張麗霞 魏照輝 趙婉晴

摘要：利用響應(yīng)面法對(duì)超聲波輔助酶法提取桑葉總黃酮的條件進(jìn)行優(yōu)化，在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，選取料液比、提取溫度和提取時(shí)間3個(gè)因素為自變量，以桑葉總黃酮提取率為響應(yīng)值，進(jìn)行Box-Behnken中心組合試驗(yàn)設(shè)計(jì)，進(jìn)行響應(yīng)面分析。結(jié)果表明，當(dāng)加酶量為0.8%，超聲功率為200 W，超聲時(shí)間為10 min時(shí)，提取桑葉總黃酮的最佳工藝條件為料液比1 ∶ 18（g/mL），提取溫度51 ℃，提取時(shí)間3.6 h，在此條件下總黃酮提取率為5.55%，總黃酮產(chǎn)量理論值與試驗(yàn)平均值相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)誤差為0.89%，表明Box-Behnken模型優(yōu)化可用于桑葉總黃酮提取條件優(yōu)化，所得參數(shù)準(zhǔn)確可靠，具有實(shí)用價(jià)值。

關(guān)鍵詞：桑葉;總黃酮;超聲波輔助酶法提取;響應(yīng)面法;提取率

中圖分類號(hào)： R284.2 ?文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A ?文章編號(hào)：1002-1302（2019）13-0217-05

桑葉為?？浦参锷＃∕orus alba L.）的干燥葉。近年來隨著健康飲食的價(jià)值回歸，桑葉已經(jīng)被廣泛應(yīng)用于食品工業(yè)、醫(yī)藥、美容護(hù)膚等方面，呈現(xiàn)出古樹新花的局面。桑葉含有礦物質(zhì)、維生素、食物纖維、氨基酸、植物甾醇、黃酮類等多種功能性成分，具有降血糖、降血壓、降低膽固醇、抗衰老、維持消化系統(tǒng)和排泄系統(tǒng)健康、防癌抗癌、提高免疫力等功效[1-4]。

桑葉具有上述功效，是因?yàn)槠浜悬S酮類、生物堿類、糖類，以及甾類、揮發(fā)油、氨基酸類、維生素和微量元素等有效成分，而黃酮類化合物和生物堿為主要功效成分，其中黃酮類化合物占桑葉干質(zhì)量的1%～3%，具有降血脂、清除自由基、抗炎和抗癌等作用[5-8]。桑葉黃酮類化合物具有顯著的抗癌、抗氧化作用，受到人們的廣泛關(guān)注，其抗腫瘤作用主要表現(xiàn)在抗癌細(xì)胞增殖、誘導(dǎo)癌細(xì)胞凋亡和增強(qiáng)抑癌基因活性及抑制癌基因表達(dá)等方面[9-10]。因此，考慮到桑葉黃酮具有上述特殊功效，有必要對(duì)其提取工藝研究。

國內(nèi)外對(duì)黃酮提取的研究較多，目前提取桑葉黃酮主要采用水、乙醇等溶劑進(jìn)行提取，但該方法有提取率低、生產(chǎn)周期長的缺點(diǎn)。也有研究采用超聲法、微波法和超臨界CO2提取法提取桑葉黃酮。但從桑葉中超聲波輔助酶法提取總黃酮的報(bào)道卻并不多見。其中超聲波輔助提取法是一種從植物中提取活性成分的重要方法[11-12]，近年來被廣泛應(yīng)用于植物活性成分的提取研究。超聲提取相對(duì)于微波法提取和超臨界CO2提取具有提取率高、速率快、能耗低的優(yōu)點(diǎn)[13-14]。本研究采用超聲波輔助酶法，在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，采用了 Box-behnken 中心組合設(shè)計(jì)，使用響應(yīng)面分析法對(duì)桑葉總黃酮超聲波輔助提取條件進(jìn)行了優(yōu)化。為更好地開發(fā)利用桑葉的藥用食用價(jià)值提供合理的依據(jù)和參考。1 材料與方法

1.1 材料與儀器

材料與試劑：供試桑葉采摘于江蘇省句容市桑樹基地，經(jīng)自然干燥后用粉碎機(jī)粉碎，過200目篩保存于4 ℃冰箱;蕓香苷標(biāo)準(zhǔn)品購自國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司;無水乙醇、氫氧化鈉、硝酸鋁、亞硝酸鈉等試劑均為國產(chǎn)分析純，購自天津市科密歐試劑有限公司。

儀器：UV-1600紫外可見分光光度計(jì)，上海美譜達(dá)儀器有限公司生產(chǎn);JJ500型電子天平，常熟市雙杰測(cè)試儀器廠生產(chǎn);DHG-9053A電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱，上海合恒儀器設(shè)備有限公司生產(chǎn);電熱恒溫水浴鍋，常州智博瑞儀器制造有限公司生產(chǎn);TDL-5離心機(jī)，上海安亭科學(xué)儀器廠生產(chǎn);JP-5OOB-2型高速多功能粉碎機(jī)，上海市久品實(shí)業(yè)有限公司生產(chǎn);THZ-C-1臺(tái)式冷凍振蕩器，太倉市儀器設(shè)備廠生產(chǎn);Synergy UV超純水儀，南京雙隆試驗(yàn)器材有限公司生產(chǎn)。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 桑葉總黃銅的提取 超聲波輔助果膠酶法提取：準(zhǔn)確稱取0.5 g桑葉于100 mL蒸餾水中，加入果膠酶0.6%（質(zhì)量分?jǐn)?shù)），放入50 ℃的水浴鍋中排氣3 min，然后在50 ℃下超聲輔助提取一段時(shí)間，準(zhǔn)確吸2 mL提取液到離心管中，離心（10 000 r/min）5 min后得到澄清提取液。

1.2.2 桑葉總黃銅含量的測(cè)定 桑葉中總黃酮含量采用鋁鹽鰲合顯色法測(cè)定[15]。準(zhǔn)確稱量80 mg蕓香苷標(biāo)準(zhǔn)品，置于100 mL容量瓶中，用75%乙醇定容，配制成0.8 mg/mL的蕓香苷標(biāo)準(zhǔn)液。然后蕓香苷標(biāo)準(zhǔn)液和75%乙醇分別按照1 ∶ 1、1 ∶ 3、1 ∶ 7、1 ∶ 15體積比配制成0.40、0.20、0.10、0.05 mg/mL 蕓香苷對(duì)照品溶液。510 nm處測(cè)定吸光度，以75%乙醇作空白對(duì)照。以吸光度為縱坐標(biāo)，對(duì)照品的濃度（mg/mL）為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得到線性回歸方程：Y=1.0980X+0.003 2（R2=0.997 8），利用標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算樣品總黃銅含量（C）。提取物總黃酮提取率公式：

W=（CV/m）×100%。

式中：W為黃酮提取率（%）;V為提取液的總體積（mL）;m為稱量的桑葉粉的準(zhǔn)確質(zhì)量（g）。

1.2.3 單因素試驗(yàn) （1）加酶量對(duì)提取效果的影響 在固定料液比1 ∶ 10（g/mL），提取溫度60 ℃，提取時(shí)間2 h，超聲功率200 W，超聲10 min條件下，考察不同加酶量（0.2%、0.4%、0.6%、0.8%、1.0%）對(duì)桑葉中總黃銅提取率的影響，篩選出最佳的加酶量。（2）料液比對(duì)提取效果的影響 在固定加酶量0.8%，提取溫度60 ℃，提取時(shí)間2 h，超聲功率 200 W，超聲10 min的條件下，考察不同料液比（1 ∶ 10、1 ∶ 15、1 ∶ 20、1 ∶ 25）對(duì)桑葉中總黃銅提取率的影響，篩選出最佳的料液比。（3）提取溫度對(duì)提取效果的影響 在固定加酶量0.8%，料液比1 ∶ 10（g/mL），提取時(shí)間2 h，超聲功率200 W，超聲10 min的條件下，考察不同提取溫度（40、45、50、55、60 ℃）對(duì)桑葉中總黃銅提取率的影響，篩選出最佳的提取溫度。（4）提取時(shí)間對(duì)提取效果的影響 在固定加酶量 0.8%，料液比1 ∶ 10（g/mL），提取溫度60 ℃，超聲功率 200 W，超聲10 min的條件下，考察不同提取時(shí)間（1、2、3、4 h）對(duì)桑葉中總黃銅提取率的影響，篩選出最佳的提取時(shí)間。（5）超聲波功率對(duì)提取效果的影響 在固定加酶量0.8%，料液比1 ∶ 10（g/mL），提取溫度60 ℃，超聲10 min的條件下，考察不同超聲功率（150、200、250、300、400 W）對(duì)桑葉中總黃銅提取率的影響，篩選出最佳的超聲波功率。

1.2.4 響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì) 在單因素試驗(yàn)結(jié)果基礎(chǔ)上，固定加酶量0.8%，超聲功率200 W，超聲10 min等條件，采用Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)，以選取料液比、提取溫度和提取時(shí)間3個(gè)因素為自變量，以桑葉黃酮提取率為響應(yīng)值，進(jìn)行Box-Behnken試驗(yàn)，以-1、0、1分別代表自變量的低、中、高3個(gè)水平，試驗(yàn)因素水平及編碼見表1。

1.2.5 數(shù)據(jù)處理 采用Design-Expert 8.0.6軟件進(jìn)行響應(yīng)面分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 加酶量對(duì)桑葉總黃酮提取率的影響

由圖1可知，隨著加酶量的增大，總黃酮的提取率逐漸增大，當(dāng)加酶量大于0.6%后總黃酮提取率差異不顯著，說明此時(shí)酶已經(jīng)達(dá)到飽和，為了避免酶的浪費(fèi)而造成成本加大，因此選擇最佳加酶量為0.6%。

2.2 料液比對(duì)桑葉總黃酮提取率的影響

由圖2可知，隨著液料比的增大，桑葉總黃酮的提取率逐漸提高，這主要是由溶劑能夠溶解的黃酮的量不斷增加所致[16]。當(dāng)液料比達(dá)1 ∶ 20時(shí)，再增加溶劑用量，提取率提高不明顯，因此選擇最佳液料比為1 ∶ 20。

2.3 提取溫度對(duì)桑葉總黃酮提取率的影響

由圖3可知，隨著提取溫度的升高，總黃酮提取的提取率呈現(xiàn)逐漸增大的變化趨勢(shì)，這主要是由于溫度升高，加劇了黃酮分子運(yùn)動(dòng)及相互間的碰撞頻率，促進(jìn)植物細(xì)胞破裂[17]，有助于黃酮滲出擴(kuò)散到溶劑中。但是溫度增加至50 ℃時(shí)，再升高溫度對(duì)總黃酮的提取率影響不明顯。因此從節(jié)能和提高提取效率的角度考慮，選擇最佳提取溫度為50 ℃。

2.4 提取時(shí)間對(duì)桑葉總黃酮提取率的影響

由圖4可知，隨著提取時(shí)間的延長，總黃酮提取率逐漸增大，當(dāng)提取時(shí)間為3 h時(shí)，總黃酮的提取率為4.52%，繼續(xù)延長提取時(shí)間，總黃酮的提取率變化不大。理論上提取時(shí)間越長，原料與提取劑的接觸越充分，提取也越充分。但是時(shí)間延長會(huì)增加試驗(yàn)周期。因此本試驗(yàn)將提取時(shí)間確定為3 h。

2.5 超聲功率對(duì)桑葉總黃酮提取率的影響

由圖5可知，當(dāng)超聲功率小于250 W時(shí)，總黃酮的提取率隨超聲功率的升高而升高，250 W時(shí)總黃酮的提取率達(dá)到最大，當(dāng)超聲功率大于250 W時(shí)總黃酮提取率明顯下降。因此，選用超聲功率為250～300 W。

2.6 回歸方程的建立與方差分析

Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果見表2。以總黃酮提取率（Y）為指標(biāo)，利用Design-expert 8.0.1 Trial數(shù)據(jù)處理軟件中ANOVA程序?qū)Ρ?的試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行二次回歸分析，計(jì)算出方程各項(xiàng)系數(shù)并進(jìn)行方差分析，可得3個(gè)因子與Y之間的回歸方程（模型）為

Y=5.520+0.069X1+0.030X2+0.099X3-0.020X1X2-0.067X1X3-0.015X2X3-0.130X12-0.095X22-0.067X32。

由方差分析（表3）可以看出，所得Y1的回歸方程極顯著（P<0.01），且R2>0.9，失擬項(xiàng)F檢驗(yàn)不顯著（P>0.05），說明回歸方程擬合度好，模型顯著（P<0.01），該回歸模型可用于試驗(yàn)結(jié)果分析。料液比和提取時(shí)間對(duì)桑葉總黃酮提取率的影響極顯著（P<0.01），提取溫度對(duì)桑葚葉總黃酮提取率的影響不顯著（P>0.05）。二次項(xiàng)X12、X22以及交互項(xiàng)中的X1X3也對(duì)桑葉總黃酮提取率的影響顯著（P<0.05）。這表明各試驗(yàn)因素對(duì)總黃酮提取率的影響呈二次關(guān)系，且3個(gè)因素之間存在交互作用。

2.7 響應(yīng)面分析

2.7.1 響應(yīng)面各因素間交互作用的優(yōu)化分析 響應(yīng)面的圖形是可以反映各試驗(yàn)因子對(duì)響應(yīng)值的影響，而等高線圖能反映最優(yōu)條件下各試驗(yàn)因子的取值以及各因子之間的交互作用。圓形等高線表示2個(gè)因素交互作用不顯著，而橢圓形等高線表示2個(gè)因素交互作用顯著。

料液比和提取溫度2個(gè)因素對(duì)總黃酮提取率的交互作用見圖6。由響應(yīng)面圖可知，X1、X2 2個(gè)因素的交叉項(xiàng)顯著，料液比約在（1 ∶ 18、1 ∶ 20），提取溫度約在（45、50 ℃），二者存在顯著增效作用，呈現(xiàn)正相關(guān)關(guān)系;而料液比約在（1 ∶ 20、1 ∶ 23），提取溫度約在（50、55 ℃），桑葉總黃酮提取率隨二者的增加而降低。由等高線圖可知，總黃酮提取率最大為5.58%。

料液比和提取時(shí)間2個(gè)因素對(duì)總黃酮提取率的交互作用見圖7。由圖7可知，X1、X3 2個(gè)因素的交叉項(xiàng)顯著，在料液比約在（1 ∶ 18、1 ∶ 20），提取時(shí)間約在（2、4 h），二者存在顯著增效作用，呈現(xiàn)正相關(guān)關(guān)系。由等高線圖可知，總黃酮提取率最大為5.53%。

提取溫度和提取時(shí)間2個(gè)因素對(duì)總黃酮提取率的交互作用見圖8。由圖8可知，X2、X3 2個(gè)因素的交叉項(xiàng)顯著，在提取溫度約在（40、45 ℃），提取時(shí)間約在（2、4 h），二者存在顯著增效作用，呈現(xiàn)正相關(guān)關(guān)系。由等高線圖可知，總黃酮提取率最大為5.49%。

2.7.2 模型的驗(yàn)證 為了檢驗(yàn)響應(yīng)面法優(yōu)化桑葉提取總黃酮工藝結(jié)果的可靠性，根據(jù)得到的優(yōu)化條件進(jìn)行3次驗(yàn)證試驗(yàn)，結(jié)果顯示，試驗(yàn)平均值為5.55%，與預(yù)測(cè)的最大響應(yīng)值相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為0.89%，表明Box-Behnken模型優(yōu)化可用于桑葉總黃酮的提取條件優(yōu)化，所得參數(shù)準(zhǔn)確可靠，具有實(shí)用價(jià)值。

3 結(jié)論與討論

桑葉黃酮的提取方法有多種[18]，牟會(huì)榮等采用響應(yīng)面法就提取時(shí)間、提取度、乙醇濃度和液料比4個(gè)因素進(jìn)行桑葉黃酮提取工藝的優(yōu)化，所得最佳提取工藝為提取溫度68 ℃、提取時(shí)間40 min、乙醇濃度52%和液料比86 mL/g，此條件下桑葉黃酮得率為4.71%，而理論預(yù)測(cè)值為4.64%[19]。田剛等利用均勻設(shè)計(jì)法對(duì)超臨界CO2流體提取桑葉黃酮的工藝進(jìn)行優(yōu)化，結(jié)果表明，超臨界CO2流體提取桑葉黃酮的最佳提取條件為提取溫度51 ℃，提取壓強(qiáng)36 MPa，提取時(shí)間4.0 h，夾帶劑乙醇用量3.7 mL/g，在此條件下測(cè)得的桑葉黃酮的提取率為1.42%[20]。本研究在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，采用超聲波輔助酶法提取桑葉總黃酮，并采用響應(yīng)面法對(duì)提取工藝進(jìn)行優(yōu)化，獲得的桑葉總黃酮最佳提取工藝條件為料液比1 ∶ 18，提取溫度51 ℃，提取時(shí)間3.6 h，在此條件下總黃酮提取率為5.55%，總黃酮產(chǎn)量理論值與試驗(yàn)平均值相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)誤差為 0.89%，表明Box-Behnken模型優(yōu)化可用于桑葉總黃酮的提取條件優(yōu)化，所得參數(shù)準(zhǔn)確可靠，具有實(shí)用價(jià)值。與傳統(tǒng)的有機(jī)溶劑回流提取法、超臨界CO2提取法相比，本方法具有安全無毒、成本低、提取率較高、操作簡單的特點(diǎn)。

參考文獻(xiàn)：

[1]王向陽，俞興偉，仝義超. 桑葉多糖的提取與降血糖功能研究[J]. 中國食品學(xué)報(bào)，2014，14（9）：63-67.

[2]鄭曉靜，伍金娥，何計(jì)國，等. 響應(yīng)面法優(yōu)化超聲波提取桑葉中 1- 脫氧野尻霉素的工藝研究[J]. 中國食品學(xué)報(bào)，2012，12（9）：34-40.

[3]丁雙華，葉立斌，陳 衛(wèi)，等. 響應(yīng)面優(yōu)化提取桑葉多酚的研究[J]. 中國食品學(xué)報(bào)，2012，12（1）：52-58.

[4]應(yīng) 芝，勵(lì)建榮，韓曉祥. 響應(yīng)面分析法優(yōu)化桑葉多糖提取工藝的研究[J]. 中國食品學(xué)報(bào)，2008，8（4）：39-45.

[5]賀偉強(qiáng)，向天勇，陶 昆，等. 響應(yīng)面法優(yōu)化超聲輔助提取桑葉總黃酮的工藝研究[J]. 中國農(nóng)學(xué)通報(bào)，2012，28（33）：296-301.

[6]Chun H C，Yu T C，Tsui H T，et al. Mulberry leaf extract inhibit hepatocellular carcinoma cell proliferation via depressing IL-6 and TNF-α derived from adipocyte[J]. Journal of Food and Drug Analysis，2018，26（3）：1024-1032.

[7]Zhang Y，Ren C J，Lu G B，et al. Purification，characterization and anti-diabetic activity of a polysaccharide from mulberry leaf[J]. Regulatory Toxicology and Pharmacology，2014，70（3）：687-695.

[8]玄光善，潘士佳，南 姬. 桑葉有效成分降糖作用研究[J]. 食品科學(xué)，2011，32（7）：323-326.

[9]楊 雨，歐陽臻，常 鈺，等. 桑葉不同組分降血糖作用研究[J]. 食品科學(xué)，2007，28（8）：454-456.

[10]王志雄，高劍文，繆偉偉. 桑葉對(duì)腫瘤血管生成的影響[J]. 中國醫(yī)藥導(dǎo)報(bào)，2014，11（25）：22-25.

[11]李先佳，郁建平，都國棟. 桑葉總黃酮和多糖提取工藝優(yōu)化[J]. 食品科學(xué)，2005，26（6）：159-162.

[12]林英男，時(shí) 偉. 超臨界CO2提取桑葉中總黃酮的工藝研究[J]. 齊魯工業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)（自然科學(xué)版），2014（3）：32-36.

[13]Wen L R，Yang B，Cui C，et al. Ultrasound-assisted extraction of phenolics from longan （Dimocarpus longan Lour.） fruit seed with artificial neural network and their antioxidant activity[J]. Food Analytical Methods，2012，5（6）：1244-1251.

[14]鐘雨珅，王歷瓊，韓小丹，等. 正交試驗(yàn)優(yōu)化超聲波輔助同時(shí)提取桑葉總黃酮、單寧工藝[J]. 食品科學(xué)，2015，36（12）：44-48.

[15]李文利，寧喜斌，熊梓伊，等. 響應(yīng)面法優(yōu)化微波提取桑葉黃酮和多糖工藝研究[J]. 食品工業(yè)，2015（2）：21-25.

[16]Katsube T，Imawaka N，Kawano Y，et al. Antioxidant flavonol glycosides in mulberry （Morus alba L.） leaves isolated based on LDL antioxidant activity[J]. Food Chemistry，2006，97（1）：25-31.

[17]孫敏耀，唐文照，盧 霞，等. 分光光度法測(cè)定不同采收時(shí)間桑葉中總黃酮[J]. 中草藥，2004，35（10）：116-117.

[18]繆偉偉，王志雄，石仝雨，等. 響應(yīng)曲面法與正交法在二氧化碳超臨界萃取桑葉總黃酮中的比較[J]. 江蘇農(nóng)業(yè)科學(xué)，2017，45（18）：189-193.

[19]牟會(huì)榮，陳 昆，王曉嵐，等. 正交試驗(yàn)法與響應(yīng)面法在桑葉黃酮提取工藝優(yōu)化中的應(yīng)用和比較[J]. 江蘇科技大學(xué)學(xué)報(bào)（自然科學(xué)版），2016，30（1）：88-93.

[20]田 剛，楊 叢，趙曉軍，等. 均勻設(shè)計(jì)優(yōu)化超臨界CO2流體提取桑葉黃酮的研究[J]. 農(nóng)業(yè)科學(xué)研究，2016，37（4）：23-26，35.