何玲玲，林 棟，游世晶，陳采益

（福建中醫(yī)藥大學針灸學院，福建 福州 350122）

課題組前期研究表明針刺大鼠外關穴能特異性地促進磷酸化環(huán)磷腺苷反應元件結合蛋白（p-CREB）的表達，不論在小腦或皮質(zhì)扣帶回，針刺穴位組的p-CREB的較非穴組表達均明顯增強［1］。同時，針刺干預外關單穴可上調(diào)炎性痛大鼠皮質(zhì)扣帶回、海馬腦區(qū)Bcl-2表達［2］。因此，本項目組在基于經(jīng)穴及循經(jīng)取穴（單穴）特異性研究的基礎上，進一步觀察針刺外關單穴與其腧穴配伍對炎性痛大鼠痛閾及血清炎性因子 P物質(zhì)（substance P，SP）、前列腺素 E2（PGE2）、白細胞介素-1β（IL-1β）含量的影響，進而探討單穴與腧穴配伍鎮(zhèn)痛效應及相關神經(jīng)-體液-免疫機制，為經(jīng)穴配伍應用提供實驗依據(jù)。

1 實驗材料

1.1 實驗動物 清潔級雄性SD大鼠40只，體質(zhì)量（300±50）g，由福建中醫(yī)藥大學實驗動物中心提供，許可證號：SYXK（閩）2014-0005。 自由飲食，飼養(yǎng)環(huán)境為12 h～12 h晝夜節(jié)律變換，室溫控制在18～24℃，濕度控制在50%～70%。

1.2 實驗試劑 大鼠前列腺素SP酶聯(lián)免疫檢測試劑盒、大鼠前列腺素E2酶聯(lián)免疫檢測試劑盒、大鼠白細胞介素-1β酶聯(lián)免疫檢測試劑盒（上海西唐生物科技有限公司）。

1.3 實驗儀器 ZH-LUO／B鼠尾測痛儀（安徽省淮北正華生物儀器設備有限公司）；一次性無菌針灸針（蘇州醫(yī)療用品廠）；TGL-168高速冷凍離心機（上海安亭科學儀器廠）；DENLEY DRAGON Wellscan MK 3酶標儀（芬蘭Thermo公司）；數(shù)字顯示隔水式電熱恒溫培養(yǎng)箱（上海躍進醫(yī)療器械廠）。

2 實驗方法

2.1 實驗分組 適應性飼養(yǎng)1周后按隨機數(shù)字表法將大鼠分為模型組、外關組、外關配伍合谷組和外關配伍合谷、后溪組，每組各10只。所有實驗對動物的處理符合國際疼痛研究會制定的準則。

2.2 模型制作 實驗人員用黑布罩住大鼠頭部，采用微量進樣器于大鼠右前肢外側肘節(jié)穴（定位參照《實驗針灸學》三版教材中的大鼠的穴位圖譜：肘突與臂骨外上髁間的凹陷中，相當于人體手少陽經(jīng)天井穴）快速進針，并循經(jīng)朝上注入1～2 mm相當于“清冷淵”穴區(qū)注射5%甲醛50 μL，觀察動物形態(tài)學和行為學變化，動物注射后出現(xiàn)患肢紅腫、抖動、縮肢等，示造模成功。采用鼠尾測痛儀測出疼痛閾值并記錄。

2.3 穴位選擇 外關穴取穴參照大鼠的穴位圖譜：位于腕關節(jié)上3 mm（近心端），尺、橈骨間，在指總伸肌與指側伸肌之間取穴；合谷穴：于前肢第一、第二掌骨之間；后溪穴：于第五掌骨小頭后方掌橫紋頭。針具選用華佗牌0.5寸針灸針（0.25 mm×13 mm），采用單手進針法斜刺（指向炎性病灶區(qū)），深度 4～6 mm，留針20 min，間隔 5 min行針 1次（捻轉幅度 90°～180°，捻轉頻率 60～90 次 ／min）。模型組：造模成功后予模擬抓取動作，不予針刺干預。其余4組分別選取相應的穴位組合進行針刺干預，每日1次，干預6次。

2.4 取材處理 完成實驗干預后，采用10%水合氯醛按2 mL／kg體質(zhì)量進行麻醉，經(jīng)腹主動脈取血4 mL，室溫下血液自然凝固10～20 min后，冷凍離心機 4 ℃、3 000 r／min下離心 20 min，取上清液，置于-80℃冰箱中保存待測。

2.5 觀察指標及方法

2.5.1 鼠甩尾潛伏期測定 上述造模成功后，在實驗干預前后測定大鼠甩尾潛伏期。將ZH-LUO／B鼠尾測痛儀連接電源，設置溫度參數(shù)值40℃，將大鼠距尾根部2～3 cm的位置擺放在光源中。同時記錄光源點亮至大鼠甩尾時間數(shù)據(jù)，當熱痛覺達到大鼠的熱痛閾后，可引發(fā)大鼠甩尾反射，從照射開始至甩尾反應發(fā)生即為大鼠甩尾潛伏期。造模后各組大鼠在實驗干預前后測定，每次測3次取平均值，即為平均熱痛閾值。

2.5.2 酶聯(lián)免疫吸附檢測法測定 按試劑盒說明書檢測炎性痛大鼠血清SP、PGE2、IL-1β含量。用一抗包被微孔板并制成固相抗體，并向包被單抗的微孔中加入標準品、血清樣品、辣根過氧化物酶標記檢測抗體，溫育30 min；洗板6次后加入酶標試劑100 μL溫育30 min；洗板6次后，加入顯色液A、B 各 100 μL 顯色 30 min；加終止液 100 μL；30 min內(nèi)用酶標儀在450 nm處測量吸光度，計算血清標本中 SP、PGE2、IL-1β 濃度。

2.6 統(tǒng)計學方法 采用SPSS 22.0統(tǒng)計軟件分析數(shù)據(jù)。計量資料符合正態(tài)分布以（）表示，2組間比較采用t檢驗；多組間比較采用單因素方差分析，其中方差齊采用LSD（L）分析，方差不齊采用Games-Howell分析。

3 結 果

3.1 4組干預前后平均鼠甩尾潛伏期時間比較 見表1。

表1 4組干預前后平均鼠甩尾潛伏期時間比較（）s

表1 4組干預前后平均鼠甩尾潛伏期時間比較（）s

注：與干預前比較，1） P＜0.05；與模型組比較，2） P＜0.05。

組別模型組外關組外關加合谷組外關加合谷、后溪組干預前7.99±1.28 7.23±1.54 6.93±1.82 7.11±0.97干預后7.89±1.26 9.88±2.521）2）9.63±1.941）2）8.60±0.731）n 10 10 10 10

3.2 4組大鼠血清SP、PGE2、IL-1β水平比較 見表2。

表 2 4 組大鼠血清 SP、PGE2、IL-1β 水平比較（）pg／mL

表 2 4 組大鼠血清 SP、PGE2、IL-1β 水平比較（）pg／mL

注：與模型組比較，1） P＜0.05。

組別模型組外關組外關加合谷組外關加合谷、后溪組SP 9.50±1.58 3.35±1.931）3.92±3.761）5.59±7.46 IL-1β 23.48±3.66 13.67±8.461）12.15±6.891）14.44±11.18 PGE2 765.72±340.51 385.94±238.781）400.53±180.331）642.14±287.92

4 討 論

近年來，神經(jīng)-體液-免疫調(diào)節(jié)因在炎性痛中發(fā)揮多靶向、多水平的復雜關聯(lián)作用而受到研究者的關注。SP是一種存在于初級傳入神經(jīng)元的重要神經(jīng)肽，其既可傳遞傷害性信息到脊髓，也能調(diào)節(jié)外周炎癥［3-4］。SP可作用于炎性白細胞上的特異性神經(jīng)激肽受體，并參與B細胞免疫球蛋白合成。研究表明SP可通過MrgprB2／MrgprX2受體參與肥大細胞脫顆粒，參與調(diào)節(jié)組織損傷所致的疼痛、免疫細胞浸潤和腫脹［5］。 前列腺素（prostaglandin，PG）是不飽和脂肪酸的衍生物，具有多種生理作用的生物活性物質(zhì)。當細胞膜受到刺激時，機體會產(chǎn)生并釋放PG。PG因其不同結構及功能被分為A～I 9種類型，其中PGE2是致痛性最強的炎癥反應介質(zhì)，與疼痛密切相關。作為白細胞介素-1（IL-1）家族的成員之一，由活化的單核／巨噬細胞產(chǎn)生的IL-1β在免疫應答及炎癥反應中起重要作用［6］。大量臨床及實驗研究表明，針刺可通過調(diào)整機體SP、PGE2及IL-1β水平發(fā)揮鎮(zhèn)痛作用［7-12］。

《素問·調(diào)經(jīng)論》記載曰：“病在筋，調(diào)之筋，病在骨，調(diào)之骨”。手三陽筋經(jīng)上肢部循行在《靈樞·經(jīng)筋》載曰：“手陽明之筋……上循臂，上結于肘外，上臑，結于肩髃”“手太陽之筋……上循臂內(nèi)廉，結于肘內(nèi)銳骨之后，彈之應小指之上”“手少陽經(jīng)之筋……上循臂，結于肘；上繞臑外廉”。因此，手三陽筋經(jīng)與肘外、肘內(nèi)銳骨、肘上等部位密切相關。本研究引入的肢體炎性疼痛模型屬于筋經(jīng)病范疇，臨床常根據(jù)病變部位采用局部取穴，并根據(jù)辨筋（經(jīng)）取穴原則配合鄰近或遠端腧穴進行治療。以腰痛取穴為例，經(jīng)數(shù)據(jù)分析研究表明其取穴配伍主要以局部與遠端配穴為主，且注重循經(jīng)選穴及特定穴的應用［13］。有頸椎病臨床取穴配伍研究表明，不同腧穴配伍的針刺治療均可改善頸部前屈的耐疲勞性，其針刺效應與取穴數(shù)目的多少無關［14］。腧穴配伍選穴思路相關研究表明，選穴是研究影響腧穴配伍效應的首要任務［15］，腧穴配伍選穴思路應以癥狀及同功穴為切入點，同時結合臨床具體病因病機、歸經(jīng)、病位及病性而決定主穴及配穴［16］。另有研究表明腧穴配伍研究不能簡單認為基于兩個或兩個以上的腧穴配合應用，而需基于一定選穴原則及臨床應用進行研究，優(yōu)選配伍可協(xié)同增效，而無效的穴位配伍不但不能起上述作用，甚者可能會影響單穴本身功能的發(fā)揮［17］。

辨經(jīng)取穴作為針刺選穴的經(jīng)典原則，在臨床上被廣泛應用于筋經(jīng)病的治療。目前，在筋經(jīng)病取穴配伍研究中多以臨床療效及基于數(shù)據(jù)挖掘技術研究為主［18-23］，較少開展相關動物實驗進行機制分析。同時，在選穴配伍方面，尚缺乏比較循經(jīng)選取單穴與其配合之間的效應差異。本研究結果顯示外關組、外關加合谷組與外關加合谷、后溪組3組在干預后均可提高炎性痛大鼠自身痛閾。與模型組比較，外關組、外關加合谷組可提高大鼠痛閾值，并降低血清中炎性因子 SP、PGE2、IL-1β 含量（P＜0.05），單穴與其配伍組間差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。由此可知，基于辨經(jīng)取穴的穴位組合配伍對炎性疼痛鎮(zhèn)痛作用并不優(yōu)于其單穴應用，其機制有待進一步研究。