韓思儀 崔永一

摘要：以蝴蝶蘭Taisuco Hatarot類原球莖（PLB）為試材，主要探討培養(yǎng)基成分、凝膠劑、吸附劑、抗氧化劑、PLB團塊大小、培養(yǎng)條件等培養(yǎng)因子對PLB團塊增質量、PLB增殖量、PLB分化和褐化的影響。結果顯示，在培養(yǎng)基為 1/2 MS+10 mg/L 6-芐氨基腺嘌呤（6-BA）+玉米素（adenine sulfate）10 mg/L+15%椰汁+15 g/L蔗糖+1 g/L活性炭+0.8 mg/L硝酸銀+60 g/L玉米粉，pH值為5.5，切割PLB團塊大小為1 cm×1 cm以上等培養(yǎng)條件下，既可使蝴蝶蘭PLB增殖與分化保持在較高水平，又能有效地控制褐化現(xiàn)象。

關鍵詞：蝴蝶蘭;類原球莖（PLB）;褐化防治

中圖分類號： S682.310.4+3 ?文獻標志碼： A ?文章編號：1002-1302（2019）13-0067-05

蝴蝶蘭是單子葉植物綱天門冬目蘭科蝴蝶蘭屬多年生附生植物，主要分布在泰國、菲律賓、馬來西亞、印度尼西亞及中國臺灣等地。其花形奇特，花姿高雅，色澤艷麗，花期持久，有“蘭中皇后”的美譽，通常以盆景方式擺放于家居、中高檔商場和會議等重要場合，形成具有藝術性的空間主景[1]，不僅豐富了植物景觀內容[2]，而且具有極高觀賞價值和經(jīng)濟價值。蝴蝶蘭屬單莖性氣生蘭，再生能力弱，組織培養(yǎng)是其主要繁殖方式，具有增殖率高、繁殖速度快、不受季節(jié)變化影響等諸多優(yōu)點，實現(xiàn)了蝴蝶蘭繁殖的大規(guī)模生產(chǎn)。類原球莖易于增殖分化培養(yǎng)，是蝴蝶蘭快繁過程中常見的外植體選擇對象。褐變現(xiàn)象、菌類污染和玻璃化現(xiàn)象為蝴蝶蘭類原球莖組織培養(yǎng)過程中的三大難題，尤其是褐變，嚴重影響了類原球莖增殖分化。

褐變現(xiàn)象是指外植體向培養(yǎng)基中釋放褐色物質，使培養(yǎng)基逐漸變成褐色，反過來抑制外植體生長，致其死亡的過程[3-4]。朱志國認為，采用1/2MS+1 mg/L NAA+0.5 mg/L BA培養(yǎng)基成分，pH值為5.5，液體培養(yǎng)20 d，春石斛類原球莖（PLB）增殖效果最佳，且沒有明顯的褐化現(xiàn)象[5]。Degl等認為，將蝴蝶蘭PLB放置在溫度為15～20 ℃的環(huán)境下，培養(yǎng)基的pH值為5.5，可以有效減少褐變物質的排出[6]。劉福平等認為，在培養(yǎng)基中添加100 mg/L半胱氨酸與8.0 g/L甘露醇，可降低過氧化物酶活性，從而有效減少蝴蝶蘭PLB褐化現(xiàn)象[7]。王寶寧等認為，在1/2 MS培養(yǎng)基中添加1 g/L活性炭（AC）及5 g/L聚乙烯吡咯烷酮（PVP），經(jīng)過暗培養(yǎng)10 d能有效減少春蘭根莖褐化現(xiàn)象[8]。這表明蘭科植物防褐化現(xiàn)象的方法主要是通過調整培養(yǎng)條件、抗氧化劑、激素、吸附劑、培養(yǎng)方式等5個方面，不同蘭科植物和品種所采取的防褐化方法不盡相同。因此，找到最適合蝴蝶蘭類原球莖防褐化的方法，同時保證類原球莖良好的增殖分化狀態(tài)，是本研究的主要內容。有關蝴蝶蘭組培過程中防褐化的研究不在少數(shù)，但普遍內容零散，不夠全面，缺乏系統(tǒng)性。本試驗在參考國內外相關報道的基礎上，以蝴蝶蘭‘Taisuco HatarotPLB為試材，從培養(yǎng)條件和培養(yǎng)基成分兩大方面，系統(tǒng)探討了蝴蝶蘭類原球莖防褐化的主要方法，為蝴蝶蘭再生體系的優(yōu)化、優(yōu)良種苗工廠化生產(chǎn)以及以PLB為受體的蝴蝶蘭轉基因研究提供科學依據(jù)，同時也為解決其他蘭科植物和單子葉植物快繁過程中的褐化問題提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

本試驗以浙江農林大學組培室內長勢良好、色澤翠綠、未分化的蝴蝶蘭Taisuco Hatarot類原球莖為試材，從2016年11月開始，進行為期4個月的試驗。

1.2 方法

試驗具體處理如下：

（1）激素濃度：在含有15%椰汁、15 g/L蔗糖、3 g/L聚乙烯吡咯烷酮的1/2 MS培養(yǎng)基中分別添加0、5、10 mg/L 的玉米素（ZT）和5、10 mg/L的6-芐氨基腺嘌呤（6-BA），將pH值調至5.5后，加入8 g/L瓊脂粉。

（2）凝膠劑種類：將含有15%椰汁、15 g/L蔗糖、3 g/L PVP、5 mg/L 6-BA的1/2 MS培養(yǎng)基pH值調至5.5后，分別加入8 g/L瓊脂、3 g/L植物凝膠（Phytagel）、60 g/L玉米粉。

（3）蔗糖濃度：在含有15%椰汁、3 g/L PVP、5 mg/L 6-BA的1/2 MS培養(yǎng)基中分別加入0、15、25、35 g/L蔗糖，將pH值調至5.5后，加入8 g/L瓊脂。

（4）吸附劑種類：將含有15%椰汁、15 g/L蔗糖、5 mg/L 6-BA的1/2 MS培養(yǎng)基的pH值調至5.5后，加入8 g/L瓊脂粉，再分別加入1 g/L活性炭、3 g/L PVP、1 g/L活性炭+3 g/L PVP。

（5）暗培養(yǎng)時間：將含有15%椰汁、15 g/L蔗糖、3 g/L PVP、5 mg/L 6-BA的1/2 MS培養(yǎng)基的pH值調至5.5后加入8 g/L瓊脂粉。分別進行0、5、10、15 d的暗培養(yǎng)處理，之后放入光照條件下培養(yǎng)。

（6）抗氧化劑的不同種類和濃度：在含有15%椰汁、15 g/L 蔗糖、3 g/L PVP、5 mg/L 6-BA的1/2 MS培養(yǎng)基中分別加入0.4、0.8、1.2 mg/L硝酸銀，1 500、3 000、5 000 mg/L檸檬酸，0.5、2、4 mg/L維生素C，0.5、1、1.5 mg/L多效唑，100、500、1 000 mg/L硫代硫酸鈉，將pH值調至5.5后加入 8 g/L 瓊脂粉。

（7）PLB團塊大小：將含有15%椰汁、15 g/L蔗糖、3 g/L PVP、5 mg/L 6-BA的1/2MS培養(yǎng)基的pH值調至5.5后加入8 g/L瓊脂粉。在接種時，將PLB團塊切成長×寬為（0.1～0.5） cm×（0.1～0.5） cm、（0.5～1） cm×（0.5～1） cm、1 cm×1 cm以上3個組。每組處理45個PLB團塊。

以上采用的培養(yǎng)基經(jīng)高壓滅菌鍋于120 ℃、20 min滅菌后，倒入200 mL帶塑料蓋的密封廣口瓶中，每瓶約30 mL，每組處理10瓶，每瓶接入5個PLB團塊，每個PLB團塊大小為 （0.5～1） cm×（0.5～1） cm。將接種好的培養(yǎng)材料放置在溫度為（25±1） ℃、光照度為2 300～2 500 lx、光—暗周期為14 h—10 h的組培條件下進行培養(yǎng)，45 d后觀察并統(tǒng)計數(shù)據(jù)。

數(shù)據(jù)分析方法：用SPSS（Statistical Product and Service Solutions）分析數(shù)據(jù)，多重比較檢驗采用最小顯著性差異（LSD）法。所有試驗數(shù)據(jù)均表示為“x±s”，P<0.05表示處理間差異顯著。

2 結果與分析

2.1 不同激素濃度對PLB生長發(fā)育及褐化的影響

由表1和圖1可觀察到，ZT和6-BA對PLB團塊增質量、PLB增殖量、分化率及褐化率均有影響。10 mg/L 6-BA和10 mg/L ZT對PLB團塊增質量和PLB增殖量的影響均較大，但兩者之間差異不顯著。10 mg/L ZT、5 mg/L 6-BA和 10 mg/L 6-BA處理下的原球莖分化效果均較好，3組處理組之間差異不明顯。激素種類和濃度對PLB褐化影響較小，與對照組相比，無顯著差異。綜上所述，添加10 mg/L 6-BA對PLB褐化的影響較小，同時能保持PLB較高的分化和增殖水平。

2.2 不同凝膠劑種類對PLB生長發(fā)育和褐化的影響

由表2和圖2可觀察到，玉米粉處理組PLB團塊增質量、PLB增殖量、分化率均最高，且防褐變的效果最佳。玉米粉處理組的PLB團塊增質量和PLB增殖量及褐變率與其他處理組相比存在顯著差異，可較大程度地減少PLB褐化現(xiàn)象。玉米粉處理組和Phytagel處理組均有利于PLB的分化，與瓊脂粉處理組相比有明顯差異。

2.3 不同蔗糖濃度對PLB生長發(fā)育及褐化的影響

由表3和圖3可觀察到，蔗糖濃度對PLB增殖量、分化及褐化率均有明顯影響，但對PLB團塊增質量的影響較小。隨著蔗糖濃度的增加，PLB增殖量有增加的趨勢，而當蔗糖濃度達到35 g/L時，PLB增殖量減少。當蔗糖濃度達到35 g/L時，PLB的分化率最高，并隨著蔗糖濃度的下降逐漸降低。當蔗糖濃度為25 g/L和35 g/L時，PLB褐化率較高，說明較低濃度的蔗糖有利于PLB防褐化。15 g/L的蔗糖濃度不僅能將PLB增殖量與分化率保持在較高的水平，同時又能較有效地控制其褐化率。

2.4 不同吸附劑對PLB生長發(fā)育及褐化的影響

由表4和圖4可觀察到，培養(yǎng)基中單獨使用活性炭時PLB團塊增質量、PLB增殖量和防褐變效果最佳，與另外2個處理組有明顯差異。培養(yǎng)基中添加PVP的處理組的褐化率最高。綜上所述，1 g/L活性炭作為吸附劑可有效防止褐化現(xiàn)象，同時能保持較高的PLB增殖和分化水平。

2.5 不同暗培養(yǎng)時間對PLB生長發(fā)育及褐化的影響

由表5和圖5可觀察到，暗培養(yǎng)時間對PLB團塊增質量、PLB增殖量、分化率及褐化率均有影響。接種后暗培養(yǎng) 5 d 處理組PLB團塊增質量最大，暗培養(yǎng)0、15 d的PLB團塊增質量最小。暗培養(yǎng)10 d的處理組PLB增殖量最大，與其他處理組相比有顯著差異。對照組PLB分化最高，說明PLB全光照培養(yǎng)有利于PLB的分化。暗培養(yǎng)5 d對防褐變的效果最佳，但暗培養(yǎng)處理組之間不存在明顯差異，與暗培養(yǎng)0 d處理組相比存在明顯差異，說明暗培養(yǎng)有利于PLB的防褐化。綜上所述，接種后暗培養(yǎng)1個星期左右可有效防止褐化現(xiàn)象，同時有利于PLB的增殖。

2.6 不同抗氧化劑對PLB生長發(fā)育及褐化的影響

由表6和圖6、圖7可觀察到，抗氧化劑的不同種類和濃度對PLB團塊增質量、PLB增殖量、PLB分化及褐化均有影響。培養(yǎng)45 d后，培養(yǎng)基中添加多效唑和硫代硫酸鈉的處理組PLB團塊褐化死亡率達100%。0.4、0.8 mg/L硝酸銀或 2 mg/L 維生素C處理組PLB團塊增質量較高，與其他處理相比有顯著差異。1.2 mg/L硝酸銀和2 mg/L維生素C處理組PLB增殖量較大，3 000 mg/L檸檬酸處理組PLB增殖量最小。硝酸銀處理組PLB分化效果最佳，硝酸銀不同濃度處理組之間PLB分化無明顯差異。檸檬酸和維生素C處理組PLB分化效果均較差。硝酸銀處理組防褐變效果較佳，與其他抗氧化劑處理組相比有明顯差異，但硝酸銀不同濃度處理組之間沒有明顯差異。綜上所述，硝酸銀是抑制PLB褐化的最適抗氧化劑，其中以0.8 mg/L為最佳濃度。

2.7 不同PLB團塊大小對PLB生長發(fā)育及褐化的影響

由表7和圖8可觀察到，PLB團塊大小對PLB團塊增質量、PLB增殖量和褐化程度均有影響。當PLB團塊大小在 1 cm×1 cm以上時，PLB團塊增質量和PLB增殖量較高，且防褐變效果最佳，與其他處理組相比有顯著差異。不同PLB團塊大小處理組之間PLB分化率無明顯差異，說明PLB團塊大小對其分化的影響較小。綜上所述，當PLB大小為1 cm×1 cm以上時能有效防止褐化現(xiàn)象，同時有利于PLB生長發(fā)育。

3 討論

本試驗結果顯示，當培養(yǎng)基為1/2 MS+10 mg/L 6-BA+玉米素10 mg/L+15%椰汁+15 g/L蔗糖+1 g/L AC+0.8 mg/L 硝酸銀+60 g/L玉米粉，pH值為5.5，切割PLB團塊大小為1 cm×1 cm以上，接種后暗培養(yǎng)1個星期左右時，既能使蝴蝶蘭PLB增殖與分化保持在較高水平，同時又能有效控制褐化現(xiàn)象。

試驗中觀察到，ZT和6-BA不同濃度處理組之間PLB褐化率無明顯差異。而張和等認為，當6-BA濃度大于 1 mg/L 時，雖能促進蝴蝶蘭PLB的增殖，但也容易引起褐化[9]，與本研究結果不一致。李冬杰等認為，不同濃度NAA和IAA對冬凌草葉片褐化程度的影響較小[10]。何松林等發(fā)現(xiàn)，在牡丹葉柄離體培養(yǎng)過程中，生長調節(jié)物質BA和NAA的濃度變化對褐變現(xiàn)象沒有明顯影響[11]。以上2個研究結果與本試驗結果一致。陳正華等認為，不同外植體材料和同一種材料的不同品種對不同激素種類和濃度引起的褐化程度不同，部分品種的蝴蝶蘭PLB因激素濃度引起的褐化現(xiàn)象與其組織狀態(tài)和病變激活酚氧化酶有關[12-13]。

在凝膠劑處理中，本試驗創(chuàng)新地使用玉米粉作為凝膠試劑，獲得了顆粒飽滿、顏色翠綠、分化率高的類原球莖。玉米粉含有亞油酸、谷固醇、維生素、卵磷脂和蛋白質等營養(yǎng)物質，為PLB提供了必要的營養(yǎng)成分，有利于PLB的生長發(fā)育。此外，玉米粉中含有有豐富的抗氧化劑谷胱甘肽，可減少類原球莖褐化現(xiàn)象。以上2點與本試驗中觀察發(fā)現(xiàn)的一致。玉米粉作為凝膠劑時，PLB的褐化率明顯低，且PLB分化數(shù)量上升。

在蔗糖濃度處理中，蔗糖濃度對蝴蝶蘭類原球莖褐化有影響。陳勇等認為，蔗糖濃度為1%和2%時，類原球莖分化率為100%;當蔗糖濃度上升至3%～5%時，類原球莖增殖分化均受到抑制，且褐化程度顯著上升[14]。張和等認為，含有30 g/L蔗糖的MS培養(yǎng)基比含有15 g/L蔗糖的MS培養(yǎng)基更容易引起蝴蝶蘭類原球莖褐化現(xiàn)象[9]。周俊輝等認為，植物離體培養(yǎng)中，高濃度蔗糖更容易引起褐化現(xiàn)象[15]。本試驗結論與上述研究結果一致，且發(fā)現(xiàn)培養(yǎng)基中添加15 g/L蔗糖為最佳選擇。有研究認為，蔗糖濃度越高，越容易激起酚氧化酶的活性，增加外植體酚類物質含量，從而加重了褐化現(xiàn)象[7]。

在吸附劑處理中，活性炭的效果最佳。有研究認為，活性炭表面大量的多孔結構提供了極大空間，非常容易吸附周邊物質，故在培養(yǎng)基中能吸收大量分泌出來的酚類物質，減少褐化現(xiàn)象。但是研究表明，活性炭不僅能吸收引起褐化的酚類物質，同時也會吸收培養(yǎng)基中的營養(yǎng)物質，因此濃度不宜過大。本試驗中采用1 g/L的活性炭，觀察發(fā)現(xiàn)類原球莖長勢良好且褐化現(xiàn)象較輕。

本試驗表明，光照對蝴蝶蘭PLB的褐化現(xiàn)象有一定的影響，接種后暗培養(yǎng)1個星期左右，可有效防止褐化現(xiàn)象，同時有利于PLB增殖與分化。趙伶俐等發(fā)現(xiàn)，以黑暗預處理 5 d 的PLB團塊褐變最輕[16]。蓋瓊輝將楸子當年生新枝上 1～3 cm 帶芽莖段放在4 ℃環(huán)境下暗培養(yǎng)5 d，能有效降低褐變現(xiàn)象[4]。陳菲等發(fā)現(xiàn)，對母株進行遮光處理，能降低部分品種的褐化現(xiàn)象[17]?？梢姡庹帐怯绊懲庵搀w褐化程度的重要因素之一，普遍存在于大多數(shù)外植體材料組培過程中。Hong等認為，光照會促進多酚氧化酶的活性，從而增加被氧化的酚類物質，引起大面積褐化現(xiàn)象[18]。

在抗氧化劑處理中，硝酸銀抑制褐化的效果最明顯，且有促進PLB分化的作用。有研究表明，外植體受到創(chuàng)傷后，創(chuàng)傷部位的細胞會產(chǎn)生大量用來保護自身的乙烯，而乙烯對細胞分化和器官形成具有抑制作用。AgNO3是乙烯合成抑制劑，可有效降低快繁中乙烯的形成和堆積，促進材料生長和不定芽分化[19-20]。因此，在培養(yǎng)基中添加AgNO3可促進器官發(fā)生，增加外植體產(chǎn)生不定芽的數(shù)量，實現(xiàn)完整植株的再生[21-22]。這一結論在許多單子葉和雙子葉植物上都得到了證明和應用[6，20，23-25]。賀苗苗認為20 mg/L硝酸銀能有效誘導出馬鈴薯花藥愈傷組織，同時，褐化現(xiàn)象明顯減少[26]。王文星等認為，5 mg/L硝酸銀對煙草愈傷組織芽再生的促進作用最佳，同時有效抑制褐化現(xiàn)象[22]。本研究中也觀察到，硝酸銀處理對蝴蝶蘭PLB防褐變有明顯的效果，同時還能保持較高的PLB增殖和分化水平。

本試驗發(fā)現(xiàn)，當PLB大小為1 cm×1 cm以上時能有效防止褐化現(xiàn)象。Chyuam-Yih等認為，當PLB團塊體積越小時，傷口面積越大，傷口表面釋放出的酚類物質和酚氧化酶就越多，接觸空氣后發(fā)生氧化反應，形成醌類物質，最終造成褐變現(xiàn)象[27]。這一結論與本試驗中觀察到的現(xiàn)象一致。因此，在蝴蝶蘭PLB繼代培養(yǎng)過程中應盡量減少切割面積。培養(yǎng)材料轉接時應將傷口充分接觸到培養(yǎng)基，使培養(yǎng)基中的吸附劑和抗氧化劑發(fā)揮作用，減少醌類物質或氧化反應。

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