dá)到最高,為34.2%;當(dāng)酵母膏濃度大于0.3%時,芽孢產(chǎn)率隨之呈現(xiàn)下降趨勢。通過此實驗,確定以0.3%酵母膏濃度作為以下產(chǎn)孢培養(yǎng)基的成分。

        4.1.3 NaCl濃度的確定

        依照3.3的實驗方案,以前述實驗確定的參數(shù)為前提,更改NaCl的濃度分別為0.1%、0.2%、0.3%、0.4%、0.5%,結(jié)果如圖3所示。

        由圖3結(jié)果顯示,在一定范圍內(nèi),伴隨NaCl濃度的加大,芽孢產(chǎn)率隨之提高。當(dāng)NaCl濃度在0.3%時,芽孢產(chǎn)率達(dá)到最高,為34.7%;當(dāng)NaCl濃度大于0.3%時,芽孢產(chǎn)率隨之呈現(xiàn)下降趨勢。通過此實驗,確定以0.3%NaCl濃度作為以下產(chǎn)孢培養(yǎng)基的成分。

        4.1.4 Mn2+濃度的確定

        依照3.3的實驗方案,以前述實驗確定的參數(shù)為前提,更改MnSO4濃度分別為0、0.1、0.3、0.5、0.7、0.9、1.1、1.3mmol/L,結(jié)果如圖4所示。

        由圖4結(jié)果顯示,在一定范圍內(nèi),伴隨Mn2+濃度的加大,芽孢產(chǎn)率隨之提高。當(dāng)Mn2+濃度為0.9mmol/L時,芽孢產(chǎn)率達(dá)到最高,為42.6%;當(dāng)Mn2+濃度大于0.9mmol/L時,芽孢產(chǎn)率隨之呈現(xiàn)下降趨勢。因此,確定產(chǎn)孢培養(yǎng)基中Mn2+的添加量為0.9mmol/L。

        4.1.5 Ca2+濃度的確定

        依照3.3的實驗方案,以前述實驗確定的參數(shù)為前提,增加CaCl2 分別為0、2.5、5、7.5、10、12.5、15mmol/L,結(jié)果如圖5所示。

        由圖5結(jié)果顯示,在一定范圍內(nèi),伴隨Ca2+濃度的加大,芽孢產(chǎn)率隨之提高。當(dāng)Ca2+濃度為10mmol/L時,芽孢產(chǎn)率達(dá)到最高,為47.2%;當(dāng)Ca2+濃度大于10mmol/L時,芽孢產(chǎn)率隨之呈現(xiàn)下降趨勢。通過此實驗,確定產(chǎn)孢培養(yǎng)基中Ca2+的添加量為10mmol/L。

        4.1.6 Fe2+濃度

        依照3.3的實驗方案,以前述實驗確定的參數(shù)為前提,增加FeSO4?7H2O濃度分別為0、1、2.5、5、7.5、10、12.5mmol/L,結(jié)果如圖6所示。

        由圖6結(jié)果顯示,在一定范圍內(nèi),伴隨Fe2+濃度的加大,芽孢產(chǎn)率并沒有顯著提高,反而對芽孢生長有輕微抑制,所以放棄添加Fe2+。

        4.1.7 pH值的確定

        依照3.3的實驗方案,在以上述確定的參數(shù)為前提下,調(diào)節(jié)培養(yǎng)基的pH值分別為6.0、6.2、6.4、6.6、6.8、7.0、7.2、7.4,結(jié)果如圖7所示。

        由圖7結(jié)果顯示,當(dāng)pH偏酸性時,芽孢的形成受到抑制。當(dāng)pH為7.0時芽孢產(chǎn)率最高,為47.2%;當(dāng)pH高于7.0時,芽孢產(chǎn)率逐漸降低,因此產(chǎn)孢最佳pH為7.0。

        通過3.3的實驗,確定培養(yǎng)基營養(yǎng)成分的基本配比為:蛋白胨濃度0.8%、酵母膏濃度0.3%、NaCl濃度0.3%、Mn2+濃度為0.9mmol/L、Ca2+濃度為10mmol/L、pH為7.0,以此作為接下來產(chǎn)孢培養(yǎng)實驗的培養(yǎng)基成分,繼續(xù)優(yōu)化產(chǎn)孢培養(yǎng)條件。

        4.2產(chǎn)孢培養(yǎng)條件的確定

        4.2.1產(chǎn)孢培養(yǎng)溫度的確定

        根據(jù)3.4的實驗方案,進(jìn)行培養(yǎng)溫度對芽孢產(chǎn)率的實驗,培養(yǎng)溫度分別設(shè)置為55、60、65、70、75℃,結(jié)果如圖8所示。

        由圖8結(jié)果顯示,在菌株適應(yīng)生長范圍內(nèi),隨著溫度的提升,芽孢產(chǎn)率有一定的提高,當(dāng)溫度在65℃時芽孢產(chǎn)率最高,為49.7%;當(dāng)溫度高于65℃時,芽孢產(chǎn)率逐漸降低,因此產(chǎn)孢最佳培養(yǎng)溫度為65℃。

        4.2.2產(chǎn)孢培養(yǎng)時間的確定

        根據(jù)3.4的實驗方案,進(jìn)行培養(yǎng)時間對芽孢產(chǎn)率影響的實驗,培養(yǎng)時間設(shè)為16、24、32、36、40h,每隔2~4h進(jìn)行測試,結(jié)果如圖9所示。

        由圖9結(jié)果顯示,當(dāng)培養(yǎng)時間為24~28h時,芽孢產(chǎn)率達(dá)到48%以上;當(dāng)培養(yǎng)時間超過32h時,芽孢產(chǎn)率出現(xiàn)降低趨勢。分析出現(xiàn)這種趨勢的原因可知,隨著時間的變化,其培養(yǎng)基的營養(yǎng)成分已經(jīng)不足以維持菌體的生長繁殖,且菌體逐漸走向衰亡期,活的菌體變少了,所轉(zhuǎn)化的芽孢便會減少。因此,產(chǎn)孢培養(yǎng)的最佳時間為24~28h。

        4.2.3接種量條件的確定

        根據(jù)3.4的實驗方案,進(jìn)行接種量對芽孢產(chǎn)率的實驗,接種量分別為0.03%、0.06%、0.1%、0.2%、0.4%,結(jié)果如圖10所示。

        由圖10結(jié)果顯示,在一定范圍內(nèi),隨著接種量的增加,芽孢產(chǎn)率也隨之增加,當(dāng)接種量為0.1%時,芽孢產(chǎn)率最高,為49.7%。當(dāng)接種量超過0.1%時,芽孢產(chǎn)率降低,這可能是因為培養(yǎng)基中營養(yǎng)物質(zhì)是一定的,當(dāng)菌體數(shù)量太多時,培養(yǎng)基中的營養(yǎng)物質(zhì)無法滿足菌體的生長需求,會嚴(yán)重影響嗜熱芽孢桿菌轉(zhuǎn)化成芽孢的能力,因此最佳接種量為0.1%。

        4.3 芽孢產(chǎn)率的確定

        根據(jù)3.5的實驗方案,進(jìn)行芽孢發(fā)酵實驗,進(jìn)行5次平行實驗,實驗結(jié)果如圖11顯示,經(jīng)過條件優(yōu)化后,芽孢產(chǎn)率平均可以達(dá)到47.8%。

        5 結(jié)果與討論

        通過單因素實驗對嗜熱芽孢桿菌產(chǎn)孢培養(yǎng)條件進(jìn)行優(yōu)化,研究了產(chǎn)孢培養(yǎng)基組成成分(蛋白胨、酵母粉、NaCl、Mn2+、Ca2+、Fe2+、pH)以及產(chǎn)孢培養(yǎng)條件(溫度、時間、接種量),以提高嗜熱芽孢桿菌產(chǎn)孢率。

        本文確定了嗜熱芽孢桿菌產(chǎn)孢培養(yǎng)基最佳配比:蛋白胨為0.8%、酵母粉為0.3%、NaCl為0.3%、Mn2+為0.9mmol/L、Ca2+為10 mmol/L、pH7.0、接種量為0.1%、裝液量為100mL、培養(yǎng)時間為24 h、溫度為65℃。Fe2+的添加對芽孢產(chǎn)率無促進(jìn)作用。隨后通過組合條件的驗證,最終液體發(fā)酵產(chǎn)孢率可穩(wěn)定在47.8%左右,較優(yōu)化之前提高10 %以上。液體發(fā)酵雖然產(chǎn)孢率不如固體發(fā)酵高,但操作簡單,一次可得到的芽孢量遠(yuǎn)遠(yuǎn)大于固體發(fā)酵。該方法能夠提高試劑盒生產(chǎn)企業(yè)的工作效率并降低原材料成本。但目前產(chǎn)孢率仍然偏低,還需要進(jìn)一步優(yōu)化。

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