潘 紅，羅斌漢，趙睿明，曾曼溢，孫雨琪，羅千慧，候俊達(dá)，蔡葵蒸

（西北民族大學(xué) 生命科學(xué)與工程學(xué)院，甘肅 蘭州 730030）

家畜寄生蟲病是危害我國(guó)畜牧業(yè)經(jīng)濟(jì)生產(chǎn)效益的主要因素之一。目前，人們對(duì)家畜寄生蟲病危害的處理方式主要依賴于藥物防治，并相繼研發(fā)了一系列高效、廣譜、低毒的驅(qū)蟲藥，這對(duì)家畜寄生蟲病的防控發(fā)揮了重要作用。但隨著驅(qū)蟲藥的長(zhǎng)期使用，導(dǎo)致寄生蟲對(duì)藥物產(chǎn)生了耐藥性[1,2]。長(zhǎng)期使用藥物不僅會(huì)導(dǎo)致家畜體弱消瘦，而且家畜體內(nèi)殘留的藥物還會(huì)給人們的身體健康帶來(lái)安全隱患，藥物殘留也會(huì)對(duì)環(huán)境造成一定的污染。所以，生物防控成為了未來(lái)寄生蟲病防治的主要研究方向[3,4]。研究發(fā)現(xiàn)，土壤中含有多種捕食性線蟲真菌，可以通過(guò)形成特殊的菌絲結(jié)構(gòu)來(lái)感染線蟲，篩選和利用這些真菌作為植物和動(dòng)物寄生線蟲的生物防治劑，具有廣闊的應(yīng)用前景，其中少孢節(jié)叢孢（A.oligospora）是自然界最為常見而且目前最為廣泛和深入研究的一種捕食性線蟲真菌[5-8]。本研究的目的是進(jìn)一步探討該菌通過(guò)消化道后對(duì)體內(nèi)幼蟲的捕殺效果，為今后利用這種捕食性真菌開展動(dòng)物寄生線蟲病的生物防治提供依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 菌種

少孢節(jié)叢孢 (A. oligospora)，分離株編號(hào)為F35、F88和F79，這3株菌均來(lái)自西北民族大學(xué)蔡葵蒸教授課題組，菌株在4 ℃下2%玉米粉瓊脂斜面培養(yǎng)基保存。

1.2 培養(yǎng)基及其制備

本研究使用的培養(yǎng)基主要為水瓊脂培養(yǎng)基（WA），麩皮瓊脂培養(yǎng)基（WSA），液體培養(yǎng)基，產(chǎn)孢培養(yǎng)基。

水瓊脂培養(yǎng)基（WA）：按照2%的濃度將瓊脂粉加入到水中，高壓滅菌后在超凈工作臺(tái)內(nèi)倒制平板。

麩皮瓊脂培養(yǎng)基（WBA）：4%麩皮原液的制備：稱量40 g麩皮，量取1 000 ml水，加熱保持微沸一小時(shí)并不斷攪拌。八層紗布過(guò)濾后，置于2 000 ml量筒用保鮮膜密封（量筒里的水加至1 000 ml），6 ℃冰箱靜置10 h，吸取上清液，稀釋至所需濃度，再加入2%的瓊脂粉。高壓滅菌后，在超凈工作臺(tái)內(nèi)倒制平板。

液體培養(yǎng)基：按照上述方法制備濃度為4%的麩皮原液，稀釋至2%。每個(gè)錐形瓶加入80 ml稀釋好的2%麩皮原液，高壓滅菌121 ℃，20 min即可。

產(chǎn)孢培養(yǎng)基：糧食培養(yǎng)基的總重量為60 g，主要成分是玉米和小麥，其比例是2：1，按照比例稱取小麥和玉米放入250 ml錐形瓶加入1 g/L KH2PO4，0.5 g/L MgSO4以及適量的蒸餾水，糧食與蒸餾水的比例是1.5：1，用硅膠塞蓋住并用牛皮紙將其瓶口包好，整體放入高壓鍋內(nèi)，溫度設(shè)置為121 ℃，時(shí)間為30 min進(jìn)行高壓蒸汽滅菌即可。

1.3 菌種的擴(kuò)繁和分生孢子的生產(chǎn)

在超凈工作臺(tái)內(nèi)，將2%玉米粉瓊脂斜面培養(yǎng)基保存的菌株在無(wú)菌條件下用接種環(huán)挑出少量菌絲體連同培養(yǎng)基，接種在WA培養(yǎng)基中央，置于28 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)一星期左右。若WBA平板培養(yǎng)基中接種的真菌生長(zhǎng)良好，則可以在超凈工作臺(tái)內(nèi)將已培養(yǎng)好的真菌用滅菌的手術(shù)刀切下5 mm×5 mm大小的布滿菌絲的瓊脂塊接種到液體培養(yǎng)基中，每瓶5塊，放置在轉(zhuǎn)速為160 r/ min，溫度為28 ℃的搖床中培養(yǎng)5～7 d后，在超凈工作臺(tái)內(nèi)使用震蕩儀上震蕩5 min，取3 ml菌液接種到產(chǎn)孢培養(yǎng)基，置于28 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)1個(gè)月后用0.05%（w）Twain-80水溶液清洗長(zhǎng)有真菌的玉米粒，將清洗過(guò)糧食的吐溫用兩層紗布過(guò)濾，得到含有孢子的過(guò)濾液，稀釋濃度至5×105個(gè)/ ml。

1.4 試驗(yàn)動(dòng)物

用左旋咪唑，對(duì)三月齡綿羊進(jìn)行驅(qū)蟲，21 d后，直腸取糞進(jìn)行蟲卵檢查，以判斷體內(nèi)寄生蟲是否驅(qū)除干凈。如檢查合格，使用注射器，將已準(zhǔn)備好的8 000條捻轉(zhuǎn)血矛線蟲的三期幼蟲灌入綿羊胃內(nèi)，21 d后收集糞便，再次進(jìn)行蟲卵檢查，以確認(rèn)線蟲是否接種成功。收集糞便于白瓷盤中弄碎，置于25 ℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)7 d，期間定期攪拌并保持濕度，7 d后將攪拌均勻的糞便頂置于白瓷盤的蓋子上，第二天將蓋子上的蟲液用蒸餾水沖下，收集于燒杯中，然后通過(guò)貝爾曼法將蟲液中的糞渣除去，最后收集于細(xì)胞瓶中備用。

1.5 體內(nèi)試驗(yàn)

將一定濃度的孢子液給綿羊灌服，灌服后套上糞袋收集糞便，將真菌灌服后24 h內(nèi)收集的糞便記為t1，48 h后收集的糞便記為t2，7 d后收集的糞便記為t3，根據(jù)Cai等[9]的工作顯示真菌在灌服120 h（±1）后孢子不太可能仍然存在，因此t1和t3采集的樣品能夠用作t2的樣品的未處理對(duì)照。這允許每只動(dòng)物作為試驗(yàn)的實(shí)驗(yàn)單位。在每次取樣時(shí)，為每只動(dòng)物的糞便培養(yǎng)物制備3個(gè)重復(fù)。

將每次收集的糞便搗碎后稱取10 g放入小平皿，加入少量水進(jìn)行攪拌，將小平皿放入大平皿中，在大平皿中加入適量的水以保持濕度，最后放入26 ℃溫箱培養(yǎng)兩周，期間每隔三天進(jìn)行一次攪拌并添加適量水分保持濕度，兩周后進(jìn)行幼蟲計(jì)數(shù)。

通過(guò)貝爾曼漏斗法分離幼蟲，并按Cai等[9]的方法計(jì)算L3百分減少率。

1.6 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

計(jì)算公式中每組均有三個(gè)平行組，t1和t3作為對(duì)照組，t2則為實(shí)驗(yàn)組，從而計(jì)算出體內(nèi)殺蟲率。然后通過(guò)spss軟件對(duì)幼蟲減少率使用t檢驗(yàn)顯著性方差分析。

2 結(jié)果

從表1中可以看出灌服F35的糞便不同時(shí)期的糞便中L3數(shù)量差距均較大，而另外兩株菌的不同時(shí)期糞便中L3差距不是很明顯，尤其是F79三個(gè)時(shí)期差距都不大。

圖1顯示了3株A. oligospora對(duì)綿羊胃腸消化道線蟲捻轉(zhuǎn)血矛線蟲L3的捕殺效果。結(jié)果顯示，有2株少孢節(jié)叢孢菌株（F88，F(xiàn)79）在灌服后可以通過(guò)綿羊消化道，并對(duì)L3的捕殺效果差異顯著，一株（F35）不顯著，通過(guò)綿羊消化道后對(duì)糞便中三期幼蟲的捕殺率分別為46.00%, 99.47%, 17.84%。

圖1 三株少孢節(jié)叢孢通過(guò)綿羊消化道后對(duì)糞便中L3的捕殺率

3 討論

本試驗(yàn)通過(guò)對(duì)3株A. oligospora通過(guò)綿羊消化道能力的試驗(yàn)，結(jié)果表明，F(xiàn)88和F79的兩個(gè)分離株對(duì)綿羊體內(nèi)三期幼蟲的捕食能力較弱，均低于50%，其中F79可以判定為無(wú)效，而F35使三期幼蟲的發(fā)育減少了99.47%，具有顯著的殺蟲效果。在不考慮灌服不準(zhǔn)確等人為誤差外，分析其可能的原因與菌株自身差異有關(guān)，根據(jù)之前對(duì)A. oligospora體內(nèi)外殺蟲實(shí)驗(yàn)的報(bào)道[9]，該菌通過(guò)綿羊消化道的能力與D. flagrans相比很不穩(wěn)定，不同地理分布的菌株的少孢節(jié)叢孢通過(guò)消化道的能力不同，而生存能力強(qiáng)的少孢節(jié)叢孢在通過(guò)綿羊消化道后仍能保持較強(qiáng)的捕食能力，明顯的減少L3的發(fā)育。此外，根據(jù)一些研究報(bào)道[9,10]，不同生長(zhǎng)階段的A. oligospora對(duì)不良環(huán)境的抵抗力存在差距，A. oligospora的營(yíng)養(yǎng)菌絲對(duì)動(dòng)物消化道的耐受力不如分生孢子強(qiáng)，故所灌服A. oligospora分離株產(chǎn)孢能力的大小也會(huì)對(duì)試驗(yàn)結(jié)果造成一定的影響。

通過(guò)分離株通過(guò)動(dòng)物消化道的篩選實(shí)驗(yàn)，A. oligospora的一些菌株具有通過(guò)綿羊消化道的能力，其中個(gè)別菌株還能保持較高的捕食效果，這也證實(shí)了捕食線蟲性真菌A. oligospora在臨床應(yīng)用方面的價(jià)值和發(fā)展?jié)摿?，尤其是?duì)消化道有較強(qiáng)耐受力的菌株，有望成為一種潛在的飼料添加劑應(yīng)用到實(shí)際生物防治中。

表1 三株少孢節(jié)叢孢通過(guò)綿羊消化道后從糞便中獲得的L3數(shù)量